Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר במענקי NCI R01 CA216248, CA206458 ו- CA179556 למימון עבודה זו. אנו רוצים גם להודות לד"ר קווין אליסירי ולקבוצת ההדמיה שלו על המומחיות הטכנית שלהם בפיתוח המוקדם של התוכנית התוך-לוויתית שלנו. אנו מודים גם לד"ר בן קוקס ולחברים אחרים בקבוצת הייצור של אליסירי במכון מורגרידג' למחקר על התכנון הטכני החיוני שלהם בשלבים המוקדמים של ה-MIW. ד"ר אלן דובסון סייע בשיחות שימושיות על כלי הפילוח של WeKA הניתן לאימון של ImageJ. בנוסף, ברצוננו להודות לד"ר מליסה סקאלה ולד"ר אלכסה בארס-היטון על השימוש בזמן במיקרוסקופ שלהן. לבסוף, ברצוננו להודות לד"ר בריג'יט ראבה, D.V.M, על כל הדיונים והעצות המהורהרות על הטיפול והטיפול בעכברים שלנו.

כל הניסויים שתוארו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. הרווחה וניהול הכאב בכל הניסויים בבעלי חיים הם בעלי חשיבות עליונה. לפיכך, נעשה כל מאמץ כדי לוודא שבעל החיים נוח ומטופל היטב בכל שלב של ההליך.
1. יצירת חלון הדמיה של יונק?...

הדמיה תוך-ורידית 4D היא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות פיזיולוגיות דינמיות בהקשר המרחבי והזמני של המיקרו-סביבה של הגידול הטבעי. כתב יד זה מספק מסגרת תפעולית בסיסית מאוד וניתנת להתאמה כדי למדר אינטראקציות של תאים דינמיים בתוך מסת הגידול, הסטרומה הסמוכה, או בסמיכות לרשת כלי הדם באמצעות אותות ...

המטריצה החוץ-תאית (ECM) במיקרו-סביבה של הגידול ידועה כמי שהופקדה באופן דינמי ושופצה על ידי סוגי תאים מרובים כדי להקל עוד יותר על התקדמות המחלה 1,2,3. שינויי מטריצה אלה מספקים רמזים מכניים וביולוגיים המשנים את התנהגות התאים ולעתים קרובות גורמים למחזור מתמשך של שיפוץ מטריצה4. חקירת יחסי הגומלין הדינמיים וההדדיים בין תאי הגידול לבין המטריצה החוץ-תאית מתבצעת לעתים קרובות באמצעות תרבית מבחנה תלת-ממדית (תלת-ממדית) או מערכות מיקרופלואידיות. בעוד שגישות אלה מלמטה למעלה הדגימו מנגנונים של שיפוץ ECM 5,6,7, התפשטות מוגברת8, מעבר אפיתל למזנכימלי 9,10,11,12, והגירה ופלישה של תאי גידול 7,13,14,15,16 ההתמקדות שלהם הייתה בעיקר בכמה סוגי תאים (למשל, תאי גידול או פיברובלסטים) בתוך מטריצה תלת-ממדית הומוגנית בהשוואה למגוון ולהטרוגניות של אינטראקציות הקיימות בתוך רקמה פיזיולוגית., בנוסף למערכות in vitro, היסטולוגיה של גידולי ex vivo יכולה גם לספק כמה תובנות לגבי האינטראקציות האלה בין תאים לתאים ותאים-ECM17. לאימונוהיסטוכימיה יש יתרון בכך שהיא מסוגלת לנתח סוגי תאים מרובים ביחס להרכב ההטרוגני המרחבי ולארכיטקטורה של ה-ECM, אך נקודות הקצה הסטטיות של רקמות קבועות אינן לוכדות את האופי הדינמי של אינטראקציות בין תאים לבין המיקרו-סביבה. הדמיה תוך-ורידית פתחה את הדלת לחקור אינטראקציות מגוונות ודינמיות בהקשר הפיזיולוגי של המיקרו-סביבה הטבעית של הגידול.
היכולות של הדמיית גידולים תוך-ורידיים מתקדמות במהירות. שיפורים בתכנון חלונות הדמיה וטכניקות כירורגיות להשתלת החלונות אפשרו הדמיה ארוכת טווח של גידולים אורכיים במגוון מקומות אנטומיים (כלומר, גידול ראשוני, בלוטות לימפה, אתרים גרורתיים 18,19,20). יתר על כן, היכולת של מכשור אופטי להמחיש ולאסוף נתונים בממדים מרובים (כלומר, ספקטרלי, עוצמת פלואורסצנציה מרחבית ואורך חיים), וברזולוציה ובמהירות גבוהה (קצב וידאו) הופכת לנגישה באופן נרחב. הטכנולוגיה המשופרת מספקת הזדמנות לחקור שינויים מהירים באיתות תאי ובדינמיקה פנוטיפית בתוך סביבה פיזיולוגית. לבסוף, הרחבת הכלים האופטוגנטיים והמגוון הרחב של מבנים פלואורסצנטיים גנטיים מאפשרים תיוג של סוגי תאים ספציפיים כדי ללכוד את נדידת התאים במיקרו-סביבה של הגידול או במעקב אחר שושלת התאים במהלך ההתפתחות או התקדמות המחלה21,22. השימוש בכלים אלה בשילוב עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מספק לחוקרים את ההזדמנות ליצור מודלים ייחודיים של בעלי חיים בזמן.
בעוד שכל ההתקדמות הזו הופכת את ההדמיה התוך-לוויתנית לשיטה רבת עוצמה יותר ויותר לחקר אינטראקציות תאיות דינמיות ופיזיולוגיות, עדיין יש צורך חשוב לפתח אסטרטגיות המספקות הקשר מרחבי, זמני ומבנה ברמת הרקמה לאינטראקציות ביולוגיות אלה. נכון לעכשיו, מחקרי הדמיה תוך-ורידיים רבים מפצים על היעדר ציוני דרך חזותיים כגון כלי דם על ידי הזרקת צבעים פלואורסצנטיים לתוך כלי הדם או שימוש במודלים של עכברים המבטאים באופן אקסוגני חלבונים פלואורסצנטיים כדי להגדיר תכונות פיזיות. צבעים ומצעים הניתנים להזרקה כמו דקסטרנים פלואורסצנטיים נמצאים בשימוש נרחב כדי לתייג בהצלחה את כלי הדם באוספים תוך-ויטליים19, 23, 24. עם זאת, גישה זו אינה נטולת מגבלות. ראשית, היא דורשת מניפולציות נוספות בעכברים והתועלת שלה מוגבלת לניסויים קצרי טווח. עבור מחקרי אורך, דקסטרן פלואורסצנטי יכול להיות בעייתי כאשר אנו צופים בהצטברות של דקסטרן בתאים פאגוציטיים או דיפוזיה לתוך הרקמה הסובבת לאורך זמן25. שילוב חלבון פלואורסצנטי אקסוגני במודל העכבר הוצג כחלופה לדקסטרנים פלואורסצנטיים, אך מציג מגבלות משלו. הזמינות והמגוון של פלואורופורים אקסוגניים בתוך דגמי עכברים עדיין מוגבלים ויקרים ליצירה. בנוסף, במודלים ספציפיים, כגון מודלים של PDX, מניפולציות גנטיות אינן רצויות או אפשריות. כמו כן, הוכח כי נוכחותם של חלבונים פלואורסצנטיים או ביולומינסצנטיים בתוך התאים מוכרת כזרה בתוך העכבר, ובתוך מודלים של עכברים מדוכאי חיסון, הדבר מפחית את כמות הגרורות עקב התגובה של מערכת החיסון המארחת26,27. לבסוף, חלבונים פלואורסצנטיים אקסוגניים או צבעים פלואורסצנטיים המשמשים להקשר מרחבי או לפלח נתונים מאוחרים יותר תופסים לעתים קרובות טווחים ראשוניים של ספקטרום האור, שאחרת ניתן היה להשתמש בהם כדי לחקור את האינטראקציות הפיזיולוגיות המעניינות.
השימוש באות הפנימי מה-ECM או פלואורסצנציה אנדוגנית מתאים בתוך הרקמה מייצג אמצעי אוניברסלי פוטנציאלי ללא תוויות לפלח נתונים תוך-תאיים לצורך ניתוח תאי ומרחבי מעמיק יותר. הדור ההרמוני השני (SHG) שימש זה מכבר להדמיית ה-ECM28. עם התפתחותם של כלים חשובים שיסייעו באפיון ארגון הסיבים 29,30,31, ניתן לאפיין את התנהגות התא ביחס למבנה ECM המקומי. בנוסף, אוטופלואורסצנציה מהמטבוליט האנדוגני, NAD(P)H, מספקת כלי נוסף ללא תווית למידור המיקרו-סביבה של הגידול in vivo. NAD(P)H פלואורסצנטי בבהירות בתאי הגידול וניתן להשתמש בו כדי להבחין בין גבולות קן הגידול הגדל לבין הסטרומה הסובבת אותו21,32. לבסוף, כלי הדם הוא מבנה פיזיולוגי חשוב במיקרו-סביבה של הגידול ובאתר של אינטראקציות מפתח ספציפיות לסוג התא 33,34,35. עירור של תאי דם אדומים (RBC) או פלזמת דם שימש כדי לדמיין את כלי הדם של הגידול, ובאמצעות עירור של שניים או שלושה פוטונים (2P; 3P) מדידת קצב זרימת הדם הוכחה כאפשרית36. עם זאת, בעוד שכלי דם גדולים יותר ניתנים לזיהוי בקלות על ידי חתימות הפלואורסצנטיות האנדוגניות שלהם, זיהוי של כלי דם קטנים עדינים, משתנים ופחות פלואורסצנטיים דורש מומחיות רבה יותר. קשיים מובנים אלה מעכבים פילוח תמונה אופטימלי. למרבה המזל, ניתן למדוד את המקורות הללו של פלואורסצנציה אנדוגנית (כלומר, תאי דם אדומים ופלסמה בדם) גם על ידי הדמיה פלואורסצנטיתלכל החיים 37, המנצלת את התכונות הפוטופיזיות הייחודיות של כלי הדם ומייצגת תוספת שימושית לארגז הכלים התוך-ורידי ההולך וגדל.
בפרוטוקול זה מתוארת זרימת עבודה לסגמנטציה של הדמיה תוך-לוויטלית ארבע-ממדית (4D) המשתמשת במפורש באותות פנימיים כמו פלואורסצנציה אנדוגנית ו-SHG מרכישה ועד ניתוח. פרוטוקול זה רלוונטי במיוחד למחקרי אורך דרך חלון הדמיה של יונקים שבו פלואורסצנציה אקסוגנית עשויה להיות לא מעשית או אפשרית, כמו במקרה של מודלים של PDX. עם זאת, עקרונות הסגמנטציה המתוארים כאן ישימים באופן נרחב למשתמשים תוך-ורידיים החוקרים ביולוגיה של גידולים, התפתחות רקמות או אפילו פיזיולוגיה של רקמות תקינה. החבילה המדווחת של גישות הניתוח תאפשר למשתמשים להבדיל התנהגות תאית בין אזורים של תצורות סיבי קולגן מיושרות או אקראיות, להשוות מספרים או התנהגויות של תאים השוכנים באזורים ספציפיים של המיקרו-סביבה של הגידול, ולמפות את כלי הדם למיקרו-סביבה של הגידול באמצעות אות נטול תוויות או פנימי בלבד. יחד, שיטות אלה יוצרות מסגרת תפעולית למקסום עומק המידע המתקבל מהדמיה תוך-ורידית 4D של בלוטת החלב תוך מזעור הצורך בתוויות אקסוגניות נוספות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

היכולת לדמיין אינטראקציות פיזיולוגיות מורכבות ודינמיות בין סוגי תאים רבים לבין המטריצה החוץ-תאית (ECM) בתוך מיקרו-סביבה של גידול חי היא צעד חשוב לקראת הבנת מנגנונים המווסתים את התקדמות הגידול. אמנם ניתן להשיג זאת באמצעות טכניקות הדמיה תוך-ורידיות עכשוויות, אך זה עדיין מאתגר בשל האופי ההטרוגני של הרקמות והצורך בהקשר מרחבי בתוך התצפית הניסיונית. לשם כך, פיתחנו תהליך הדמיה תוך-ורידי המשלב הדמיה של קולגן מהדור ההרמוני השני, פלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H, ומיקרוסקופיית הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM) כאמצעי למידור לא פולשני של המיקרו-סביבה של הגידול לתחומים בסיסיים של קן הגידול, הסטרומה או ה-ECM שמסביב, וכלי הדם. פרוטוקול לא פולשני זה מפרט את התהליך שלב אחר שלב, החל מרכישת תמונות בהילוך מהיר של מודלים של גידולי יונקים ועד לניתוח לאחר העיבוד ופילוח תמונות. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא בכך שהיא מנצלת חתימות מטבוליות כדי להקשר את המיקרו-סביבה של הגידול החי המשתנה באופן דינמי ללא שימוש בתוויות פלואורסצנטיות אקסוגניות, מה שהופך אותה ליתרון עבור מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם במטופלים אנושיים ולשימוש קליני עתידי שבו פלואורופורים חיצוניים אינם ישימים בקלות.

ההתקנה של MIW ותכנון ניסיוני בסיסי הם הצעדים הראשונים בתהליך זה. העיצוב והפרוטוקול הספציפיים האלה של MIW נוחים יותר למחקרי אורך19 , והם נוצלו בהצלחה עם מיקרוסקופים זקופים והפכים כאחד. במקרה זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך מכיוון שהוא הביא ליציבות תמונה גבוהה יותר של בלוטת החלב עם ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

שיטת ההדמיה התוך-ורידית המתוארת כאן משתמשת בדור ההרמוני השני של הקולגן ובפלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H כדי לפלח באופן לא פולשני מיקרו-סביבה של גידול ללא תווית לתוך תאי גידול, סטרומל וכלי דם לצורך ניתוח מעמיק של תמונות תוך-ורידיות 4D.

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

הדמיה תוך-ורידית מאפשרת לנו לבחון אינטראקציות פיזיולוגיות בתוך המיקרו-סביבה של הגידול. ועל ידי שימוש בשיטה זו, ניתן למדר התנהגויות דינמיות ספציפיות שנצפו באמצעות תכונות רקמה מקומיות. פרוטוקול זה משתמש רק באות נטול תוויות הנמצא בכל מקום מסיבי קולגן או ממטבוליטים אוטופלואורסצנטיים כדי לפלח את ה-TME, ובכך למזער את כמות המניפולציות לעכבר.שיטה זו ישימה באופן נרחב לכל מערכת תוך-תאית שבה נדרשת הבנת אינטראקציות דינמיות ביחס למבני מטריצה חוץ-תאיים או למבנים וסקולריים. מי שידגימו הליך זה יהיו דייב אינמן, מומחה מחקר בכיר, ואריקה הופמן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה. התחילו להכין זכוכית כיסוי חלון הדמיה של יונקים על ידי השריית זכוכית כיסוי עגולה של 1.5 12 מילימטרים ב-100% אתנול למשך 10 דקות, ואז ייבשו את זכוכית הכיסוי מתחת למנורת חום והצמידו את הזכוכית למסגרת החלון הדמיה של יונק המתכת באמצעות דבק ציאנואקרילט.לרפא את הדבק למשך הלילה. למחרת, השתמשו במטוש ספוג אצטון כדי לנקות את חלון הדמיית היונקים המורכב מהדבק העודף לפני שתטביעו את חלון הדמיה של היונק ב-70% אתנול למשך 10 דקות לפחות כדי לסייע בניקוי. לאחר הייבוש, אחסנו את חלון הדמיית היונקים המנוקה בצלחת פטרי סטרילית.לפני תחילת הניתוח להשתלת החלון, כלים כירורגיים של autoclave וחיטוי משטחים עם 70% אתנול. הכינו שולחן מחוטא לניתוח עם שמיכת חימום מכוסה בשדה סטרילי. קבעו את שמיכת החימום כך שהטמפרטורה הנמדדת על גבי השדה הסטרילי היא 40 מעלות צלזיוס.השתמש בתאורת עזר קרה ובמשקפיים מגדילים לצורך הניתוח. לבשו PPE המורכב ממעיל מעבדה חד-פעמי סטרילי, שרוולים כירורגיים, כפפות, הגנה על העיניים ומסכת פנים. לאחר מכן, להסיר את הפרווה של העכבר המרדים בבלוטת היונק המפשעה הרביעית עם קרם depilatory ולשטוף את האתר הניתוחי עם גזה ספוגה מים סטרילית.לאחר מכן הכינו את האתר הכירורגי המדולדל לניתוח על ידי חיטוי משטח העור עם שלושה קרצופי בטאדין ואתנול מתחלפים. בסיום, הרימו בעדינות את העור מעל בלוטת החלב מספר ארבע באמצעות מלקחיים. לאחר שהעור נשלף מדופן הגוף, הסר קטע של מילימטר אחד של השכבה העורית בקצה המלקחיים באמצעות מיקרו-חותכים כירורגיים.מבלי לחתוך את הבלוטה הבסיסית, ליצור חתך 10 מילימטר ולאחר מכן לשחרר את בלוטת החלב מן השכבה העורית עם התנועה העדינה של המלקחיים. הוסיפו PBS כדי לכסות את הבלוטה החשופה. השתמשו בתפר קלוע משי 5-0 כדי ליצור תפר מיתר ארנק לאורך שולי הפתח, ואז הכניסו קצה של חלון הדמיה של החלב כך שהשכבה העורית תתחבר לחריץ המקבל של חלון ההדמיה של החלב.תוך כדי מתיחת האפיתל בקצה הנגדי של חלון ההדמיה של היונקים, דחפו את חלון ההדמיה של יונק המתכת למקומו כך שהשכבה העורית תפעיל באופן מלא את החריץ המקבל סביב כל היקף חלון הדמיון של היונק. לאחר מכן חרבו את חוט הארנק כדי למשוך את השכבה העורית לתוך החריץ וקשרו את השכבה כדי לאבטח את החלון. יש למרוח אנטיביוטיקה מקומית על השכבה העורית בחלון ההדמיה של היונק ולנטר באופן רציף את העכבר.לאחר שחזר להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות החזה, אחסן את העכבר המושתל בחלון הדמיה של היונק בנפרד על מצעים רכים עם איגלו שהונח בכלוב ומאפשר לעכבר להתאושש במשך 48 שעות לפני ההדמיה. לצורך ההדמיה, השתמש במערכת אוויר כפויה המוגדרת ל-30 מעלות צלזיוס. השתמשו במחמם מטרה נוסף כדי למנוע סחף במיקוד Z ואפשרו למערכת להגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני ההדמיה.לאחר מכן הקימו תא חימום על במת המיקרוסקופ. לאחר אישור ההרדמה בשיטת צביטה בבוהן, מוסיפים משחה לעיניים לעכבר. כדי לשמור על הידרציה נכונה, להזריק 0.5 מיליליטרים של PBS תת עורית כל שעתיים למשך ההדמיה.יש למרוח ג'ל על בסיס מים במקום מים למטרה ולנקות את החלק החיצוני של זכוכית חלון ההדמיה של החלב עם אפליקטור כותנה ומנקה זכוכית לפני העברת העכבר לשלב המיקרוסקופ המחומם מראש. לאחר הנחת העכבר על במת המיקרוסקופ, לחץ על צווארון חלון ההדמיה של היונק לתוך חור קליטה של 14 מילימטרים בתוספת הבמה כדי לייצב את התמונות ולהתאים את צינור האיזופלורן. לאחר מכן הביאו את שדה ההדמיה למוקד באמצעות עיניות המיקרוסקופ והתאורה של ברייטפילד, תוך התבוננות בכלי הדם עם זרימת הדם.בדוק את יציבות שדה הראייה. אם קיימים ממצאי תנועת נשימה, יש למרוח דחיסה עדינה על החלק האחורי של הבלוטה עם גוש קצף קטן ופיסת סרט דבק דמוית סיכה. לאחר הפעלת הדחיסה, ודא שזרימת הדם נשמרת בכל שדה הראייה.לאחר שהעכבר מורדם וממוקם בבטחה על שלב המיקרוסקופ ההפוך, התחל לאתר אזורי עניין. באמצעות מקור אור המכוון לחלון ההדמיה של היונקים, השתמשו בעיניים של המיקרוסקופ כדי לזהות אזורים פוטנציאליים לחקירה. ההתמקדות צריכה להיות בראיית כלי הדם וזרימת הדם.הוסף ושמור את מיקומי XY בתוכנה. כאשר נקבעות רמות ההספק המתאימות, הגדירו את ערימת Z והתבוננו במראה של סיבי קולגן בשפע של 20 עד 50 מיקרומטר מתחת לפני השטח של חלון הדמיית החלב. הקולגן יהפוך לפחות נפוץ ככל שהמיקרוסקופ יעמיק בגידול.החללים בדור ההרמוני השני או SHG חושפים את מיקומם של מסות הגידול. הגדר את פרוסת Z העליונה מתחת לשכבת התאים הבודדים כאשר סיבי הקולגן הראשונים מופיעים על 50 עד 100 מיקרון. הגדר את פרוסת Z התחתונה על 250 מיקרומטרים שבהם הסיבים דוהים החוצה והאות הלקוי שולט.לאחר מכן חזור על ההליך עבור כל עמדות XY שנשמרו. לאחר הגדרת טווח מחסנית Z, הגדל את זמן השהייה לשמונה מיקרו-שניות ובצע אופטימיזציה של הגדרות ההספק והגלאי. מטב את רמות ההספק הדרושות כדי להלהיב את הרקמה עבור כל ניסוי והשתמש בהספקים של עד 90 מילי-וואט ב-750 ננומטר או 70 מילי-וואט ב-890 ננומטר בפתח האחורי של המטרה.לאחר מכן, התחילו במרווחים של 10 דקות בין נקודות איסוף עבור רוב סרטי ההעברה התוך-לוויטליים והתאימו את מרווחי הזמן בהתאם למטרות הניסוי. אם נצפים סימנים של פוטוטוקסיות כמו הלבנת תאים או הגדלה מהירה של האוטו-פלואורסצנציה והלבנת פוטו-אקונומיקה מוגזמת, הפחיתו את עוצמת הלייזר או הגדילו את מרווחי הזמן כפי שעולה מהתנאים. עבור הדמיית אורך חיים פלואורסצנטי או FLIM של NADPH, התחל בסריקת תצוגה מקדימה והתאם את עוצמת הלייזר עד שהקריאה של מפלה השברים הקבוע או CFD תהיה בין 10 לחמישית ו-10 לשישית.חריגה מ-CFD מעבר ל-10 לתוצאה השישית בערימת פוטונים ותוצאות כלליות גרועות. לאחר הגדרת רמת ההספק, הגדר את זמן האינטגרציה בין 90 ל- 120 שניות והתחל את אוסף FLIM כדי להשיג פוטונים משדה הראייה למשך הזמן המוקצב. שדה ראייה טיפוסי בתוך גידול החלב ללא תווית הדגים שפע של סיבי קולגן ליד החלון וירידה בשפע עמוק יותר לתוך הגידול.השימוש בחיים פלואורסצנטיים או NADPH סייע בזיהוי כלי הדם. חלק מהאזורים הכהים בתמונות היו קפלי גידולים או התבקעות של אונות גידול סמוכות. כדי לזהות כלי דם, תמונה מורכבת באמצעות NDPH FLIM אומתה על ידי השוואת הקרנות בעוצמה המרבית של הערימה התוך-ורידית לפני ואחרי הזרקת וריד הזנב של דקסטרן פלואורסצנטי.הניתוח הייצוגי מראה את הכימות של ארבעה עכברים ואת שדות הראייה. כדי לשרטט את הגבולות של מסות הגידול נטולות התוויות, נעשה שימוש באוטופלואורסצנציה של NADPH. התמונות דיווחו על החתימות המטבוליות של התאים ועל מיקומם של כלי הדם.גם ה-AFD זיהה את המקרופאגים. עם ערכת הסגמנטציה, הגידול נטול התוויות חולק לתאים עבור קן הגידול, סטרומה וכלי דם באמצעות SHG ו- NADPH אוטופלואורסצנציה בלבד. בנוסף, ניתן לסווג את סיבי הסטרומה והקולגן גם לאזורים מקומיים של הסיבים המיושרים.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור עבור פרוטוקול זה הוא לוודא כי העכבר מסומם כראוי ומרוסן, כך שדה הראייה נשאר יציב להדמיה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

שלב בצילום מואץ, ללא תווית, כמותיים הדמיה המחקר של תאים סרטניים אנושיים רדום ופעיל

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

הערכת מיקרוסביבה הגידול של גרורה בתיווך החדירות כלי דם הקשורים להפצת תאים סרטניים באמצעות הדמיה Intravital וניתוח רקמות קבוע

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

סטרומה הרומן פיברוהפיצוץ-מודנן 3D הגידול מודל ספרואיד ללמוד אינטראקציה סרטניים-סטרומה וגילוי הסמים

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

מיקרו-דיסקציה מתועשת, מונחית בינה מלאכותית בלייזר לניתוח פרוטאומי בקנה מידה זעיר של המיקרו-סביבה של הגידול

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...