Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
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Gli autori desiderano riconoscere le sovvenzioni NCI R01 CA216248, CA206458 e CA179556 per il finanziamento di questo lavoro. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Kevin Eliceiri e il suo gruppo di imaging per la loro esperienza tecnica nello sviluppo precoce del nostro programma intravitale. Ringraziamo anche il Dr. Ben Cox e altri membri dell'Eliceiri Fabrication Group presso il Morgridge Institute for Research per la loro progettazione tecnica essenziale durante le prime fasi del MIW. La dott.ssa Ellen Dobson ha assistito con conversazioni utili sullo strumento di segmentazione WEKA addestrabile ImageJ. Inoltre, vorremmo ringraziare la dott.ssa Melissa Skala e la dott.ssa Alexa Barres-Heaton per l'uso tempestivo del loro microscopio. Infine, vorremmo ringraziare la dott.ssa Brigitte Raabe, D.V.M, per tutte le discussioni premurose e i consigli sulla gestione e la cura del nostro mouse.

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Wisconsin-Madison. Il benessere e la gestione del dolore in tutti gli esperimenti sugli animali sono fondamentali. Pertanto, viene fatto ogni sforzo per assicurarsi che l'animale sia a suo agio e ben curato in ogni fase della procedura.
1. Generazione della finestra di imaging mammario (MIW)
<ol><li>Per costruire la finestra di imaging mammar...

L'imaging intravitale 4D è un potente strumento per studiare le interazioni fisiologiche dinamiche all'interno del contesto spaziale e temporale del microambiente tumorale nativo. Questo manoscritto fornisce un quadro operativo molto semplice e adattabile per compartimentare le interazioni cellulari dinamiche all'interno della massa tumorale, dello stroma adiacente o in prossimità della rete vascolare utilizzando solo segnali endogeni dalla seconda generazione armonica o dall'autofluorescenza NAD(P)H. Questo protocollo...

La matrice extracellulare (ECM) nel microambiente tumorale è nota per essere depositata dinamicamente e rimodellata da più tipi di cellule per facilitare ulteriormente la progressione della malattia 1,2,3. Queste alterazioni della matrice forniscono segnali sia meccanici che biologici che alterano il comportamento cellulare e spesso si traducono in un ciclo continuo di rimodellamento della matrice4. L'indagine sull'interazione dinamica e reciproca tra le cellule tumorali e la matrice extracellulare viene spesso condotta utilizzando colture tridimensionali (3D) in vitro o sistemi microfluidici. Mentre questi approcci bottom-up hanno dimostrato meccanismi di rimodellamento dell'ECM 5,6,7, aumento della proliferazione8, transizione da epiteliale a mesenchimale 9,10,11,12 e migrazione e invasione delle cellule tumorali 7,13,14,15,16 , il loro focus si è concentrato principalmente su alcuni tipi di cellule (ad esempio, cellule tumorali o fibroblasti) all'interno di una matrice 3D omogenea rispetto alla diversità e all'eterogeneità delle interazioni presenti all'interno di un tessuto fisiologico. Oltre ai sistemi in vitro, l'istologia tumorale ex vivo può anche fornire alcune informazioni su queste interazioni cellula-cellula e cellula-ECM17. L'immunoistochimica ha il vantaggio di poter analizzare più tipi di cellule rispetto alla composizione e all'architettura spazialmente eterogenee dell'ECM, ma gli endpoint statici del tessuto fisso non catturano la natura dinamica delle interazioni tra le cellule e il microambiente. L'imaging intravitale ha aperto la porta per interrogare interazioni diverse e dinamiche all'interno del contesto fisiologico del microambiente tumorale nativo.
Le capacità dell'imaging tumorale intravitale stanno rapidamente avanzando. I miglioramenti nella progettazione delle finestre di imaging e le tecniche chirurgiche per impiantare le finestre hanno consentito l'imaging longitudinale del tumore a lungo termine in una varietà di posizioni anatomiche (ad esempio, tumore primario, linfonodi, siti metastatici 18,19,20). Inoltre, la capacità della strumentazione ottica di visualizzare e raccogliere dati in più dimensioni (ad esempio, spettrale, intensità di fluorescenza spaziale e durata) e ad alta risoluzione e velocità (velocità video) sta diventando ampiamente accessibile. La tecnologia migliorata offre l'opportunità di esplorare rapidi cambiamenti nella segnalazione cellulare e nelle dinamiche fenotipiche all'interno di un ambiente fisiologico. Infine, l'espansione degli strumenti optogenetici e l'ampia gamma di costrutti fluorescenti genetici consentono l'etichettatura di specifici tipi di cellule per catturare la migrazione cellulare nel microambiente tumorale o il tracciamento del lignaggio cellulare durante lo sviluppo o la progressione della malattia21,22. L'uso di questi strumenti in combinazione con la tecnologia CRISPR / Cas9 offre ai ricercatori l'opportunità di generare modelli animali unici in modo tempestivo.
Mentre tutti questi progressi rendono l'imaging intravitale un metodo sempre più potente per esplorare le interazioni cellulari dinamiche e fisiologiche, c'è ancora un'importante necessità di sviluppare strategie che forniscano un contesto spaziale, temporale e strutturale a livello tissutale a queste interazioni biologiche. Attualmente, molti studi di imaging intravitale compensano la mancanza di punti di riferimento visivi come i vasi sanguigni iniettando coloranti fluorescenti nella vascolarizzazione o impiegando modelli murini che esprimono esogenamente proteine fluorescenti per delineare le caratteristiche fisiche. Coloranti iniettabili e substrati come dextrans fluorescenti sono ampiamente utilizzati per etichettare con successo la vascolarizzazione nelle collezioni intravitali19, 23, 24. Tuttavia, questo approccio non è privo di limitazioni. Per uno, richiede ulteriori manipolazioni del mouse e la sua utilità è limitata agli esperimenti a breve termine. Per gli studi longitudinali, il destrano fluorescente può essere problematico in quanto osserviamo l'accumulo di destrano nelle cellule fagocitiche o la diffusione nel tessuto circostante nel tempo25. L'incorporazione di proteine fluorescenti esogene nel modello murino è stata presentata come alternativa al dextrans fluorescente, ma presenta dei limiti propri. La disponibilità e la diversità dei fluorofori esogeni all'interno dei modelli murini sono ancora limitate e costose da creare. Inoltre, in modelli specifici, come i modelli PDX, le manipolazioni genetiche non sono desiderabili o possibili. È stato anche dimostrato che la presenza di proteine fluorescenti o bioluminescenti all'interno delle cellule sono riconosciute come estranee all'interno del topo, e all'interno di modelli murini immunocompetenti, questo riduce la quantità di metastasi dovute alla risposta del sistema immunitario dell'ospite26,27. Infine, le proteine fluorescenti esogene o i coloranti fluorescenti utilizzati per il contesto spaziale o per segmentare i dati successivi spesso occupano intervalli primi dello spettro luminoso che potrebbero altrimenti essere utilizzati per indagare le interazioni fisiologiche di interesse.
L'uso del segnale intrinseco dall'ECM o della fluorescenza endogena dalle cellule all'interno del tessuto rappresenta un potenziale mezzo universale privo di etichette per segmentare i dati intravitali per un'analisi cellulare e spaziale più approfondita. La seconda generazione armonica (SHG) è stata a lungo utilizzata per visualizzare l'ECM28. Con il successivo sviluppo di importanti strumenti per aiutare nella caratterizzazione dell'organizzazione delle fibre 29,30,31, è possibile caratterizzare il comportamento cellulare relativo alla struttura ECM locale. Inoltre, l'autofluorescenza del metabolita endogeno, NAD(P)H, fornisce un altro strumento privo di etichette per compartimentare il microambiente tumorale in vivo. Nad(P)H fluoresce brillantemente nelle cellule tumorali e può essere utilizzato per discriminare i confini del nido tumorale in crescita dal suo stroma circostante21,32. Infine, la vascolarizzazione è un'importante struttura fisiologica nel microambiente tumorale e il sito di interazioni chiave specifiche per tipo cellulare 33,34,35. L'eccitazione dei globuli rossi (RBC) o del plasma sanguigno è stata utilizzata per visualizzare la vascolarizzazione tumorale e utilizzando l'eccitazione a due o tre fotoni (2P; 3P) la misurazione delle velocità del flusso sanguigno ha dimostrato di essere possibile36. Tuttavia, mentre i vasi sanguigni più grandi sono facilmente identificabili dalle loro firme di fluorescenza endogena, l'identificazione di piccoli vasi sanguigni sottili, variabili e meno fluorescenti richiede più esperienza. Queste difficoltà intrinseche ostacolano la segmentazione ottimale dell'immagine. Fortunatamente, queste fonti di fluorescenza endogena (cioè globuli rossi e plasma sanguigno) possono anche essere misurate mediante imaging a fluorescenzaa vita 37, che capitalizza sulle proprietà fotofisiche uniche della vascolarizzazione e rappresenta un'utile aggiunta alla crescente cassetta degli attrezzi intravitale.
In questo protocollo, viene descritto un flusso di lavoro per la segmentazione dell'imaging intravitale quadridimensionale (4D) utilizzando esplicitamente segnali intrinseci come la fluorescenza endogena e l'SHG dall'acquisizione all'analisi. Questo protocollo è particolarmente pertinente per gli studi longitudinali attraverso una finestra di imaging mammario in cui la fluorescenza esogena potrebbe non essere pratica o possibile, come nel caso dei modelli PDX. I principi di segmentazione qui delineati, tuttavia, sono ampiamente applicabili agli utenti intravitali che studiano la biologia del tumore, lo sviluppo dei tessuti o anche la normale fisiologia dei tessuti. La suite di approcci di analisi riportata consentirà agli utenti di differenziare il comportamento cellulare tra regioni di configurazioni di fibre di collagene allineate o casuali, confrontare numeri o comportamenti di cellule residenti in regioni specifiche del microambiente tumorale e mappare la vascolarizzazione al microambiente tumorale utilizzando solo il segnale privo di etichette o intrinseco. Insieme, questi metodi creano un quadro operativo per massimizzare la profondità delle informazioni acquisite dall'imaging intravitale 4D della ghiandola mammaria, riducendo al minimo la necessità di ulteriori etichette esogene.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

La capacità di visualizzare interazioni fisiologiche complesse e dinamiche tra numerosi tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) all'interno di un microambiente tumorale vivo è un passo importante verso la comprensione dei meccanismi che regolano la progressione del tumore. Mentre questo può essere realizzato attraverso le attuali tecniche di imaging intravitale, rimane impegnativo a causa della natura eterogenea dei tessuti e della necessità di un contesto spaziale all'interno dell'osservazione sperimentale. A tal fine, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di imaging intravitale che accoppia l'imaging di seconda generazione armonica del collagene, la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H e la microscopia di imaging a vita di fluorescenza (FLIM) come mezzo per compartimentare in modo non invasivo il microambiente tumorale in domini di base del nido tumorale, dello stroma circostante o ECM e della vascolarizzazione. Questo protocollo non invasivo descrive in dettaglio il processo passo-passo che va dall'acquisizione di immagini time-lapse di modelli di tumore mammario all'analisi post-elaborazione e alla segmentazione delle immagini. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è che sfrutta le firme metaboliche per contestualizzare il microambiente tumorale vivo che cambia dinamicamente senza l'uso di etichette fluorescenti esogene, rendendolo vantaggioso per i modelli di xenotrapianti derivati dal paziente umano (PDX) e per il futuro uso clinico in cui i fluorofori estrinseci non sono facilmente applicabili.

L'installazione del MIW e la pianificazione sperimentale di base sono i primi passi in questo processo. Questo particolare design e protocollo MIW è più suscettibile agli studi longitudinali19 ed è stato utilizzato con successo sia con microscopi verticali che invertiti. In questo caso, è stato utilizzato un microscopio invertito in quanto ha portato a una maggiore stabilità dell'immagine della ghiandola mammaria con meno artefatti respiratori. Nella Figura 1A, f...

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A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Il metodo di imaging intravitale qui descritto utilizza la seconda generazione armonica di collagene e la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H per segmentare in modo non invasivo un microambiente tumorale non etichettato in compartimenti tumorali, stromali e vascolari per l'analisi approfondita delle immagini intravitali 4D.

Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

L'imaging intravitale ci consente di osservare le interazioni fisiologiche all'interno del microambiente tumorale. E usando questo metodo, specifici comportamenti dinamici osservati possono essere compartimentati utilizzando le caratteristiche del tessuto locale. Questo protocollo utilizza solo un segnale onnipresente privo di etichette da fibre di collagene o metaboliti autofluorescenti per segmentare la TME, riducendo così al minimo la quantità di manipolazioni per il topo.Questo metodo è ampiamente applicabile a qualsiasi sistema intravitale in cui è richiesta la comprensione delle interazioni dinamiche relative alle strutture della matrice extracellulare o alle strutture vascolari. A dimostrare questa procedura saranno Dave Inman, specialista di ricerca senior, ed Erica Hoffmann, una studentessa laureata del laboratorio. Iniziare a preparare un vetro di copertura della finestra di imaging mammario immergendo un vetro di copertura rotondo da 1,5 12 millimetri in etanolo al 100% per 10 minuti, quindi asciugare il vetro di copertura sotto una lampada termica e fissare il vetro al telaio della finestra di imaging mammario in metallo utilizzando adesivo cianoacrilato.Curare l'adesivo durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare un tampone imbevuto di acetone per pulire la finestra di imaging mammario assemblata dell'adesivo in eccesso prima di immergere la finestra di imaging mammario in etanolo al 70% per almeno 10 minuti per aiutare con la pulizia. Dopo l'essiccazione, conservare la finestra di imaging mammario pulita in una capsula di Petri sterile.Prima di iniziare l'intervento per l'impianto della finestra, autoclave strumenti chirurgici e sanificare le superfici con il 70% di etanolo. Preparare un tavolo igienizzato per l'intervento chirurgico con una coperta riscaldante coperta da un campo sterile. Impostare la coperta riscaldante in modo tale che la temperatura misurata in cima al campo sterile sia di 40 gradi Celsius.Utilizzare l'illuminazione fredda ausiliaria e le lenti d'ingrandimento per la procedura chirurgica. Indossare DPI costituiti da un cappotto da laboratorio monouso sterile, maniche chirurgiche, guanti, protezione per gli occhi e maschera facciale. Quindi, rimuovere la pelliccia del topo anestetizzato alla quarta ghiandola mammaria inguinale con una crema depilatoria e risciacquare il sito chirurgico con una garza sterile imbevuta d'acqua.Quindi preparare il sito chirurgico depilato per l'intervento chirurgico igienizzando la superficie della pelle con tre scrub alternati betadine ed etanolo. Al termine, sollevare delicatamente la pelle sopra la ghiandola mammaria numero quattro usando una pinza. Una volta che la pelle viene allontanata dalla parete del corpo, rimuovere una sezione di un millimetro dello strato dermico sulla punta della pinza con microscissori chirurgici.Senza tagliare la ghiandola sottostante, creare un'incisione di 10 millimetri e quindi rilasciare la ghiandola mammaria dallo strato dermico con il delicato movimento della pinza. Aggiungere PBS per coprire la ghiandola esposta. Utilizzare una sutura intrecciata di seta 5-0 per creare una sutura di stringa di borsa lungo la periferia dell'apertura, quindi inserire un bordo della finestra di imaging mammario in modo che lo strato dermico si innesti nella tacca ricevente della finestra di imaging mammario.Mentre si allunga l'epitelio all'estremità opposta della finestra di imaging mammario, spingere la finestra di imaging mammario in metallo in posizione in modo tale che lo strato dermico coinvolga completamente la tacca ricevente attorno all'intera circonferenza della finestra di imaging mammario. Quindi stringi il cordone della borsa per disegnare lo strato dermico nella tacca e lega lo strato per fissare la finestra. Applicare un antibiotico topico allo strato dermico nella finestra di imaging mammario e monitorare continuamente il mouse.Dopo aver riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la reclinazione sternale, alloggiare la finestra di imaging mammaria impiantata separatamente sul letto morbido con un igloo posto nella gabbia e consentire al topo di recuperare per 48 ore prima dell'imaging. Per l'imaging, utilizzare un sistema ad aria forzata impostato su 30 gradi Celsius. Utilizzare un riscaldatore obiettivo aggiuntivo per evitare la deriva nella messa a fuoco Z e consentire al sistema di raggiungere l'equilibrio a 30 gradi Celsius per almeno un'ora prima dell'imaging.Quindi impostare una camera di riscaldamento sul palco del microscopio. Dopo aver confermato l'anestesia con il metodo del pizzicamento delle dita dei piedi, aggiungere un unguento per gli occhi al mouse. Per mantenere una corretta idratazione, iniettare 0,5 millilitri di PBS per via sottocutanea ogni due ore per tutta la durata della sessione di imaging.Applicare un gel a base d'acqua invece di acqua all'obiettivo e pulire l'esterno del vetro della finestra di imaging mammario con un applicatore di cotone e un detergente per vetri prima di trasferire il mouse allo stadio del microscopio preriscaldato. Dopo aver posato il mouse sul palco del microscopio, premere il collare della finestra di imaging mammario in un foro di ricezione di 14 millimetri nell'inserto del palco per stabilizzare le immagini e adattare il tubo isoflurano. Quindi mettere a fuoco il campo di imaging utilizzando gli oculari del microscopio e l'illuminazione Brightfield, osservando la vascolarizzazione con il flusso sanguigno.Controllare la stabilità del campo visivo. Se sono presenti artefatti di movimento respiratorio, applicare una leggera compressione sul retro della ghiandola con un piccolo blocco di schiuma e un pezzo di nastro adesivo simile a una cintura. Dopo l'applicazione della compressione, verificare che il flusso sanguigno sia mantenuto in tutto il campo visivo.Una volta che il mouse è sedato e posizionato saldamente sullo stadio del microscopio invertito, iniziare a localizzare le regioni di interesse. Utilizzando una sorgente luminosa diretta alla finestra di imaging mammario, utilizzare gli oculari del microscopio per identificare potenziali aree di indagine. L'attenzione dovrebbe essere focalizzata sulla visione della vascolarizzazione e del flusso sanguigno.Aggiungi e salva le posizioni XY nel software. Quando vengono impostati i livelli di potenza appropriati, impostare lo stack Z e osservare la comparsa di abbondanti fibre di collagene a 20-50 micrometri sotto la superficie di vetro della finestra di imaging mammario. Il collagene diventerà meno prevalente man mano che il microscopio si inserisce più in profondità nel tumore.I vuoti nella generazione di seconda armonica o SHG rivelano la posizione delle masse tumorali. Impostare la fetta Z superiore sotto lo strato di cellule solitarie con le prime fibre di collagene appaiono a 50-100 micron. Imposta la fetta Z inferiore a 250 micrometri dove le fibre svaniscono e domina il segnale scarso.Quindi ripetere la procedura per tutte le posizioni XY salvate. Una volta impostato l'intervallo dello stack Z, aumentare il tempo di permanenza a otto microsecondi e ottimizzare le impostazioni di potenza e del rilevatore. Ottimizza i livelli di potenza necessari per eccitare il tessuto per ogni esperimento e utilizza potenze fino a 90 milliwatt a 750 nanometri o 70 milliwatt a 890 nanometri all'apertura posteriore dell'obiettivo.Quindi, iniziare con intervalli di 10 minuti tra i punti di raccolta per la maggior parte dei filmati di migrazione intravitale e regolare gli intervalli di tempo in base agli obiettivi sperimentali. Se si osservano segni di fototossicità come blebbing cellulare o autofluorescenza in rapido aumento e fotosbiancamento eccessivo, ridurre la potenza del laser o aumentare gli intervalli di timelapse come indicano le condizioni. Per l'imaging a vita di fluorescenza o FLIM di NADPH, avviare la scansione di anteprima e regolare la potenza del laser fino a quando la lettura del discriminatore di frazione costante o CFD è compresa tra 10 e la quinta e da 10 alla sesta.Il superamento dei CFD oltre 10 al sesto risultato in accumulo di fotoni e scarsi risultati complessivi. Una volta impostato il livello di potenza, impostare il tempo di integrazione tra 90 e 120 secondi e avviare la raccolta FLIM per acquisire fotoni dal campo visivo per il tempo assegnato. Un tipico campo visivo all'interno di un tumore mammario privo di etichette ha dimostrato abbondanti fibre di collagene vicino alla finestra e una diminuzione dell'abbondanza più in profondità nel tumore.L'uso della vita di fluorescenza o NADPH ha aiutato nell'identificazione della vascolarizzazione. Alcune regioni scure nelle immagini erano pieghe tumorali o il buttting up di lobi tumorali adiacenti. Per identificare la vascolarizzazione, un'immagine composita utilizzando NDPH FLIM è stata convalidata confrontando le proiezioni di intensità massima dello stack intravitale prima e dopo l'iniezione della vena di coda di destrano fluorescente.L'analisi rappresentativa mostra la quantificazione di quattro topi e i campi visivi. Per delineare i confini delle masse tumorali prive di etichetta, è stata utilizzata l'autofluorescenza NADPH. Le immagini riportavano le firme metaboliche delle cellule e la posizione dei vasi sanguigni.L'autofluorescenza AFD ha anche identificato i macrofagi. Con lo schema di segmentazione, il tumore senza etichetta è stato segmentato in compartimenti per il nido tumorale, lo stroma e la vascolarizzazione utilizzando solo l'autofluorescenza SHG e NADPH. Inoltre, le fibre di stroma e collagene possono anche essere classificate in regioni locali delle fibre allineate.La cosa più importante da ricordare per questo protocollo è assicurarsi che il mouse sia adeguatamente sedato e trattenuto in modo che il campo visivo rimanga stabile per l'imaging.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

Una fase di time-lapse, privo di etichetta, quantitativa Imaging Studio delle cellule tumorali umane dormienti e attivo

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Fosfopeptide arricchimento accoppiata alla spettrometria di massa privo di etichetta quantitativa per indagare il Phosphoproteome nel carcinoma della prostata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

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Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da Metastasi Doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging intravitale e l'analisi dei tessuti fissi

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Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

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Un nuovo modello di spheroid del tumore strutturato in 3D modulato come fibromastro per studiare l'interazione tumora-stroma e la scoperta di farmaci

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Isolamento di fluidi prossimali per studiare il microambiente tumorale dell'adenocarcinoma pancreatico

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Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

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Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Microdissezione laser industrializzata guidata dall'intelligenza artificiale per l'analisi proteomica microscalata del microambiente tumorale

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...