Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
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저자는이 작업에 대한 NCI R01 CA216248, CA206458 및 CA179556 보조금을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 Kevin Eliceiri 박사와 그의 이미징 그룹이 우리의 intravital 프로그램의 초기 개발에 대한 기술적 전문성을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 벤 콕스 박사와 Morgridge Institute for Research의 Eliceiri Fabrication Group의 다른 회원들에게 MIW의 초기 단계에서 필수적인 기술 설계에 감사드립니다. Ellen Dobson 박사는 ImageJ 교육 가능한 WEKA 세분화 도구에 대한 유용한 대화를 도왔습니다. 또한 현미경을 적시에 사용해 주신 Melissa Skala 박사와 Alexa Barres-Heaton 박사에게 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 마우스 취급 및 관리에 대한 모든 사려 깊은 토론과 조언에 대해 Brigitte Raabe, D.V.M 박사에게 감사드립니다.

설명 된 모든 실험은 University of Wisconsin-Madison의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 모든 동물 실험에서 웰빙과 통증 관리가 가장 중요합니다. 따라서 절차의 각 단계에서 동물이 편안하고 잘 보살핌을받을 수 있도록 모든 노력을 기울입니다.
1. 유방 이미징 창 (MIW)의 생성
<ol><li>유방 이미징 창을 구성하려면 수술 등급 스테인레스 스틸로 14mm ...

4D 생체 내 영상화는 천연 종양 미세환경의 공간적 및 시간적 맥락 내에서 역동적인 생리학적 상호작용을 조사하는 강력한 도구이다. 이 원고는 종양 질량, 인접한 스트로마 또는 두 번째 고조파 생성 또는 NAD(P)H 자가형광으로부터의 내인성 신호만을 사용하여 혈관 네트워크에 근접한 내에서 동적 세포 상호작용을 구획화하는 매우 기본적이고 적응 가능한 작동 프레임워크를 제공한다. 이 프로토?...

종양 미세환경 내의 세포외 기질 (ECM)은 질환 진행을 더욱 촉진하기 위해 다수의 세포 유형에 의해 동적으로 침착되고 리모델링되는 것으로 알려져 있다 1,2,3. 이러한 매트릭스 변경은 세포 거동을 변화시키는 기계적 및 생물학적 단서를 모두 제공하며 종종 매트릭스 리모델링의 지속적인 사이클을 초래합니다 4. 종양 세포와 세포외 매트릭스 사이의 동적, 상호적 상호 작용에 대한 조사는 종종 시험관내 배양 또는 미세유체 시스템에서 3차원(3D)을 사용하여 수행된다. 이러한 상향식 접근법은 ECM 리모델링5,6,7, 증식 증가8, 상피에서 중간엽 전이9,10,11,12, 종양 세포 이동 및 침윤 7,13,14,15,16 의 메카니즘을 입증하는 반면, 그들의 초점은 생리학적 조직 내에 존재하는 상호작용의 다양성 및 이질성과 비교하여 동질적인 3D 매트릭스 내의 몇몇 세포 유형 (예를 들어, 종양 세포 또는 섬유아세포)에 주로 집중되어 왔다. 시험관내 시스템 이외에도, 생체외 종양 조직학은 또한 이러한 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용(17)에 대한 약간의 통찰을 제공할 수 있다. 면역조직화학은 ECM의 공간적으로 불균질한 조성 및 구조에 대하여 여러 세포 유형을 분석할 수 있다는 장점이 있지만, 고정된 조직의 정적 종점은 세포와 미세환경 사이의 상호작용의 동적 성질을 포착하지 못한다. Intravital 이미징은 네이티브 종양 미세 환경의 생리적 맥락 내에서 다양하고 역동적 인 상호 작용을 조사하는 문을 열었습니다.
생명 내 종양 영상의 기능은 빠르게 발전하고 있습니다. 창문을 이식하기 위한 이미징 윈도우 및 수술 기술의 설계의 개선은 다양한 해부학적 위치(즉, 원발성 종양, 림프절, 전이성 부위18,19,20)에서 장기 종방향 종양 영상화를 가능하게 하였다. 더욱이, 다중 차원(즉, 분광, 공간 형광 강도 및 수명) 및 고해상도 및 속도(비디오 속도)로 데이터를 시각화하고 수집하는 광학 계측의 용량은 널리 접근이 가능해지고 있다. 개선된 기술은 생리학적 환경 내에서 세포 신호전달 및 표현형 역학의 급격한 변화를 탐구할 수 있는 기회를 제공한다. 마지막으로, 광유전학적 도구 및 광범위한 유전자 형광 구축물의 확장은 발달 또는 질병 진행 동안 종양 미세환경 또는 세포 계보 추적에서 세포 이동을 포획하기 위해 특정 세포 유형의 태깅을 허용한다(21,22). CRISPR / Cas9 기술과 함께 이러한 도구를 사용하면 연구원이시기 적절하게 고유 한 동물 모델을 생성 할 수있는 기회를 얻을 수 있습니다.
이러한 모든 진보가 생체 내 이미징을 역동적이고 생리적 인 세포 상호 작용을 탐구하는 점점 더 강력한 방법으로 만드는 반면, 조직 수준에서 공간적, 시간적, 구조적 맥락을 이러한 생물학적 상호 작용에 제공하는 전략을 개발하는 것이 여전히 중요합니다. 현재, 많은 생명 내 영상 연구는 형광 염료를 혈관구조에 주입하거나 물리적 특징을 묘사하기 위해 형광 단백질을 외인성으로 발현하는 마우스 모델을 사용하여 혈관과 같은 시각적 랜드 마크의 부족을 보완합니다. 주사용 염료 및 형광 덱스트란과 같은 기질은 활력 내 콜렉션19, 23, 24에서 혈관구조를 성공적으로 표지하기 위해 광범위하게 활용된다. 그러나, 이러한 접근법은 제한이 없는 것은 아니다. 하나는 추가 마우스 조작이 필요하며 그 유용성은 단기 실험으로 제한됩니다. 종단 연구의 경우, 형광 덱스트란은 식세포 세포에서 덱스트란의 축적 또는 시간25에 따른 주변 조직으로의 확산을 관찰 할 때 문제가 될 수 있습니다. 마우스 모델로의 외인성 형광 단백질 혼입은 형광 덱스트란에 대한 대안으로서 제시되어 왔지만 그 자체의 한계를 제시한다. 마우스 모델 내에서 외인성 형광단의 가용성과 다양성은 여전히 제한적이며 만드는 데 비용이 많이 듭니다. 추가적으로, PDX 모델과 같은 특정 모델에서, 유전자 조작은 바람직하지 않거나 가능하지 않다. 또한, 세포 내 형광 또는 생체발광 단백질의 존재는 마우스 내 및 면역적격 마우스 모델 내에서 외래로 인식되며, 이것은 숙주 면역계(26,27)의 반응으로 인한 전이의 양을 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 마지막으로, 공간적 맥락 또는 후속 데이터를 분절하기 위해 사용되는 외인성 형광 단백질 또는 형광 염료는 종종 관심의 생리학적 상호작용을 조사하는데 달리 사용될 수 있는 광 스펙트럼의 프라임 범위를 차지한다.
ECM으로부터의 내재적 신호 또는 조직 내 세포로부터의 내인성 형광의 사용은 보다 심층적인 세포 및 공간 분석을 위해 생체내 데이터를 분절하는 잠재적인 범용 라벨 프리 수단을 나타낸다. 제2고조파 생성(SHG)은 ECM(28)을 시각화하는데 오랫동안 사용되어 왔다. 섬유 조직 29,30,31의 특성화를 돕기 위한 중요한 도구의 후속 개발로, 국소 ECM 구조에 비해 세포 거동을 특성화할 수 있다. 또한, 내인성 대사산물인 NAD(P)H로부터의 자가형광은 생체내에서 종양 미세환경을 구획화하는 또 다른 표지가 없는 도구를 제공한다. NAD(P)H는 종양 세포에서 밝게 형광을 띠며, 성장하는 종양 둥지의 경계를 그의 주변 스트로마21,32로부터 구별하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 혈관구조는 종양 미세환경 및 주요 세포형-특이적 상호작용의 부위에서 중요한 생리학적 구조이다(33,34,35). 적혈구(RBC) 또는 혈장의 여기가 종양 혈관조직을 시각화하는데 사용되어 왔으며, 2- 또는 3-광자 여기(2P; 3P)를 사용하여 혈류 속도의 측정이 가능한 것으로 나타났다(36). 그러나 더 큰 혈관은 내인성 형광 서명으로 쉽게 식별 할 수 있지만 미묘하고 가변적이며 형광이 적은 작은 혈관을 식별하려면 더 많은 전문 지식이 필요합니다. 이러한 내재적 인 어려움은 최적의 이미지 세분화를 방해합니다. 다행스럽게도, 내인성 형광의 이들 공급원(즉, 적혈구 및 혈장)은 또한 형광 수명 이미징(37)에 의해 측정될 수 있으며, 이는 혈관구조의 독특한 광물리적 특성을 이용하고 성장하는 생체내 툴박스에 유용한 부가물을 나타낸다.
이 프로토콜에서는 내인성 형광 및 SHG와 같은 고유 신호를 사용하여 명시 적으로 4 차원 (4D) 생체 내 이미징의 세분화를위한 워크 플로우가 획득에서 분석까지 설명됩니다. 이 프로토콜은 PDX 모델의 경우와 같이 외인성 형광이 실용적이거나 가능하지 않을 수 있는 유방 이미징 창을 통한 종단 연구에 특히 적합합니다. 그러나 여기에 설명 된 세분화 원칙은 종양 생물학, 조직 발달 또는 정상 조직 생리학을 조사하는 생체 내 사용자에게 광범위하게 적용됩니다. 보고된 분석 접근법 모음을 통해 사용자는 정렬된 또는 무작위 콜라겐 섬유 구성의 영역 간에 세포 거동을 구별하고, 종양 미세환경의 특정 영역에 상주하는 세포의 수 또는 거동을 비교하고, 라벨이 없거나 내재적 신호만을 사용하여 혈관을 종양 미세환경에 매핑할 수 있습니다. 함께, 이러한 방법은 유선의 4D 생체 내 이미징에서 얻은 정보의 깊이를 극대화하는 동시에 추가적인 외인성 라벨의 필요성을 최소화하기위한 운영 프레임 워크를 만듭니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

살아있는 종양 미세환경 내에서 수많은 세포 유형과 세포외 매트릭스(ECM) 사이의 복잡하고 역동적인 생리적 상호작용을 시각화하는 능력은 종양 진행을 조절하는 기전을 이해하는 중요한 단계이다. 이것은 현재의 생체 내 이미징 기술을 통해 달성 될 수 있지만, 조직의 이질적 특성과 실험 관찰 내에서 공간 맥락에 대한 필요성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이를 위해 우리는 콜라겐 초고조파 생성 영상화, 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 내인성 형광, 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 비침습적으로 종양 미세환경을 종양 둥지의 기본 도메인, 주변 스트로마 또는 ECM 및 혈관 구조로 분류하는 수단으로 쌍을 이루는 생체내 이미징 워크플로우를 개발했습니다. 이 비침습적 프로토콜은 유방 종양 모델의 타임랩스 이미지 획득부터 후처리 분석 및 이미지 세분화에 이르기까지 단계별 프로세스를 자세히 설명합니다. 이 워크플로우의 주요 장점은 대사 시그니처를 활용하여 외인성 형광 라벨을 사용하지 않고 동적으로 변화하는 살아있는 종양 미세환경을 맥락화하여 인간 환자 유래 이종이식편(PDX) 모델 및 외인성 형광단이 쉽게 적용되지 않는 미래의 임상 사용에 유리하다는 것입니다.

MIW의 설치 및 기본 실험 계획은이 과정의 첫 번째 단계입니다. 이 특별한 MIW 설계 및 프로토콜은 종단 연구19 에 더 적합하며 직립 및 반전 현미경 모두에서 성공적으로 활용되었습니다. 이 경우, 거꾸로 된 현미경이 사용되었는데, 이는 더 적은 호흡 아티팩트로 유선의 더 큰 이미지 안정성을 가져 왔기 때문입니다. 그림 1A에서는 경질 MIW의 치수와 이식 과?...

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A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

생체 내 영상은 우리가 종양 미세 환경 내에서 생리적 상호 작용을 관찰 할 수있게합니다. 그리고 이 방법을 사용함으로써, 관찰되는 특정한 동적 거동은 국소 조직 특징을 사용하여 구획화될 수 있다. 이 프로토콜은 TME를 분절하기 위해 콜라겐 섬유 또는 자가형광 대사 산물의 유비쿼터스 라벨 프리 신호만을 사용하여 마우스에 대한 조작량을 최소화합니다.이 방법은 세포외 매트릭스 구조 또는 혈관 구조에 대한 동적 상호 작용을 이해해야하는 모든 생체 내 시스템에 광범위하게 적용 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 수석 연구 전문가 인 Dave Inman과 실험실의 대학원생 인 Erica Hoffmann입니다. 1.5 12 밀리미터 원형 커버 유리를 100 % 에탄올에 10 분 동안 담가 유방 이미징 창 커버 글라스를 준비하기 시작한 다음 커버 글라스를 열 램프 하에서 건조시키고 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 금속 유방 이미징 윈도우 프레임에 유리를 고정하십시오.접착제를 밤새 치료하십시오. 다음날, 아세톤에 담근 면봉을 사용하여 유방 이미징 창을 70% 에탄올에 적어도 10분 동안 침수하기 전에 과량의 접착제의 조립된 유방 이미징 창을 청소하여 클렌징을 돕는다. 건조 후, 청소 된 유방 이미징 창을 멸균 된 Petri 접시에 보관하십시오.창 이식을위한 수술을 시작하기 전에 수술 도구를 오토클레이브하고 70 % 에탄올로 표면을 살균하십시오. 멸균 된 밭으로 덮인 따뜻한 담요로 수술을 위해 소독 된 탁상을 준비하십시오. 멸균 필드 상단에서 측정 된 온도가 섭씨 40도가되도록 온난화 담요를 설정하십시오.수술 절차를 위해 보조 냉간 조명과 돋보기를 사용하십시오. 멸균 일회용 실험실 코트, 수술용 슬리브, 장갑, 눈 보호 및 안면 마스크로 구성된 PPE를 착용하십시오. 다음으로, 네 번째 사타구니 유선에서 마취 된 마우스의 모피를 제모 크림으로 제거하고 멸균 된 물에 담근 거즈로 수술 부위를 헹구십시오.그런 다음 세 번의 교대로 베타딘 및 에탄올 스크럽으로 피부 표면을 살균하여 수술을 위해 제모 된 수술 부위를 준비하십시오. 완료되면 포셉을 사용하여 유선의 네 번 위로 피부를 부드럽게 들어 올립니다. 피부가 체벽에서 멀어지면 외과 용 미세 가위로 포셉 끝에있는 진피층의 한 밀리미터 부분을 제거하십시오.밑샘을 자르지 않고 10 밀리미터 절개를 만든 다음 포셉의 부드러운 움직임으로 진피층에서 유선을 방출하십시오. 노출 된 땀샘을 덮기 위해 PBS를 추가하십시오. 5-0 실크 꼰 봉합사를 사용하여 개구부의 주변을 따라 지갑 끈 봉합사를 만든 다음 유방 이미징 창의 가장자리를 삽입하여 진피층이 유방 이미징 창의 수신 노치에 맞물리도록하십시오.유방 이미징 창의 반대쪽 끝에서 상피를 스트레칭하면서 금속 유방 이미징 창을 제자리에 밀어 진피층이 전체 유방 이미징 창 둘레 주위에 수신 노치를 완전히 맞 춥니 다. 그런 다음 지갑 끈을 꼬집어 진피 층을 노치에 그리고 레이어를 묶어 창을 고정시킵니다. 유방 이미징 창에서 진피층에 국소 항생제를 적용하고 마우스를 지속적으로 모니터링하십시오.흉골 재발을 유지하기에 충분한 의식을 회복 한 후, 유방 이미징 창을 새장에 배치 된 이글루와 함께 부드러운 침구에 별도로 이식 한 마우스를 수용하고 마우스가 이미징 전에 48 시간 동안 회복 할 수 있도록하십시오. 이미징의 경우 섭씨 30도로 설정된 강제 공기 시스템을 사용합니다. 추가 대물 히터를 사용하여 Z 초점의 드리프트를 방지하고 이미징 전에 적어도 한 시간 동안 섭씨 30도에서 시스템이 평형을 이룰 수 있도록 하십시오.그런 다음 현미경 단계에 가열 챔버를 설치하십시오. 발가락 꼬집기 방법으로 마취를 확인한 후 마우스에 눈 연고를 넣으십시오. 적절한 수분 공급을 유지하려면 이미징 세션 기간 동안 두 시간마다 0.5 밀리리터의 PBS를 피하로 주입하십시오.물 대신 수성 젤을 대물에 바르고 미리 예열 된 현미경 단계로 마우스를 옮기기 전에 면화 도포기와 유리 클리너로 유방 이미징 창 유리의 외부를 청소하십시오. 현미경 스테이지에 마우스를 놓은 후 유방 이미징 창의 칼라를 스테이지 인서트의 14mm 수신 구멍으로 눌러 이미지를 안정화하고 이소플루란 호스에 맞춥니다. 그런 다음 현미경 안구와 Brightfield 조명을 사용하여 이미징 분야에 초점을 맞추고 혈류가있는 혈관 구조를 관찰하십시오.시야의 안정성을 확인하십시오. 호흡 운동 유물이있는 경우 작은 거품 블록과 팅크 모양의 접착 테이프 조각으로 땀샘 뒷면에 부드러운 압축을 적용하십시오. 압축이 적용된 후, 시야각 전체에 혈류가 유지되는지 확인하십시오.마우스가 진정되고 거꾸로 된 현미경 단계에 안전하게 배치되면 관심 영역을 찾기 시작하십시오. 유방 이미징 창으로 향하는 광원을 사용하여 현미경의 안구를 사용하여 조사를위한 잠재적 인 영역을 식별하십시오. 초점은 혈관 구조와 혈류를 보는 데 있어야합니다.소프트웨어에 XY 위치를 추가하고 저장합니다. 적절한 전력 레벨이 설정되면, Z 스택을 설정하고 유방 이미징 윈도우의 유리 표면 아래 20 내지 50 마이크로미터에서 풍부한 콜라겐 섬유의 출현을 관찰한다. 콜라겐은 현미경 절편이 종양으로 깊숙이 들어감에 따라 덜 널리 퍼질 것입니다.두 번째 고조파 생성 또는 SHG의 공극은 종양 덩어리의 위치를 나타냅니다. 첫 번째 콜라겐 섬유가 50 ~ 100 미크론으로 나타나는 독방 세포 층 아래에 상단 Z 슬라이스를 설정하십시오. 하단 Z 슬라이스를 250마이크로미터로 설정하여 섬유가 페이드아웃되고 불량 신호가 지배적입니다.그런 다음 저장된 모든 XY 위치에 대해 절차를 반복합니다. Z 스택 범위가 설정되면 유지 시간을 여덟 마이크로초로 늘리고 전력 및 검출기 설정을 최적화합니다. 각 실험에 대해 조직을 흥분시키는 데 필요한 전력 수준을 최적화하고 목표의 후면 조리개에서 750나노미터에서 최대 90밀리와트 또는 890나노미터에서 70밀리와트의 전력을 사용합니다.다음으로, 대부분의 생체 내 마이그레이션 동영상에 대한 수집 지점 사이의 10분 간격으로 시작하고 실험 목표에 따라 시간 간격을 조정합니다. 세포 출혈 또는 급속하게 증가하는 자기 형광 및 과도한 광표백과 같은 광독성의 징후가 관찰되면 조건이 나타내는 것처럼 레이저 파워를 줄이거나 타임랩스 간격을 늘리십시오. NADPH의 형광 수명 이미징 또는 FLIM의 경우, 프리뷰 스캐닝을 시작하고 정수 분획 판별기 또는 CFD의 판독값이 10 내지 다섯 번째와 10 내지 여섯 번째 사이가 될 때까지 레이저 파워를 조정한다.CFD가 10을 초과하여 여섯 번째까지 초과하면 광자 더미가 쌓이고 전반적인 결과가 좋지 않습니다. 전력 레벨이 설정되면 통합 시간을 90초에서 120초 사이로 설정하고 FLIM 컬렉션을 시작하여 할당된 시간 동안 시야각에서 광자를 획득합니다. 라벨이 없는 유방 종양 내의 전형적인 시야는 창 근처의 풍부한 콜라겐 섬유와 종양 깊숙한 곳으로의 풍부함의 감소를 입증했다.형광 수명 또는 NADPH의 사용은 혈관 구조의 확인에 도움이 되었다. 이미지에서 일부 어두운 영역은 종양 주름 또는 인접한 종양 엽의 엉덩이 위로 올라갔습니다. 혈관구조를 확인하기 위해, NDPH FLIM을 사용한 합성 이미지를 형광 덱스트란의 꼬리 정맥 주사 전후의 생체내 스택의 최대 강도 돌출부를 비교함으로써 검증하였다.대표적인 분석은 네 마리의 생쥐와 시야의 정량화를 보여준다. 표지가 없는 종양 덩어리의 경계를 묘사하기 위해, NADPH 자가형광을 사용하였다. 이미지는 세포의 대사 서명과 혈관의 위치를보고했습니다.AFD 자가형광은 또한 대식세포를 확인했다. 분절 스킴으로, 라벨이 없는 종양을 SHG 및 NADPH 자가형광만을 사용하여 종양 둥지, 스트로마 및 혈관구조에 대한 구획으로 분절하였다. 추가적으로, 스트로마 및 콜라겐 섬유는 또한 정렬된 섬유의 국소 영역으로 분류될 수 있다.이 프로토콜에 대해 기억해야 할 가장 중요한 것은 마우스가 제대로 고정되고 억제되어 시야가 이미징을 위해 안정적으로 유지되도록하는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

연구

암 연구학

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

고형 종양 세포주에서 측면 인구의 분석

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

췌장 선암의 종양 미세 환경을 조사하기위한 근위액 분리

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

투명한 실리콘 윈도우를 통한 종방향 생체 내 이미징

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

종양 미세환경의 미세스케일 프로테오믹 분석을 위한 산업화된 인공 지능 유도 레이저 미세 해부

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...