Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne NCI R01 CA216248, CA206458 og CA179556 tilskudd til finansiering av dette arbeidet. Vi vil også gjerne anerkjenne Dr. Kevin Eliceiri og hans bildegruppe for deres tekniske ekspertise i den tidlige utviklingen av vårt intravitale program. Vi takker også Dr. Ben Cox og andre medlemmer av Eliceiri Fabrication Group ved Morgridge Institute for Research for deres essensielle tekniske design i de tidlige fasene av MIW. Dr. Ellen Dobson assisterte med nyttige samtaler om ImageJ-verktøyet for trenbar WEKA-segmentering. I tillegg vil vi takke Dr. Melissa Skala og Dr. Alexa Barres-Heaton for rettidig bruk av mikroskopet deres. Til slutt vil vi takke Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, for alle gjennomtenkte diskusjoner og råd om vår musehåndtering og omsorg.

Alle beskrevne eksperimenter ble godkjent av University of Wisconsin-Madison's Institutional Animal Care and Use Committee. Trivsel og smertebehandling i alle dyreforsøk er avgjørende. Dermed er det gjort alt for å sikre at dyret er komfortabelt og godt ivaretatt på hvert trinn i prosedyren.
1. Generering av pattedyr bildevinduet (MIW)
<ol><li>For å konstruere pattedyrets bildevindu, lag en 14 mm ring fra kirurgisk rustfritt stål.</li>
	<li>Rengjør den bearbeidede vin...

4D intravital avbildning er et kraftig verktøy for å undersøke dynamiske fysiologiske interaksjoner innenfor den romlige og tidsmessige konteksten til det opprinnelige tumormikromiljøet. Dette manuskriptet gir et veldig grunnleggende og tilpasningsdyktig operasjonelt rammeverk for å dele opp dynamiske celleinteraksjoner i tumormassen, det tilstøtende stromaet, eller i nærheten av det vaskulære nettverket ved hjelp av bare endogene signaler fra andre harmoniske generasjon eller NAD (P) H autofluorescence. Denne pr...

Den ekstracellulære matrisen (ECM) i tumormikromiljøet er kjent for å bli dynamisk avsatt og ombygd av flere celletyper for ytterligere å lette sykdomsprogresjonen 1,2,3. Disse matriseendringene gir både mekaniske og biologiske signaler som endrer celleadferd og ofte resulterer i en kontinuerlig syklus av matriseoppussing4. Undersøkelse av det dynamiske, gjensidige samspillet mellom tumorceller og den ekstracellulære matrisen utføres ofte ved hjelp av tredimensjonal (3D) in vitrokultur eller mikrofluidiske systemer. Mens disse nedenfra-og-opp-tilnærmingene har demonstrert mekanismer for ECM-ombygging 5,6,7, økt spredning8, epitelial til mesenchymal overgang 9,10,11,12, og tumorcellemigrasjon og invasjon 7,13,14,15,16 , har deres fokus primært vært på noen få celletyper (f.eks. tumorceller eller fibroblaster) innenfor en homogen 3D-matrise sammenlignet med mangfoldet og heterogeniteten til interaksjoner som finnes i et fysiologisk vev. I tillegg til in vitro-systemer kan ex vivo tumor histologi også gi litt innsikt i disse cellecelle- og celle-ECM-interaksjonene17. Immunohistokjemi har fordelen av å kunne analysere flere celletyper med hensyn til den romlig heterogene sammensetningen og arkitekturen til ECM, men de statiske endepunktene i fast vev fanger ikke opp den dynamiske naturen til interaksjoner mellom celler og mikromiljøet. Intravital avbildning har åpnet døren for å forhøre ulike og dynamiske interaksjoner innenfor den fysiologiske konteksten til det opprinnelige tumormikromiljøet.
Evnen til intravital tumoravbildning utvikler seg raskt. Forbedringer i utformingen av bildevinduer og kirurgiske teknikker for å implantere vinduene har gjort det mulig med langvarig langsgående tumoravbildning på en rekke anatomiske steder (dvs. primærsvulst, lymfeknuter, metastatiske steder 18,19,20). Dessuten blir kapasiteten til optisk instrumentering til å visualisere og samle inn data i flere dimensjoner (dvs. spektral, romlig fluorescensintensitet og levetid), og med høy oppløsning og hastighet (videohastighet) allment tilgjengelig. Den forbedrede teknologien gir en mulighet til å utforske raske endringer i cellesignalering og fenotypisk dynamikk i et fysiologisk miljø. Til slutt tillater utvidelsen av optogenetiske verktøy og det brede spekteret av genetiske fluorescerende konstruksjoner tagging av spesifikke celletyper for å fange cellemigrasjon i tumormikromiljøet eller cellelinjesporing under utvikling eller sykdomsprogresjon 21,22. Bruken av disse verktøyene i kombinasjon med CRISPR/Cas9-teknologi gir forskerne mulighet til å generere unike dyremodeller i tide.
Mens alle disse fremskrittene gjør intravital avbildning til en stadig kraftigere metode for å utforske dynamiske og fysiologiske cellulære interaksjoner, er det fortsatt et viktig behov for å utvikle strategier som gir romlig, tidsmessig og strukturell kontekst på vevsnivå til disse biologiske interaksjonene. For tiden kompenserer mange intravitale avbildningsstudier for mangel på visuelle landemerker som blodkar ved å injisere fluorescerende fargestoffer i vaskulaturen eller bruke musemodeller som eksogent uttrykker fluorescerende proteiner for å avgrense fysiske egenskaper. Injiserbare fargestoffer og substrater som fluorescerende dextrans brukes i stor grad til å merke vaskulaturen i intravitale samlinger19, 23, 24. Denne tilnærmingen er imidlertid ikke uten begrensninger. For det første krever det ytterligere musemanipulasjoner, og verktøyet er begrenset til kortsiktige eksperimenter. For langsgående studier kan fluorescerende dextran være problematisk når vi observerer opphopning av dekstran i fagocytiske celler eller diffusjon i det omkringliggende vevet over tid25. Eksogen fluorescerende protein inkorporering i musemodellen har blitt presentert som et alternativ til fluorescerende dextrans, men presenterer begrensninger av seg selv. Tilgjengeligheten og mangfoldet av eksogene fluoroforer i musemodeller er fortsatt begrenset og dyrt å lage. I tillegg, i spesifikke modeller, for eksempel PDX-modeller, er genetiske manipulasjoner ikke ønskelige eller mulige. Det har også vist seg at tilstedeværelsen av fluorescerende eller bioluminescerende proteiner i celler er anerkjent som fremmed i musen, og innenfor immunkompetente musemodeller reduserer dette mengden metastase på grunn av responsen fra vertsimmunsystemet26,27. Til slutt opptar eksogene fluorescerende proteiner eller fluorescerende fargestoffer som brukes til romlig kontekst eller for å segmentere etterfølgende data ofte hovedområder i lysspekteret som ellers kunne brukes til å undersøke de fysiologiske interaksjonene av interesse.
Bruken av det iboende signalet fra ECM eller endogen fluorescens fra celler i vevet representerer et potensielt universelt etikettfritt middel for å segmentere intravitale data for mer dyptgående cellulær og romlig analyse. Andre harmoniske generasjon (SHG) har lenge vært brukt til å visualisere ECM28. Med den påfølgende utviklingen av viktige verktøy for å hjelpe til med karakteriseringen av fiberorganisasjon 29,30,31, er det mulig å karakterisere celleadferd i forhold til lokal ECM-struktur. I tillegg gir autofluorescence fra den endogene metabolitten, NAD (P)H, et annet etikettfritt verktøy for å dele opp tumormikromiljøet in vivo. NAD(P)H fluoresces sterkt i tumorceller og kan brukes til å diskriminere grensene til den voksende svulstreiret fra sin omkringliggende stroma 21,32. Til slutt er vaskulaturen en viktig fysiologisk struktur i tumormikromiljøet og stedet for nøkkelcellespesifikke interaksjoner 33,34,35. Eksitasjonen av røde blodlegemer (RBC) eller blodplasma har blitt brukt til å visualisere tumorvaskulaturen, og ved hjelp av to- eller trefotoneksitasjon (2P; 3P) har målingen av blodstrømshastigheter vist seg å være mulig36. Men mens større blodårer er lett identifiserbare ved deres endogene fluorescenssignaturer, krever identifisering av subtile, variable og mindre fluorescerende små blodkar mer kompetanse. Disse iboende vanskelighetene hindrer optimal bildesegmentering. Heldigvis kan disse kildene til endogen fluorescens (dvs. røde blodlegemer og blodplasma) også måles ved fluorescens levetidsavbildning37, som utnytter de unike fotofysiske egenskapene til vaskulaturen og representerer et nyttig tillegg til den voksende intravitale verktøykassen.
I denne protokollen beskrives en arbeidsflyt for segmentering av firedimensjonal (4D) intravital avbildning eksplisitt ved hjelp av iboende signaler som endogen fluorescens og SHG fra oppkjøp til analyse. Denne protokollen er spesielt relevant for langsgående studier gjennom et pattedyravbildningsvindu der eksogen fluorescens kanskje ikke er praktisk eller mulig, slik tilfellet er med PDX-modeller. Segmenteringsprinsippene som er skissert her, gjelder imidlertid bredt for intravitale brukere som undersøker tumorbiologi, vevsutvikling eller til og med normal vevsfysiologi. Den rapporterte pakken med analysetilnærminger vil tillate brukerne å skille cellulær oppførsel mellom regioner med justerte eller tilfeldige kollagenfiberkonfigurasjoner, sammenligne tall eller oppførsel av celler som bor i bestemte områder av tumormikromiljøet, og kartlegge vaskulaturen til tumormikromiljøet ved hjelp av bare etikettfritt eller iboende signal. Sammen skaper disse metodene et operativt rammeverk for å maksimere dybden av informasjon oppnådd fra 4D intravital avbildning av brystkjertelen samtidig som behovet for ekstra eksogene etiketter minimeres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

Evnen til å visualisere komplekse og dynamiske fysiologiske interaksjoner mellom mange celletyper og den ekstracellulære matrisen (ECM) i et levende tumormikromiljø er et viktig skritt mot å forstå mekanismer som regulerer tumorprogresjon. Selv om dette kan oppnås gjennom dagens intravitale avbildningsteknikker, er det fortsatt utfordrende på grunn av vevets heterogene natur og behovet for romlig kontekst innenfor den eksperimentelle observasjonen. For dette formål har vi utviklet en intravital bildearbeidsflyt som kombinerer kollagen andre harmoniske generasjonsavbildning, endogen fluorescens fra den metabolske kofaktoren NAD (P)H, og fluorescens levetidsavbildningsmikroskopi (FLIM) som et middel til ikke-invasivt å dele opp tumormikromiljøet i grunnleggende domener av tumorreiret, den omkringliggende stroma eller ECM, og vaskulaturen. Denne ikke-invasive protokollen beskriver den trinnvise prosessen som spenner fra oppkjøp av tidsforløpbilder av mammary tumormodeller til etterbehandlingsanalyse og bildesegmentering. Den viktigste fordelen med denne arbeidsflyten er at den utnytter metabolske signaturer for å kontekstualisere det dynamisk skiftende levende tumormikromiljøet uten bruk av eksogene fluorescerende etiketter, noe som gjør det fordelaktig for humane pasientavledede xenograft (PDX) modeller og fremtidig klinisk bruk der ekstrinsiske fluoroforer ikke er lett anvendelige.

Installasjonen av MIW og grunnleggende eksperimentell planlegging er de første trinnene i denne prosessen. Denne spesielle MIW-designen og protokollen er mer egnet til langsgående studier19 og har blitt brukt med både oppreiste og inverterte mikroskoper. I dette tilfellet ble et invertert mikroskop brukt, da det har resultert i større bildestabilitet av brystkjertelen med færre pusteartefakter. I figur 1A gir vi dimensjonene til den stive MIW og en grafisk oversi...

Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Den intravitale avbildningsmetoden som er beskrevet her, bruker kollagen andre harmoniske generasjon og endogen fluorescens fra den metabolske kofaktoren NAD (P)H til ikke-invasivt segmentere et umerket tumormikromiljø i tumor-, stromal- og vaskulære rom for grundig analyse av 4D intravitale bilder.

En etikettfri segmenteringstilnærming for intravital avbildning av mammary tumormikromiljø

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Intravital avbildning gjør at vi kan observere fysiologiske interaksjoner i tumormikromiljøet. Og ved å bruke denne metoden kan spesifikke dynamiske atferd som observeres, deles opp ved hjelp av lokale vevsfunksjoner. Denne protokollen bruker bare et allestedsnærværende etikettfritt signal fra kollagenfibre eller autofluorescent metabolitter for å segmentere TME, og dermed minimere mengden manipulasjoner til musen.Denne metoden er bredt anvendelig for ethvert intravitalt system der det er nødvendig å forstå dynamiske interaksjoner i forhold til ekstracellulære matrisestrukturer eller vaskulære strukturer. Å demonstrere denne prosedyren vil være Dave Inman, senior forskningsspesialist, og Erica Hoffmann, en utdannet student fra laboratoriet. Begynn å forberede et bildevindu for pattedyr ved å suge et 1,5 12 millimeter rundt dekselglass i 100% etanol i 10 minutter, tørk deretter dekkglasset under en varmelampe og fest glasset til metallpattedyrets bildevinduramme ved hjelp av cyanoacrylatlim.Herd limet over natten. Neste dag, bruk en aceton gjennomvåt vattpinne for å rengjøre det monterte mammary bildevinduet til overflødig lim før du senker pattedyrets bildevindu i 70% etanol i minst 10 minutter for å hjelpe til med rensingen. Etter tørking, oppbevar det rensede mammary bildevinduet i en steril Petri-tallerken.Før du begynner operasjonen for vindusimplantasjon, autoklaverer kirurgiske verktøy og desinfiserer overflater med 70% etanol. Forbered en desinfisert bordplate for operasjonen med et varmeteppe dekket med et sterilt felt. Sett varmeteppet slik at temperaturen målt på toppen av det sterile feltet er 40 grader Celsius.Bruk ekstra kaldbelysning og forstørrelsesbriller til kirurgisk prosedyre. Bruk verneutstyr som består av en steril engangs labfrakk, kirurgiske ermer, hansker, øyebeskyttelse og ansiktsmaske. Deretter fjerner du pelsen av den bedøvede musen ved den fjerde inguinale brystkjertelen med en depilatorisk krem og skyll det kirurgiske stedet med en sterilt vann gjennomvåt gasbind.Forbered deretter det depilerte kirurgiske stedet for kirurgi ved å desinfisere hudoverflaten med tre vekslende Betadine- og etanolskrubb. Når du er ferdig, løft huden forsiktig over brystkjertelen nummer fire ved hjelp av tang. Når huden er trukket bort fra kroppsveggen, fjern en millimeter del av det dermale laget på spissen av tangene med kirurgiske mikroscissorer.Uten å kutte den underliggende kjertelen, lag et 10 millimeter snitt og slipp deretter brystkjertelen fra det dermale laget med den milde bevegelsen av tangene. Tilsett PBS for å dekke den eksponerte kjertelen. Bruk en 5-0 silke flettet sutur for å lage en veskestreng sutur langs periferien av åpningen, og sett deretter inn en kant av pattedyrets bildevindu slik at det dermale laget engasjerer seg i det mottakende hakket i pattedyravbildningsvinduet.Mens du strekker epitelet i motsatt ende av pattedyrets bildevindu, skyver du metallpattedyrets bildevindu på plass slik at dermallaget fullt ut engasjerer det mottakende hakket rundt hele mammary imaging vindu omkretsen. Deretter klemmer du veskestrengen for å trekke det dermale laget inn i hakket og knytte av laget for å sikre vinduet. Påfør et aktuelt antibiotika på det dermale laget ved pattedyrets bildevindu og overvåk musen kontinuerlig.Etter å ha gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal heftelse, huse bryst bildevinduet implantert mus separat på mykt sengetøy med en iglo plassert i buret og la musen gjenopprette i 48 timer før avbildning. For avbildningen, bruk et tvungent luftsystem satt til 30 grader Celsius. Bruk en ekstra objektiv varmeapparat for å unngå drift i Z-fokus og la systemet komme til likevekt ved 30 grader Celsius i minst en time før avbildning.Sett deretter opp et varmekammer på mikroskopstadiet. Etter å ha bekreftet anestesi med tåklemmemetoden, legg til en øyesalve til musen. For å opprettholde riktig hydrering, injiser 0,5 milliliter PBS subkutant annenhver time i løpet av bildeøkten.Påfør en vannbasert gel i stedet for vann på målet og rengjør utsiden av pattedyrets bildevinduglass med en bomullsapplikator og glassrenser før du overfører musen til det forvarmede mikroskopstadiet. Etter å ha lagt musen på mikroskopstadiet, trykker du kragen til pattedyrets bildevindu inn i et 14 millimeter mottakshull i sceneinnlegget for å stabilisere bildene og montere isofluranslangen. Ta deretter bildefeltet i fokus ved hjelp av mikroskopet okular og Brightfield belysning, observere vaskulatur med blodstrøm.Kontroller stabiliteten til synsfeltet. Hvis pustebevegelsesartefakter er til stede, bruk forsiktig kompresjon på baksiden av kjertelen med en liten skumblokk og et cincture-lignende stykke tape. Når kompresjon er påført, kontroller at blodstrømmen opprettholdes gjennom hele synsfeltet.Når musen er bedøvet og sikkert plassert på det omvendte mikroskopstadiet, begynner du å finne interesseområder. Bruk en lyskilde rettet mot pattedyravbildningsvinduet, bruk mikroskopets okularer for å identifisere potensielle områder for undersøkelse. Fokuset bør være på å se vaskulatur og blodstrøm.Legg til og lagre XY-posisjonene i programvaren. Når de riktige effektnivåene er satt, setter du opp Z-stabelen og observerer utseendet på rikelig kollagenfibre på 20 til 50 mikrometer under glassoverflaten til mammary imaging-vinduet. Kollagen vil bli mindre utbredt når mikroskopseksjonene dypere inn i svulsten.Hulrommene i den andre harmoniske generasjonen eller SHG avslører plasseringen av tumormasser. Sett den øverste Z-skive under laget av ensomme celler med de første kollagenfibrene vises på 50 til 100 mikron. Sett den nederste Z-skive på 250 mikrometer der fibrene falmer ut og det dårlige signalet dominerer.Gjenta deretter prosedyren for alle XY-posisjoner som er lagret. Når Z-stakkområdet er angitt, øker du oppholdstiden til åtte mikrosekonds og optimaliserer strøm- og detektorinnstillingene. Optimaliser effektnivåene som trengs for å begeistre vevet for hvert eksperiment og bruke krefter opp til 90 milliwatt ved 750 nanometer eller 70 milliwatt ved 890 nanometer ved bakåpningen av målet.Deretter starter du med 10-minutters intervaller mellom samlingspunkter for de fleste intravitale migreringsfilmer og justerer tidsintervallene i henhold til eksperimentelle mål. Hvis tegn på fototoksisitet som celleblebbing eller raskt økende autofluorescence og overdreven fotobleaching observeres, redusere laserkraft eller øke tidsforløp intervaller som forholdene indikerer. For fluorescenslevetidsavbildning eller FLIM av NADPH, start forhåndsvisningsskanning og juster lasereffekten til avlesningen av den konstante fraksjonsdiskriminatoren eller CFD er mellom 10 og den femte og 10 til den sjette.Overskridelse av CFD utover 10 til det sjette resultatet i photon pileup og dårlige samlede resultater. Når effektnivået er stilt inn, angir du integrasjonstiden mellom 90 og 120 sekunder og starter FLIM-samlingen for å hente fotoner fra synsfeltet for den tildelte tiden. Et typisk synsfelt i en etikettfri mammarysvulst viste rikelig kollagenfibre nær vinduet og en reduksjon i overflod dypere inn i svulsten.Bruken av fluorescenslevetid eller NADPH hjalp til med å identifisere vaskulaturen. Noen mørke områder på bildene var tumorfolder eller butting opp av tilstøtende tumor lobes. For å identifisere vaskulatur ble et sammensatt bilde ved hjelp av NDPH FLIM validert ved å sammenligne maksimal intensitetsprojeksjoner av den intravitale stabelen før og etter hale veneinjeksjon av fluorescerende dekstran.Den representative analysen viser kvantifiseringen av fire mus og synsfeltene. For å avgrense grensene til de etikettfrie tumormassene ble NADPH autofluorescence brukt. Bildene rapporterte cellenes metabolske signaturer og plasseringen av blodårene.AFD-autofluorescensen identifiserte også makrofagene. Med segmenteringsordningen ble den etikettfrie svulsten segmentert i rom for tumorreiret, stroma og vaskulatur ved hjelp av bare SHG og NADPH autofluorescence. I tillegg kan stroma- og kollagenfibrene også klassifiseres i lokale regioner av de justerte fibrene.Det viktigste å huske for denne protokollen er å sørge for at musen er riktig bedøvet og begrenset slik at synsfeltet forblir stabilt for avbildning.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

En Mimic av svulstens mikromiljø: En enkel metode for å generere beriket celle populasjoner og Gransker inter Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

En Time-lapse, etikett-fri, kvantitativ fase tenkelig studie av sovende og aktive menneskelige kreftceller

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide berikelse kombinert med etikett-fri kvantitative massespektrometri å undersøke Phosphoproteome i prostatakreft

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Langsgående Intravital Imaging av Brain tumor Cell atferd som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Vurdere tumor Mikromiljøet av metastasering døråpning-mediert vaskulær permeabilitet forbundet med kreft Cell formidling bruker Intravital Imaging og fast vev analyse

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse av sidepopulasjon i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Modulert 3D Tumor Sfæroid Modell for å studere tumor-Stroma interaksjon og narkotika oppdagelse

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering av proksimale væsker for å undersøke tumormikromiljøet i bukspyttkjerteladenokarsinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Langsgående intravital avbildning gjennom klare silikonvinduer

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Industrialisert, kunstig intelligens-guidet lasermikrodesisseksjon for mikroskalert proteomisk analyse av tumormikromiljøet

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...