Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить гранты NCI R01 CA216248, CA206458 и CA179556 для финансирования этой работы. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Кевина Элисейри и его группу визуализации за их технический опыт в ранней разработке нашей прижизненной программы. Мы также благодарим д-ра Бена Кокса и других членов Eliceiri Fabrication Group в Научно-исследовательском институте Моргриджа за их важный технический дизайн на ранних этапах MIW. Д-р Эллен Добсон помогла провести полезные беседы об обучаемом инструменте сегментации WEKA ImageJ. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить доктора Мелиссу Скалу и доктора Алексу Баррес-Хитон за своевременное использование их микроскопа. Наконец, мы хотели бы поблагодарить д-ра Брижит Раабе, D.V.M., за все вдумчивые обсуждения и советы по обращению с нашими мышами и уходу за ними.

Все описанные эксперименты были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Висконсин-Мэдисон. Благополучие и лечение боли во всех экспериментах на животных имеет первостепенное значение. Таким образом, прилагаются все усилия, чтобы убедить?...

4D-прижизненная визуализация является мощным инструментом для исследования динамических физиологических взаимодействий в пространственном и временном контексте микроокружения нативной опухоли. Эта рукопись обеспечивает очень простую и адаптируемую операционную структуру для разд...

Известно, что внеклеточный матрикс (ECM) в микроокружении опухоли динамически депонируется и ремоделируется несколькими типами клеток для дальнейшего облегчения прогрессирования заболевания 1,2,3. Эти изменения матрицы обеспечивают как механические, так и биологические сигналы, которые изменяют поведение клеток и часто приводят к непрерывному циклу ремоделированияматрицы 4. Исследование динамического, реципрокного взаимодействия между опухолевыми клетками и внеклеточным матриксом часто проводится с использованием трехмерной (3D) культуры in vitro или микрофлюидных систем. В то время как эти подходы снизу вверх продемонстрировали механизмы ремоделирования ECM 5,6,7, увеличения пролиферации8, эпителиального перехода в мезенхимальное 9,10,11,12 и миграции и инвазии опухолевых клеток 7,13,14,15,16 , их внимание было сосредоточено в основном на нескольких типах клеток (например, опухолевых клетках или фибробластах) в однородной 3D-матрице по сравнению с разнообразием и неоднородностью взаимодействий, присутствующих в физиологической ткани. В дополнение к системам in vitro, гистология опухоли ex vivo также может дать некоторое представление об этих взаимодействиях клетка-клетка и клетка-ECM17. Иммуногистохимия имеет то преимущество, что может анализировать несколько типов клеток относительно пространственно неоднородного состава и архитектуры ECM, но статические конечные точки фиксированной ткани не отражают динамический характер взаимодействий между клетками и микросредой. Прижизненная визуализация открыла дверь для изучения разнообразных и динамических взаимодействий в физиологическом контексте микроокружения нативной опухоли.
Возможности прижизненной визуализации опухоли быстро развиваются. Усовершенствования в конструкции окон визуализации и хирургические методы имплантации окон позволили проводить долгосрочную продольную визуализацию опухоли в различных анатомических местах (т.е. первичная опухоль, лимфатические узлы, метастатические участки 18,19,20). Кроме того, способность оптических приборов визуализировать и собирать данные в нескольких измерениях (т.е. спектральных, пространственных флуоресцентных интенсивностях и сроке службы), а также при высоком разрешении и скорости (скорости видео) становится широко доступной. Усовершенствованная технология дает возможность исследовать быстрые изменения клеточной сигнализации и фенотипической динамики в физиологической среде. Наконец, расширение оптогенетических инструментов и широкий спектр генетических флуоресцентных конструкций позволяют маркировать конкретные типы клеток для захвата миграции клеток в микроокружении опухоли или отслеживания клеточной линии во время развития или прогрессирования заболевания21,22. Использование этих инструментов в сочетании с технологией CRISPR/Cas9 дает исследователям возможность своевременно генерировать уникальные модели животных.
Хотя все эти достижения делают прижизненную визуализацию все более мощным методом изучения динамических и физиологических клеточных взаимодействий, по-прежнему существует важная необходимость в разработке стратегий, которые обеспечивают пространственный, временный и структурный контекст на тканевом уровне для этих биологических взаимодействий. В настоящее время многие исследования прижизненной визуализации компенсируют отсутствие визуальных ориентиров, таких как кровеносные сосуды, путем введения флуоресцентных красителей в сосудистую систему или использования мышиных моделей, которые экзогенно экспрессируют флуоресцентные белки для очерчивания физических особенностей. Инъекционные красители и субстраты, такие как флуоресцентный декстранс, широко используются для успешной маркировки сосудистой системы в прижизненных коллекциях19, 23, 24. Однако такой подход не лишен ограничений. Во-первых, он требует дополнительных манипуляций с мышью, и его полезность ограничена краткосрочными экспериментами. Для продольных исследований флуоресцентный декстран может быть проблематичным, поскольку мы наблюдаем накопление декстрана в фагоцитарных клетках или диффузию в окружающие ткани с течением времени25. Включение экзогенного флуоресцентного белка в модель мыши было представлено в качестве альтернативы флуоресцентному декстрансу, но имеет свои собственные ограничения. Доступность и разнообразие экзогенных флуорофоров в мышиных моделях по-прежнему ограничены и дороги в создании. Кроме того, в конкретных моделях, таких как модели PDX, генетические манипуляции нежелательны или невозможны. Также было показано, что присутствие флуоресцентных или биолюминесцентных белков в клетках распознается как чужеродное внутри мыши, а в иммунокомпетентных мышиных моделях это уменьшает количество метастазов из-за реакции иммунной системы хозяина26,27. Наконец, экзогенные флуоресцентные белки или флуоресцентные красители, используемые для пространственного контекста или для сегментации последующих данных, часто занимают основные диапазоны светового спектра, которые в противном случае могли бы быть использованы для исследования физиологических взаимодействий, представляющих интерес.
Использование внутреннего сигнала от ECM или эндогенной флуоресценции от клеток внутри ткани представляет собой потенциальное универсальное средство без меток для сегментации прижизненных данных для более глубокого клеточного и пространственного анализа. Второе поколение гармоник (SHG) уже давно используется для визуализации ECM28. С последующей разработкой важных инструментов, помогающих в характеристике организации волокон 29,30,31, можно охарактеризовать поведение клеток относительно локальной структуры ECM. Кроме того, аутофлуоресценция из эндогенного метаболита NAD(P)H обеспечивает еще один инструмент без меток для разделения микроокружения опухоли in vivo. NAD(P)H ярко флуоресцирует в опухолевых клетках и может быть использован для различения границ растущего опухолевого гнезда от окружающей егостромы 21,32. Наконец, сосудистая система является важной физиологической структурой в микроокружении опухоли и местом ключевых клеточных специфических взаимодействий 33,34,35. Возбуждение эритроцитов (эритроцитов) или плазмы крови было использовано для визуализации сосудистой системы опухоли, и с помощью двух- или трехфотонного возбуждения (2P; 3P) было показано, что измерение скорости кровотока возможно36. Однако, в то время как более крупные кровеносные сосуды легко идентифицируются по их эндогенным флуоресцентным сигнатурам, идентификация тонких, переменных и менее флуоресцентных мелких кровеносных сосудов требует большего опыта. Эти неотъемлемые трудности препятствуют оптимальной сегментации изображения. К счастью, эти источники эндогенной флуоресценции (т.е. эритроциты и плазма крови) также могут быть измерены с помощью флуоресцентной визуализации37, которая извлекает выгоду из уникальных фотофизических свойств сосудистой системы и представляет собой полезное дополнение к растущему набору инструментов прижизненного нерва.
В этом протоколе описан рабочий процесс сегментации четырехмерной (4D) прижизненной визуализации с явным использованием внутренних сигналов, таких как эндогенная флуоресценция и SHG, от сбора до анализа. Этот протокол особенно актуален для продольных исследований через окно визуализации молочной железы, где экзогенная флуоресценция может быть непрактичной или невозможной, как в случае с моделями PDX. Однако принципы сегментации, изложенные здесь, широко применимы к прижизненным пользователям, изучающим биологию опухоли, развитие тканей или даже нормальную физиологию тканей. Представленный набор подходов к анализу позволит пользователям дифференцировать клеточное поведение между областями выровненных или случайных конфигураций коллагеновых волокон, сравнивать количество или поведение клеток, проживающих в определенных областях микроокружения опухоли, и сопоставлять сосудистую систему с микроокружением опухоли, используя только безмечажный или внутренний сигнал. Вместе эти методы создают операционную основу для максимизации глубины информации, получаемой от 4D-прижизненной визуализации молочной железы, сводя к минимуму необходимость в дополнительных экзогенных метках.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

Способность визуализировать сложные и динамические физиологические взаимодействия между многочисленными типами клеток и внеклеточным матриксом (ECM) в микроокружении живой опухоли является важным шагом на пути к пониманию механизмов, которые регулируют прогрессирование опухоли. Хотя это может быть достигнуто с помощью современных методов прижизненной визуализации, это остается сложным из-за гетерогенной природы тканей и необходимости пространственного контекста в рамках экспериментального наблюдения. С этой целью мы разработали рабочий процесс прижизненной визуализации, который сочетает в себе визуализацию коллагена второй гармонической генерации, эндогенную флуоресценцию из метаболического кофактора NAD(P)H и флуоресцентную пожизненную визуализационную микроскопию (FLIM) в качестве средства неинвазивного разделения микроокружения опухоли на основные домены опухолевого гнезда, окружающей стромы или ECM и сосудистой системы. Этот неинвазивный протокол детализирует пошаговый процесс, начиная от получения покадровых изображений моделей опухолей молочной железы до постобработочного анализа и сегментации изображений. Основным преимуществом этого рабочего процесса является то, что он использует метаболические сигнатуры для контекстуализации динамически изменяющегося микроокружения живой опухоли без использования экзогенных флуоресцентных меток, что делает его выгодным для моделей ксенотрансплантата (PDX), полученных от пациентов, и будущего клинического использования, где внешние флуорофоры не всегда применимы.

Установка MIW и базовое экспериментальное планирование являются первыми шагами в этом процессе. Эта конкретная конструкция и протокол MIW более поддаются продольным исследованиям19 и успешно используются как с вертикальными, так и с инвертированными микроскопами. В этом слу...

Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Описанный здесь метод прижизненной визуализации использует вторую гармоническую генерацию коллагена и эндогенную флуоресценцию от метаболического кофактора NAD(P)H до неинвазивного сегментирования немаркированного микроокружения опухоли в опухолевые, стромальные и сосудистые компартменты для углубленного анализа 4D-прижизненных изображений.

Подход к сегментации без меток для прижизненной визуализации микроокружения опухоли молочной железы

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Прижизненная визуализация позволяет наблюдать физиологические взаимодействия в микроокружении опухоли. И с помощью этого метода специфическое динамическое поведение, которое наблюдается, может быть разделено с использованием местных особенностей ткани. Этот протокол использует только вездесущий сигнал без меток от коллагеновых волокон или автофлуоресцентных метаболитов для сегментации TME, тем самым сводя к минимуму количество манипуляций с мышью.Этот метод широко применим к любой прижизненной системе, где требуется понимание динамических взаимодействий относительно структур внеклеточного матрикса или сосудистых структур. Продемонстрировать эту процедуру будут Дэйв Инман, старший научный специалист, и Эрика Хоффманн, аспирант из лаборатории. Начните подготовку стекла для молочной визуализации, замачивая 1,5 12-миллиметровое круглое покровное стекло в 100% этаноле в течение 10 минут, затем высушите покровное стекло под тепловой лампой и закрепите стекло на металлической раме окна для визуализации молочной железы с помощью цианоакрилатного клея.Отверните клей в течение ночи. На следующий день используйте пропитанный ацетоном тампон, чтобы очистить собранное окно визуализации молочной железы от избытка клея, прежде чем погружать окно визуализации молочной железы в 70% этанол в течение не менее 10 минут, чтобы помочь с очисткой. После высыхания храните очищенное окно для визуализации молочной железы в стерильной чашке Петри.Перед началом операции по имплантации окна автоклавные хирургические инструменты и дезинфицируют поверхности 70% этанолом. Подготовьте продезинфицированную столешницу для операции согревающим одеялом, покрытым стерильным полем. Установите согревающее одеяло таким образом, чтобы температура, измеренная поверх стерильного поля, составляла 40 градусов по Цельсию.Используйте вспомогательное холодное освещение и увеличительные стекла для хирургической процедуры. Носите СИЗ, состоящие из стерильного одноразового лабораторного халата, хирургических рукавов, перчаток, защиты глаз и маски для лица. Далее удалить мех обезболенной мыши на четвертой паховой молочной железе кремом для депиляции и промыть место операции стерильной пропитанной водой марлей.Затем подготовьте депилированный хирургический участок к операции, продезинфицировав поверхность кожи тремя чередующимися скрабами бетадина и этанола. Когда это будет сделано, аккуратно поднимите кожу над молочной железой номер четыре с помощью щипцов. Как только кожа будет оттянута от стенки тела, удалите один миллиметровый участок кожного слоя на кончике щипцов хирургическими микросублицаторами.Не разрезая подлежащую железу, создайте 10-миллиметровый разрез и затем выпустите молочную железу из дермального слоя мягким движением щипцов. Добавьте PBS, чтобы покрыть открытую железу. Используйте 5-0 шелковый плетеный шов, чтобы создать шов кошельковой струны по периферии отверстия, затем вставьте край окна визуализации молочной железы так, чтобы кожный слой зацеплялся в приемную выемку окна визуализации молочной железы.Растягивая эпителий на противоположном конце окна визуализации молочной железы, подтолкните металлическое окно визуализации молочной железы на место, чтобы дермальный слой полностью задействовал приемную выемку вокруг всей окружности окна визуализации молочной железы. Затем зажмите нить кошелька, чтобы втянуть дермальный слой в выемку и отвязать слой, чтобы закрепить окно. Нанесите местный антибиотик на кожный слой в окне визуализации молочной железы и постоянно контролируйте мышь.После восстановления достаточного сознания для поддержания стернальной лежачих мышц поместите окно визуализации молочной железы, имплантированное мыши отдельно на мягкую подстилку с иглу, помещенным в клетку, и позвольте мыши восстановиться в течение 48 часов до визуализации. Для визуализации используйте систему принудительного воздуха, установленную на 30 градусов цельсия. Используйте дополнительный объективный нагреватель, чтобы избежать дрейфа в Z-фокусе и позволить системе прийти к равновесию при 30 градусах Цельсия в течение по крайней мере одного часа до визуализации.Затем установите нагревательную камеру на сцене микроскопа. После подтверждения анестезии методом защемления пальца ноги добавьте мыши глазную мазь. Для поддержания надлежащей гидратации вводите 0,5 миллилитра PBS подкожно каждые два часа в течение всего сеанса визуализации.Нанесите гель на водной основе вместо воды на цель и очистите внешнюю сторону оконного стекла молочной железы с помощью хлопкового аппликатора и очистителя стекла перед переносом мыши на предварительно нагретую стадию микроскопа. После укладки мыши на ступень микроскопа нажмите на воротник окна визуализации молочной железы в 14-миллиметровое приемное отверстие в сценической вставке, чтобы стабилизировать изображения и подогнать шланг изофлурана. Затем сфокусируйте поле визуализации с помощью микроскопа и подсветки Брайтфилда, наблюдая за сосудистой системой с кровотоком.Проверьте стабильность поля зрения. Если присутствуют артефакты дыхательного движения, нанесите мягкое сжатие на заднюю сторону железы с помощью небольшого пеноблока и куска клейкой ленты. После применения компрессии убедитесь, что кровоток поддерживается по всему полю зрения.Как только мышь будет успокоена и надежно расположена на сцене перевернутого микроскопа, начните находить интересующие области. Используя источник света, направленный на окно визуализации молочной железы, используйте окуляры микроскопа для определения потенциальных областей для исследования. Основное внимание должно быть сосредоточено на наблюдении сосудистой системы и кровотока.Добавьте и сохраните позиции XY в программном обеспечении. Когда соответствующие уровни мощности установлены, настройте стек Z и наблюдайте за появлением обильных коллагеновых волокон на расстоянии от 20 до 50 микрометров под стеклянной поверхностью окна визуализации молочной железы. Коллаген станет менее распространенным, поскольку микроскоп глубже проникает в опухоль.Пустоты второго гармонического поколения или SHG выявляют расположение опухолевых масс. Установите верхний Z-срез под слоем одиночных клеток, при этом первые коллагеновые волокна появляются на уровне от 50 до 100 микрон. Установите нижний Z-срез на 250 микрометров, где волокна исчезают и доминирует плохой сигнал.Затем повторите процедуру для всех сохраненных позиций XY. После установки диапазона стека Z увеличьте время ожидания до восьми микросекунд и оптимизируйте мощность и настройки детектора. Оптимизируйте уровни мощности, необходимые для возбуждения ткани для каждого эксперимента, и используйте мощность до 90 милливатт на 750 нанометрах или 70 милливатт на 890 нанометрах на задней апертуре объектива.Затем начните с 10-минутных интервалов между точками сбора для большинства фильмов о прижизненной миграции и скорректируйте временные интервалы в соответствии с экспериментальными целями. Если наблюдаются признаки фототоксичности, такие как блеббинг клеток или быстро увеличивающаяся автофлуоресценция и чрезмерное фотоотбеливание, уменьшите мощность лазера или увеличьте интервалы замедления, как показывают условия. Для флуоресцентной визуализации в течение срока службы или FLIM NADPH начните предварительное сканирование и отрегулируйте мощность лазера до тех пор, пока считывание постоянной фракции дискриминатора или CFD не составит от 10 до пятого и от 10 до шестого.Превышение CFD выше 10 до шестого приводит к накоплению фотонов и плохим общим результатам. После установки уровня мощности установите время интеграции от 90 до 120 секунд и запустите коллекцию FLIM для получения фотонов из поля зрения в течение отведенного времени. Типичное поле зрения в опухоли молочной железы без меток продемонстрировало обильные коллагеновые волокна возле окна и уменьшение изобилия глубже в опухоль.Использование флуоресцентного времени жизни или NADPH помогло в идентификации сосудистой системы. Некоторые темные области на изображениях представляли собой опухолевые складки или стыковку соседних долей опухоли. Чтобы идентифицировать сосудистую систему, составное изображение с использованием NDPH FLIM было проверено путем сравнения проекций максимальной интенсивности прижизненного стека до и после инъекции флуоресцентного декстрана в хвостовую вену.Репрезентативный анализ показывает количественную оценку четырех мышей и полей зрения. Для очерчивания границ безметичных опухолевых масс использовалась автофлуоресценция NADPH. Изображения сообщали о метаболических сигнатурах клеток и расположении кровеносных сосудов.Автофлуоресценция AFD также идентифицировала макрофаги. Со схемой сегментации опухоль без меток была сегментирована на компартменты для опухолевого гнезда, стромы и сосудистой системы с использованием только автофлуоресценции SHG и NADPH. Кроме того, волокна стромы и коллагена также могут быть классифицированы по локальным областям выровненных волокон.Самое главное, что нужно помнить для этого протокола, это убедиться, что мышь правильно успокаивается и удерживается, чтобы поле зрения оставалось стабильным для визуализации.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Мимической опухолевого микроокружения: Простой метод для генерации обогащается мобильных групп населения и исследование межклеточной коммуникации

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

Промежуток времени, метки бесплатно, количественные фаза изображений исследования активных и неактивных человеческих раковых клеток

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide обогащения, в сочетании с Label бесплатно количественного масс-спектрометрии для расследования Phosphoproteome рака простаты

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Продольная интравитальная визуализация поведения опухолевых клеток головного мозга в ответ на инвазивную хирургическую биопсию

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Оценка опухолевой микросреды метастазов Doorway-Mediated Сосудистая проницаемость, связанная с распространением раковых клеток с помощью интравитального изображения и фиксированного анализа тканей

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Роман Стромальный Фибробласт-Модулированные 3D опухолевой сфероидной модели для изучения опухоли-Строма Взаимодействия и наркотиков Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Выделение проксимальных жидкостей для исследования микроокружения опухоли аденокарциномы поджелудочной железы

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Продольная прижизненная визуализация через прозрачные силиконовые окна

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Индустриализированная лазерная микродиссекция с искусственным интеллектом для микромасштабированного протеомного анализа микроокружения опухоли

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...