Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

Los autores desean agradecer las subvenciones del NCI R01 CA216248, CA206458 y CA179556 por financiar este trabajo. También nos gustaría agradecer al Dr. Kevin Eliceiri y su grupo de imágenes por su experiencia técnica en el desarrollo temprano de nuestro programa intravital. También agradecemos al Dr. Ben Cox y a otros miembros del Grupo de Fabricación Eliceiri en el Instituto Morgridge de Investigación por su diseño técnico esencial durante las primeras fases del MIW. Ellen Dobson ayudó con conversaciones útiles sobre la herramienta de segmentación WEKA entrenable ImageJ. Además, nos gustaría agradecer a la Dra. Melissa Skala y a la Dra. Alexa Barres-Heaton por el uso oportuno de su microscopio. Por último, nos gustaría agradecer a la Dra. Brigitte Raabe, D.V.M, por todas las discusiones reflexivas y consejos sobre nuestro manejo y cuidado del ratón.

Todos los experimentos descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison. El bienestar y el manejo del dolor en todos los experimentos con animales es primordial. Por lo tanto, se hace todo lo posible para asegurarse de que el animal esté cómodo y bien cuidado en cada paso del procedimiento.
1. Generación de la ventana de imagen mamaria (MIW)
<ol><li>Para construir la ventana de imágenes mamarias, ...

La imagen intravital 4D es una herramienta poderosa para investigar interacciones fisiológicas dinámicas dentro del contexto espacial y temporal del microambiente tumoral nativo. Este manuscrito proporciona un marco operativo muy básico y adaptable para compartimentar las interacciones celulares dinámicas dentro de la masa tumoral, el estroma adyacente o dentro de la proximidad a la red vascular utilizando solo señales endógenas de segunda generación armónica o autofluorescencia NAD(P)H. Este protocolo proporcion...

Se sabe que la matriz extracelular (ECM) en el microambiente tumoral se deposita y remodela dinámicamente por múltiples tipos de células para facilitar aún más la progresión de la enfermedad 1,2,3. Estas alteraciones de la matriz proporcionan señales mecánicas y biológicas que alteran el comportamiento celular y, a menudo, resultan en un ciclo continuo de remodelación de la matriz4. La investigación sobre la interacción dinámica y recíproca entre las células tumorales y la matriz extracelular a menudo se lleva a cabo utilizando sistemas tridimensionales (3D) de cultivo in vitro o microfluídicos. Si bien estos enfoques de abajo hacia arriba han demostrado mecanismos de remodelación de la ECM 5,6,7, aumento de la proliferación 8, transición epitelial a mesenquimal 9,10,11,12 y migración e invasión de células tumorales 7,13,14,15,16 , su enfoque se ha centrado principalmente en unos pocos tipos de células (por ejemplo, células tumorales o fibroblastos) dentro de una matriz 3D homogénea en comparación con la diversidad y heterogeneidad de las interacciones presentes dentro de un tejido fisiológico. Además de los sistemas in vitro, la histología tumoral ex vivo también puede proporcionar cierta información sobre estas interacciones célula-célula y célula-ECM17. La inmunohistoquímica tiene la ventaja de poder analizar múltiples tipos de células con respecto a la composición espacialmente heterogénea y la arquitectura de la ECM, pero los puntos finales estáticos del tejido fijo no capturan la naturaleza dinámica de las interacciones entre las células y el microambiente. Las imágenes intravitales han abierto la puerta a interrogar interacciones diversas y dinámicas dentro del contexto fisiológico del microambiente tumoral nativo.
Las capacidades de las imágenes tumorales intravitales están avanzando rápidamente. Las mejoras en el diseño de ventanas de imágenes y las técnicas quirúrgicas para implantar las ventanas han permitido la obtención de imágenes tumorales longitudinales a largo plazo en una variedad de ubicaciones anatómicas (es decir, tumor primario, ganglios linfáticos, sitios metastásicos 18,19,20). Además, la capacidad de la instrumentación óptica para visualizar y recopilar datos en múltiples dimensiones (es decir, espectral, intensidad de fluorescencia espacial y vida útil), y a alta resolución y velocidad (velocidad de video) se está volviendo ampliamente accesible. La tecnología mejorada brinda la oportunidad de explorar cambios rápidos en la señalización celular y la dinámica fenotípica dentro de un entorno fisiológico. Por último, la expansión de las herramientas optogenéticas y la amplia gama de construcciones fluorescentes genéticas permiten el etiquetado de tipos celulares específicos para capturar la migración celular en el microambiente tumoral o el rastreo del linaje celular durante el desarrollo o la progresión de la enfermedad21,22. El uso de estas herramientas en combinación con la tecnología CRISPR / Cas9 brinda a los investigadores la oportunidad de generar modelos animales únicos de manera oportuna.
Si bien todos estos avances hacen que las imágenes intravitales sean un método cada vez más poderoso para explorar las interacciones celulares dinámicas y fisiológicas, todavía existe una necesidad importante de desarrollar estrategias que proporcionen un contexto espacial, temporal y estructural a nivel tisular a estas interacciones biológicas. Actualmente, muchos estudios de imágenes intravitales compensan la falta de puntos de referencia visuales, como los vasos sanguíneos, inyectando tintes fluorescentes en la vasculatura o empleando modelos de ratón que expresan exógenamente proteínas fluorescentes para delinear las características físicas. Los colorantes inyectables y los sustratos como el dextrans fluorescente se utilizan ampliamente para etiquetar con éxito la vasculatura en colecciones intravitales19, 23, 24. Sin embargo, este enfoque no está exento de limitaciones. Por un lado, requiere manipulaciones adicionales del ratón y su utilidad se limita a experimentos a corto plazo. Para estudios longitudinales, el dextrano fluorescente puede ser problemático ya que observamos la acumulación de dextrano en las células fagocíticas o la difusión en el tejido circundante a lo largo del tiempo25. La incorporación de proteína fluorescente exógena en el modelo de ratón se ha presentado como una alternativa al dextrans fluorescente pero presenta limitaciones propias. La disponibilidad y diversidad de fluoróforos exógenos dentro de los modelos de ratón siguen siendo limitadas y costosas de crear. Además, en modelos específicos, como los modelos PDX, las manipulaciones genéticas no son deseables ni posibles. También se ha demostrado que la presencia de proteínas fluorescentes o bioluminiscentes dentro de las células se reconocen como extrañas dentro del ratón, y dentro de los modelos de ratón inmunocompetentes, esto reduce la cantidad de metástasis debido a la respuesta del sistema inmune huésped26,27. Por último, las proteínas fluorescentes exógenas o los colorantes fluorescentes utilizados para el contexto espacial o para segmentar datos posteriores a menudo ocupan rangos primos del espectro de luz que de otro modo podrían usarse para investigar las interacciones fisiológicas de interés.
El uso de la señal intrínseca de la ECM o fluorescencia endógena de las células dentro del tejido representa un medio potencial universal sin etiquetas para segmentar los datos intravitales para un análisis celular y espacial más profundo. La segunda generación armónica (SHG) se ha utilizado durante mucho tiempo para visualizar el ECM28. Con el posterior desarrollo de herramientas importantes para ayudar en la caracterización de la organización de la fibra 29,30,31, es posible caracterizar el comportamiento celular en relación con la estructura local de ECM. Además, la autofluorescencia del metabolito endógeno, NAD(P)H, proporciona otra herramienta sin etiquetas para compartimentar el microambiente tumoral in vivo. NAD(P)H fluorescencia intensamente en las células tumorales y se puede utilizar para discriminar los límites del nido tumoral en crecimiento de su estroma circundante21,32. Por último, la vasculatura es una estructura fisiológica importante en el microambiente tumoral y el sitio de interacciones clave específicas del tipo celular 33,34,35. La excitación de los glóbulos rojos (RBC) o plasma sanguíneo se ha utilizado para visualizar la vasculatura tumoral, y utilizando la excitación de dos o tres fotones (2P; 3P) se ha demostrado que la medición de las tasas de flujo sanguíneo es posible36. Sin embargo, mientras que los vasos sanguíneos más grandes son fácilmente identificables por sus firmas de fluorescencia endógena, la identificación de vasos sanguíneos pequeños sutiles, variables y menos fluorescentes requiere más experiencia. Estas dificultades inherentes dificultan la segmentación óptima de la imagen. Afortunadamente, estas fuentes de fluorescencia endógena (es decir, glóbulos rojos y plasma sanguíneo) también se pueden medir mediante imágenes de fluorescencia de por vida37, que capitalizan las propiedades fotofísicas únicas de la vasculatura y representan una adición útil a la creciente caja de herramientas intravital.
En este protocolo, se describe un flujo de trabajo para la segmentación de imágenes intravitales de cuatro dimensiones (4D) utilizando explícitamente señales intrínsecas como la fluorescencia endógena y SHG desde la adquisición hasta el análisis. Este protocolo es particularmente pertinente para estudios longitudinales a través de una ventana de imágenes mamarias donde la fluorescencia exógena puede no ser práctica o posible, como es el caso de los modelos PDX. Los principios de segmentación descritos aquí, sin embargo, son ampliamente aplicables a los usuarios intravitales que investigan la biología tumoral, el desarrollo de tejidos o incluso la fisiología normal de los tejidos. El conjunto de enfoques de análisis reportado permitirá a los usuarios diferenciar el comportamiento celular entre regiones de configuraciones de fibra de colágeno alineadas o aleatorias, comparar números o comportamientos de células que residen en regiones específicas del microambiente tumoral y mapear la vasculatura al microambiente tumoral utilizando solo señal intrínseco o sin etiquetas. Juntos, estos métodos crean un marco operativo para maximizar la profundidad de la información obtenida de las imágenes intravitales 4D de la glándula mamaria al tiempo que minimizan la necesidad de etiquetas exógenas adicionales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

La capacidad de visualizar interacciones fisiológicas complejas y dinámicas entre numerosos tipos de células y la matriz extracelular (ECM) dentro de un microambiente tumoral vivo es un paso importante hacia la comprensión de los mecanismos que regulan la progresión del tumor. Si bien esto se puede lograr a través de las técnicas actuales de imágenes intravitales, sigue siendo un desafío debido a la naturaleza heterogénea de los tejidos y la necesidad de contexto espacial dentro de la observación experimental. Con este fin, hemos desarrollado un flujo de trabajo de imágenes intravitales que combina imágenes de segunda generación armónica de colágeno, fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H y microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) como un medio para compartimentar no invasivamente el microambiente tumoral en dominios básicos del nido tumoral, el estroma circundante o ECM, y la vasculatura. Este protocolo no invasivo detalla el proceso paso a paso que va desde la adquisición de imágenes de lapso de tiempo de modelos de tumores mamarios hasta el análisis de posprocesamiento y la segmentación de imágenes. La principal ventaja de este flujo de trabajo es que explota las firmas metabólicas para contextualizar el microambiente tumoral vivo que cambia dinámicamente sin el uso de etiquetas fluorescentes exógenas, lo que lo hace ventajoso para los modelos de xenoinjerto derivado de pacientes humanos (PDX) y el uso clínico futuro donde los fluoróforos extrínsecos no son fácilmente aplicables.

La instalación del MIW y la planificación experimental básica son los primeros pasos en este proceso. Este diseño y protocolo MIW en particular son más susceptibles a estudioslongitudinales 19 y se han utilizado con éxito con microscopios verticales e invertidos. En este caso, se utilizó un microscopio invertido, ya que ha dado como resultado una mayor estabilidad de la imagen de la glándula mamaria con menos artefactos respiratorios. En la Figura 1A, proporci...

Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Las imágenes intravitales nos permiten observar interacciones fisiológicas dentro del microambiente tumoral. Y mediante el uso de este método, los comportamientos dinámicos específicos que se observan se pueden compartimentar utilizando características locales del tejido. Este protocolo utiliza solo una señal ubicua sin etiquetas de fibras de colágeno o metabolitos autofluorescentes para segmentar la TME, minimizando así la cantidad de manipulaciones al ratón.Este método es ampliamente aplicable a cualquier sistema intravital donde se requiera la comprensión de las interacciones dinámicas relativas a las estructuras de la matriz extracelular o las estructuras vasculares. Demostrando este procedimiento estarán Dave Inman, especialista senior en investigación, y Erica Hoffmann, una estudiante graduada del laboratorio. Comience a preparar un vidrio de cubierta de ventana de imágenes mamarias remojando un vidrio de cubierta redonda de 1.5 12 milímetros en etanol al 100% durante 10 minutos, luego seque el vidrio de la cubierta debajo de una lámpara de calor y asegure el vidrio al marco de la ventana de imágenes mamarias de metal con adhesivo de cianoacrilato.Curar el adhesivo durante la noche. Al día siguiente, use un hisopo empapado de acetona para limpiar la ventana de imágenes mamarias ensamblada del exceso de adhesivo antes de sumergir la ventana de imágenes mamarias en etanol al 70% durante al menos 10 minutos para ayudar con la limpieza. Después del secado, guarde la ventana de imágenes mamarias limpias en una placa de Petri estéril.Antes de comenzar la cirugía para la implantación de la ventana, autoclave las herramientas quirúrgicas y desinfecte las superficies con etanol al 70%. Prepare una mesa desinfectada para la cirugía con una manta caliente cubierta con un campo estéril. Coloque la manta de calentamiento de tal manera que la temperatura medida en la parte superior del campo estéril sea de 40 grados centígrados.Use iluminación fría auxiliar y lupas para el procedimiento quirúrgico. Use EPP que consista en una bata de laboratorio estéril de un solo uso, mangas quirúrgicas, guantes, protección ocular y máscara facial. A continuación, retire el pelaje del ratón anestesiado en la cuarta glándula mamaria inguinal con una crema depilatoria y enjuague el sitio quirúrgico con una gasa empapada de agua estéril.Luego prepare el sitio quirúrgico depilado para la cirugía desinfectando la superficie de la piel con tres exfoliantes alternados de Betadine y etanol. Cuando haya terminado, levante suavemente la piel sobre la glándula mamaria número cuatro con fórceps. Una vez que la piel se aleja de la pared del cuerpo, retire una sección de un milímetro de la capa dérmica en la punta de las pinzas con microscisoras quirúrgicas.Sin cortar la glándula subyacente, cree una incisión de 10 milímetros y luego libere la glándula mamaria de la capa dérmica con el movimiento suave de los fórceps. Agregue PBS para cubrir la glándula expuesta. Use una sutura trenzada de seda 5-0 para crear una sutura de cuerda de bolso a lo largo de la periferia de la abertura, luego inserte un borde de la ventana de imágenes mamarias para que la capa dérmica se enganche en la muesca receptora de la ventana de imágenes mamarias.Mientras estira el epitelio en el extremo opuesto de la ventana de imágenes mamarias, empuje la ventana de imágenes mamarias de metal en su lugar de modo que la capa dérmica enganche completamente la muesca receptora alrededor de toda la circunferencia de la ventana de imágenes mamarias. Luego aprieta la cuerda del bolso para dibujar la capa dérmica en la muesca y ata la capa para asegurar la ventana. Aplique un antibiótico tópico a la capa dérmica en la ventana de imágenes mamarias y monitoree continuamente al ratón.Después de recuperar la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal, aloje la ventana de imágenes mamarias implantada por separado en la ropa de cama blanda con un iglú colocado en la jaula y permita que el ratón se recupere durante 48 horas antes de la toma de imágenes. Para las imágenes, use un sistema de aire forzado configurado a 30 grados centígrados. Use un calentador de objetivo adicional para evitar la deriva en el enfoque Z y permita que el sistema llegue al equilibrio a 30 grados Celsius durante al menos una hora antes de la toma de imágenes.Luego configure una cámara de calentamiento en el escenario del microscopio. Después de confirmar la anestesia con el método de pellizco del dedo del pie, agregue un ungüento para los ojos al ratón. Para mantener una hidratación adecuada, inyecte 0,5 mililitros de PBS por vía subcutánea cada dos horas durante la duración de la sesión de imágenes.Aplique un gel a base de agua en lugar de agua al objetivo y limpie el exterior del vidrio de la ventana de imágenes mamarias con un aplicador de algodón y un limpiador de vidrio antes de transferir el mouse a la etapa de microscopio precalentado. Después de colocar el ratón en el escenario del microscopio, presione el collar de la ventana de imágenes mamarias en un orificio de recepción de 14 milímetros en el inserto del escenario para estabilizar las imágenes y ajustar la manguera de isoflurano. Luego, enfoque el campo de imágenes utilizando los oculares del microscopio y la iluminación de Campo Brillante, observando la vasculatura con el flujo sanguíneo.Compruebe la estabilidad del campo de visión. Si hay artefactos de movimiento respiratorio, aplique una compresión suave en la parte posterior de la glándula con un pequeño bloque de espuma y un trozo de cinta adhesiva similar a una cintura. Después de aplicar la compresión, verifique que el flujo sanguíneo se mantenga en todo el campo de visión.Una vez que el ratón esté sedado y colocado de forma segura en la etapa de microscopio invertido, comience a localizar las regiones de interés. Usando una fuente de luz dirigida a la ventana de imágenes mamarias, use los oculares del microscopio para identificar áreas potenciales para la investigación. El enfoque debe estar en ver la vasculatura y el flujo sanguíneo.Agregue y guarde las posiciones XY en el software. Cuando se establezcan los niveles de potencia adecuados, configure la pila Z y observe la aparición de abundantes fibras de colágeno a 20 a 50 micrómetros debajo de la superficie de vidrio de la ventana de imágenes mamarias. El colágeno se volverá menos prevalente a medida que el microscopio se seccione más profundamente en el tumor.Los vacíos en la segunda generación armónica o SHG revelan la ubicación de las masas tumorales. Coloque la rebanada Z superior debajo de la capa de células solitarias con las primeras fibras de colágeno que aparecen de 50 a 100 micras. Coloque la rebanada Z inferior a 250 micrómetros donde las fibras se desvanecen y la mala señal domina.A continuación, repita el procedimiento para todas las posiciones XY guardadas. Una vez que se haya establecido el rango de pila Z, aumente el tiempo de permanencia a ocho microsegundos y optimice la configuración de potencia y detector. Optimice los niveles de potencia necesarios para excitar el tejido para cada experimento y use potencias de hasta 90 milivatios a 750 nanómetros o 70 milivatios a 890 nanómetros en la abertura posterior del objetivo.A continuación, comience con intervalos de 10 minutos entre los puntos de recolección para la mayoría de las películas de migración intravital y ajuste los intervalos de tiempo de acuerdo con los objetivos experimentales. Si se observan signos de fototoxicidad como sangrado celular o autofluorescencia en rápido aumento y fotoblanqueo excesivo, reduzca la potencia del láser o aumente los intervalos de lapso de tiempo según lo indiquen las condiciones. Para imágenes de fluorescencia de por vida o FLIM de NADPH, inicie el escaneo de vista previa y ajuste la potencia del láser hasta que la lectura del discriminador de fracción constante o CFD esté entre 10 a la quinta y 10 a la sexta.Exceder CFD más allá de 10 al sexto resultado en acumulación de fotones y malos resultados generales. Una vez establecido el nivel de potencia, establezca el tiempo de integración entre 90 y 120 segundos e inicie la colección FLIM para adquirir fotones del campo de visión durante el tiempo asignado. Un campo de visión típico dentro de un tumor mamario sin etiqueta demostró abundantes fibras de colágeno cerca de la ventana y una disminución en la abundancia más profundamente en el tumor.El uso de fluorescencia de por vida o NADPH ayudó en la identificación de la vasculatura. Algunas regiones oscuras en las imágenes eran pliegues tumorales o el glúteo de los lóbulos tumorales adyacentes. Para identificar la vasculatura, se validó una imagen compuesta utilizando NDPH FLIM comparando las proyecciones de máxima intensidad de la pila intravital antes y después de la inyección de dextrano fluorescente en la vena de la cola.El análisis representativo muestra la cuantificación de cuatro ratones y los campos de visión. Para delinear los límites de las masas tumorales libres de etiquetas, se utilizó la autofluorescencia NADPH. Las imágenes informaron las firmas metabólicas de las células y la ubicación de los vasos sanguíneos.La autofluorescencia afD también identificó los macrófagos. Con el esquema de segmentación, el tumor libre de etiquetas se segmentó en compartimentos para el nido tumoral, el estroma y la vasculatura utilizando solo autofluorescencia SHG y NADPH. Además, las fibras de estroma y colágeno también se pueden clasificar en regiones locales de las fibras alineadas.Lo más importante que debe recordar para este protocolo es asegurarse de que el mouse esté correctamente sedado y restringido para que el campo de visión permanezca estable para la obtención de imágenes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Un imitador del microambiente tumoral: Un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y Comunicación intercelular Investigando

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

Un time-lapse, libre de etiquetas, cuantitativa fase estudio de células cancerosas humanas latentes y activos de imagen

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Enriquecimiento de fosfopéptidos acoplada con espectrometría de masa libre de etiqueta cuantitativa para investigar la Phosphoproteome en cáncer de próstata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Evaluación del microambiente tumoral de la permeabilidad vascular mediada por la puerta de la puerta asociada con la diseminación de células cancerosas mediante imágenes intravitales y análisis de tejido fijo

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Análisis De La Población Lateral En Líneas Celulares De Tumores Sólidos

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Aislamiento de líquidos proximales para investigar el microambiente tumoral del adenocarcinoma pancreático

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Microdisección láser industrializada guiada por inteligencia artificial para el análisis proteómico a microescala del microambiente tumoral

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...