Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

Författarna vill erkänna NCI R01 CA216248, CA206458 och CA179556 bidrag för finansiering av detta arbete. Vi vill också tacka Dr. Kevin Eliceiri och hans bildgrupp för deras tekniska expertis i den tidiga utvecklingen av vårt intravitala program. Vi tackar också Dr. Ben Cox och andra medlemmar i Eliceiri Fabrication Group vid Morgridge Institute for Research för deras viktiga tekniska design under de tidiga faserna av MIW. Dr Ellen Dobson hjälpte till med användbara samtal om ImageJ-träningsbart WEKA-segmenteringsverktyg. Dessutom vill vi tacka Dr. Melissa Skala och Dr. Alexa Barres-Heaton för snabb användning av deras mikroskop. Slutligen vill vi tacka Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, för alla tankeväckande diskussioner och råd om vår mushantering och vård.

Alla experiment som beskrivs godkändes av University of Wisconsin-Madisons institutionella djurvårds- och användningskommitté. Välbefinnande och smärtlindring i alla djurförsök är av största vikt. Således görs alla ansträngningar för att se till att djuret är bekvämt och välskött vid varje steg i proceduren.
1. Generering av fönstret för bröstavbildning (MIW)
<ol><li>För att konstruera bröstbildsfönstret, tillverka en 14 mm ring av rostfritt stål av ...

4D intravital avbildning är ett kraftfullt verktyg för att undersöka dynamiska fysiologiska interaktioner inom det rumsliga och tidsmässiga sammanhanget för den ursprungliga tumörmikromiljön. Detta manuskript ger en mycket grundläggande och anpassningsbar operativ ram för att dela upp dynamiska cellinteraktioner inom tumörmassan, den intilliggande stroma eller i närheten av det vaskulära nätverket med endast endogena signaler från andra harmoniska generationen eller NAD (P) H autofluorescens. Detta protokol...

Den extracellulära matrisen (ECM) i tumörmikromiljön är känd för att vara dynamiskt deponerad och ombyggd av flera celltyper för att ytterligare underlätta sjukdomsprogression 1,2,3. Dessa matrisförändringar ger både mekaniska och biologiska signaler som förändrar cellbeteendet och resulterar ofta i en fortsatt cykel av matrisombyggnad4. Undersökning av det dynamiska, ömsesidiga samspelet mellan tumörceller och den extracellulära matrisen utförs ofta med hjälp av tredimensionell (3D) in vitro-odling eller mikrofluidiska system. Medan dessa bottom-up-metoder har visat mekanismer för ECM-ombyggnad 5,6,7, ökad proliferation8, epitel till mesenkymal övergång 9,10,11,12 och tumörcellmigration och invasion 7,13,14,15,16 har deras fokus främst legat på ett fåtal celltyper (t.ex. tumörceller eller fibroblaster) inom en homogen 3D-matris jämfört med mångfalden och heterogeniteten hos interaktioner som finns i en fysiologisk vävnad. Förutom in vitro-system kan ex vivo tumör histologi också ge viss inblick i dessa cell-cell- och cell-ECM-interaktioner17. Immunohistokemi har fördelen att kunna analysera flera celltyper med avseende på ECM: s rumsligt heterogena sammansättning och arkitektur, men de statiska slutpunkterna för fast vävnad fångar inte den dynamiska karaktären av interaktioner mellan celler och mikromiljön. Intravital avbildning har öppnat dörren för att förhöra olika och dynamiska interaktioner inom det fysiologiska sammanhanget för den inhemska tumörmikromiljön.
Kapaciteten hos intravital tumöravbildning utvecklas snabbt. Förbättringar i utformningen av bildfönster och kirurgiska tekniker för att implantera fönstren har möjliggjort långsiktig longitudinell tumöravbildning på en mängd olika anatomiska platser (dvs. primär tumör, lymfkörtlar, metastatiska platser 18,19,20). Dessutom blir kapaciteten hos optisk instrumentering att visualisera och samla in data i flera dimensioner (dvs. spektral, rumslig fluorescensintensitet och livslängd) och vid hög upplösning och hastighet (videohastighet) allmänt tillgänglig. Den förbättrade tekniken ger en möjlighet att utforska snabba förändringar i cellsignalering och fenotypisk dynamik inom en fysiologisk miljö. Slutligen möjliggör expansionen av optogenetiska verktyg och det stora utbudet av genetiska fluorescerande konstruktioner märkning av specifika celltyper för att fånga cellmigration i tumörmikromiljön eller cellspårning under utveckling eller sjukdomsprogression 21,22. Användningen av dessa verktyg i kombination med CRISPR/Cas9-teknik ger forskare möjlighet att generera unika djurmodeller i tid.
Medan alla dessa framsteg gör intravital avbildning till en allt kraftfullare metod för att utforska dynamiska och fysiologiska cellulära interaktioner, finns det fortfarande ett viktigt behov av att utveckla strategier som ger rumsligt, tidsmässigt och strukturellt sammanhang på vävnadsnivå till dessa biologiska interaktioner. För närvarande kompenserar många intravitala avbildningsstudier för bristen på visuella landmärken som blodkärl genom att injicera fluorescerande färgämnen i vaskulaturen eller använda musmodeller som exogent uttrycker fluorescerande proteiner för att avgränsa fysiska egenskaper. Injicerbara färgämnen och substrat som fluorescerande dextrans används i stor utsträckning för att framgångsrikt märka vaskulaturen i intravitala samlingar19, 23, 24. Detta tillvägagångssätt är dock inte utan begränsningar. För det första kräver det ytterligare musmanipuleringar och dess användbarhet är begränsad till kortsiktiga experiment. För longitudinella studier kan fluorescerande dextran vara problematiskt eftersom vi observerar ackumulering av dextran i fagocytiska celler eller diffusion i den omgivande vävnaden över tid25. Exogen fluorescerande proteininkorporering i musmodellen har presenterats som ett alternativ till fluorescerande dextrans men presenterar egna begränsningar. Tillgängligheten och mångfalden av exogena fluoroforer inom musmodeller är fortfarande begränsad och dyr att skapa. Dessutom, i specifika modeller, såsom PDX-modeller, är genetiska manipuleringar inte önskvärda eller möjliga. Det har också visats att närvaron av fluorescerande eller bioluminescerande proteiner i celler erkänns som främmande i musen, och inom immunkompetenta musmodeller minskar detta mängden metastasering på grund av svaret från värdimmunsystemet26,27. Slutligen upptar exogena fluorescerande proteiner eller fluorescerande färgämnen som används för rumslig kontext eller för att segmentera efterföljande data ofta primområden av ljusspektrumet som annars skulle kunna användas för att undersöka de fysiologiska interaktionerna av intresse.
Användningen av den inneboende signalen från ECM eller endogen fluorescens från celler i vävnaden representerar ett potentiellt universellt etikettfritt sätt att segmentera intravitala data för mer djupgående cellulär och rumslig analys. Andra harmoniska generationen (SHG) har länge använts för att visualisera ECM28. Med den efterföljande utvecklingen av viktiga verktyg för att hjälpa till vid karakteriseringen av fiberorganisationen 29,30,31 är det möjligt att karakterisera cellbeteende i förhållande till lokal ECM-struktur. Dessutom ger autofluorescens från den endogena metaboliten, NAD (P) H, ett annat etikettfritt verktyg för att dela upp tumörmikromiljön in vivo. NAD(P)H fluorescerar starkt i tumörceller och kan användas för att diskriminera gränserna för det växande tumörboet från dess omgivande stroma 21,32. Slutligen är vaskulaturen en viktig fysiologisk struktur i tumörmikromiljön och platsen för viktiga celltypsspecifika interaktioner 33,34,35. Excitationen av röda blodkroppar (RBC) eller blodplasma har använts för att visualisera tumörkärlen, och med hjälp av två- eller trefotonexcitation (2P; 3P) har mätningen av blodflödeshastigheter visat sig vara möjlig36. Men medan större blodkärl lätt kan identifieras med sina endogena fluorescenssignaturer, kräver identifieringen av subtila, variabla och mindre fluorescerande små blodkärl mer expertis. Dessa inneboende svårigheter hindrar optimal bildsegmentering. Lyckligtvis kan dessa källor till endogen fluorescens (dvs. röda blodkroppar och blodplasma) också mätas genom fluorescens livstidsavbildning37, som utnyttjar vaskulaturens unika fotofysiska egenskaper och representerar ett användbart tillskott till den växande intravitala verktygslådan.
I detta protokoll beskrivs ett arbetsflöde för segmentering av fyrdimensionell (4D) intravital avbildning som uttryckligen använder inneboende signaler som endogen fluorescens och SHG från förvärv till analys. Detta protokoll är särskilt relevant för longitudinella studier genom ett bröstavbildningsfönster där exogen fluorescens kanske inte är praktisk eller möjlig, vilket är fallet med PDX-modeller. Segmenteringsprinciperna som beskrivs här är dock i stort sett tillämpliga på intravitala användare som undersöker tumörbiologi, vävnadsutveckling eller till och med normal vävnadsfysiologi. Den rapporterade sviten av analysmetoder gör det möjligt för användarna att skilja cellulärt beteende mellan regioner med inriktade eller slumpmässiga kollagenfiberkonfigurationer, jämföra antal eller beteenden hos celler som bor i specifika regioner i tumörmikromiljön och kartlägga vaskulaturen till tumörmikromiljön med endast etikettfri eller inneboende signal. Tillsammans skapar dessa metoder en operativ ram för att maximera djupet av information som erhållits från 4D intravital avbildning av bröstkörteln samtidigt som behovet av ytterligare exogena etiketter minimeras.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

Förmågan att visualisera komplexa och dynamiska fysiologiska interaktioner mellan många celltyper och den extracellulära matrisen (ECM) inom en levande tumörmikromiljö är ett viktigt steg mot att förstå mekanismer som reglerar tumörprogression. Även om detta kan åstadkommas genom nuvarande intravitala avbildningstekniker, är det fortfarande utmanande på grund av vävnadernas heterogena natur och behovet av rumsligt sammanhang inom den experimentella observationen. För detta ändamål har vi utvecklat ett intravitalt bildarbetsflöde som parar kollagen andra harmoniska generationens bildbehandling, endogen fluorescens från den metaboliska samfaktorn NAD (P) H och fluorescens livstidsavbildningsmikroskopi (FLIM) som ett sätt att icke-invasivt dela upp tumörmikromiljön i grundläggande domäner i tumörboet, den omgivande stroma eller ECM och vaskulaturen. Detta icke-invasiva protokoll beskriver steg-för-steg-processen som sträcker sig från förvärv av time-lapse-bilder av brösttumörmodeller till efterbehandlingsanalys och bildsegmentering. Den främsta fördelen med detta arbetsflöde är att det utnyttjar metaboliska signaturer för att kontextualisera den dynamiskt föränderliga levande tumörmikromiljön utan användning av exogena fluorescerande etiketter, vilket gör det fördelaktigt för humana patient-härledda xenograftmodeller (PDX) och framtida klinisk användning där yttre fluoroforer inte är lätt tillämpliga.

Installationen av MIW och grundläggande experimentell planering är de första stegen i denna process. Denna speciella MIW-design och protokoll är mer mottagliga för longitudinella studier19 och har framgångsrikt använts med både upprättstående och inverterade mikroskop. I detta fall användes ett inverterat mikroskop eftersom det har resulterat i större bildstabilitet hos bröstkörteln med färre andningsartefakter. I figur 1A ger vi dimensionerna på den s...

Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Den intravitala avbildningsmetoden som beskrivs här använder kollagen andra harmoniska generationen och endogen fluorescens från den metaboliska samfaktorn NAD (P) H för att icke-invasivt segmentera en omärkt tumörmikromiljö i tumör-, stromala och vaskulära fack för djupgående analys av 4D-intravitala bilder.

En etikettfri segmenteringsmetod för intravital avbildning av brösttumörmikromiljö

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Intravital avbildning gör att vi kan observera fysiologiska interaktioner inom tumörmikromiljön. Och genom att använda denna metod kan specifika dynamiska beteenden som observeras delas upp med hjälp av lokala vävnadsfunktioner. Detta protokoll använder endast en allestädes närvarande etikettfri signal från kollagenfibrer eller autofluorescerande metaboliter för att segmentera TME, vilket minimerar mängden manipuleringar till musen.Denna metod är i stort sett tillämplig på alla intravitala system där förståelse av dynamiska interaktioner i förhållande till extracellulära matrisstrukturer eller vaskulära strukturer krävs. Demonstrerar denna procedur kommer att vara Dave Inman, senior forskningsspecialist, och Erica Hoffmann, en doktorand från laboratoriet. Börja förbereda ett fönsterglas för bröstavbildning genom att blötlägga ett 1,5 12 millimeter runt täckglas i 100% etanol i 10 minuter, torka sedan täckglaset under en värmelampa och fäst glaset på metallblivnavbildningsfönsterramen med cyanoakrylatlim.Bota limet över natten. Nästa dag, använd en acetonindränkt vattpinne för att rengöra det monterade bröstbildsfönstret från överskottslimet innan du sänker ner bröstbildsfönstret i 70% etanol i minst 10 minuter för att hjälpa till med rengöringen. Efter torkning, förvara det rengjorda bröstbildsfönstret i en steril petriskål.Innan operationen för fönsterimplantation påbörjas, autoklav kirurgiska verktyg och sanera ytor med 70% etanol. Förbered en sanerad bordplatta för operationen med en uppvärmningsfilt täckt med ett sterilt fält. Ställ in uppvärmningsfilten så att temperaturen som mäts ovanpå det sterila fältet är 40 grader Celsius.Använd extra kallbelysning och förstoringsglas för det kirurgiska ingreppet. Använd personlig skyddsutrustning som består av en steril laboratorierock för engångsbruk, kirurgiska ärmar, handskar, ögonskydd och ansiktsmask. Ta sedan bort pälsen på den bedövade musen vid den fjärde inguinala bröstkörteln med en hårborttagningskräm och skölj den kirurgiska platsen med en steril vattendränkt gasbindning.Förbered sedan det depilerade kirurgiska stället för operation genom att sanera hudytan med tre alternerande Betadine- och etanolskrubb. När du är klar, lyft försiktigt huden över bröstkörtel nummer fyra med pincett. När huden har dragits bort från kroppsväggen, ta bort en millimeter sektion av det dermala skiktet vid spetsen av tången med kirurgiska mikrosnedare.Utan att skära den underliggande körteln, skapa ett snitt på 10 millimeter och släpp sedan bröstkörteln från det dermala skiktet med tångens mjuka rörelse. Tillsätt PBS för att täcka den exponerade körteln. Använd en 5-0 silkeflätad sutur för att skapa en handväska sträng sutur längs öppningens periferi och sätt sedan in en kant av bröstbildsfönstret så att dermalskiktet engagerar sig i mottagningsskåran i bröstbildsfönstret.Medan du sträcker epitelet i motsatt ände av bröstbildsfönstret, tryck metallbäggäggsbildsfönstret på plats så att det dermala skiktet helt engagerar mottagningsskåran runt hela däggdjursbildfönstrets omkrets. Fäst sedan handväskan för att dra det dermala skiktet i skåran och binda av skiktet för att säkra fönstret. Applicera ett aktuellt antibiotikum på det dermala skiktet vid bröstavbildningsfönstret och övervaka musen kontinuerligt.Efter att ha återfått tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal liggande, hys bröstavbildningsfönstret implanterad mus separat på mjukt sängkläder med en igloo placerad i buret och låt musen återhämta sig i 48 timmar före avbildning. För avbildningen, använd ett tvångsluftsystem inställt på 30 grader Celsius. Använd en extra objektiv värmare för att undvika drift i Z-fokus och låta systemet komma i jämvikt vid 30 grader Celsius i minst en timme före avbildning.Sätt sedan upp en värmekammare på mikroskopsteget. Efter att ha bekräftat anestesi med tåklämningsmetoden, lägg till en ögonsalva till musen. För att upprätthålla korrekt hydrering, injicera 0,5 ml PBS subkutant varannan timme under hela bildsessionen.Applicera en vattenbaserad gel istället för vatten på målet och rengör utsidan av bröstbildsfönstret med en bomullsapplikator och glasrengörare innan du överför musen till det förvärmda mikroskopstadiet. När du har lagt musen på mikroskopsteget, tryck kragen på bröstbildsfönstret i ett 14 millimeter mottagningshål i sceninsatsen för att stabilisera bilderna och passa isofluranslangen. Sätt sedan bildfältet i fokus med hjälp av mikroskopokularen och Brightfield-belysningen och observera vaskulaturen med blodflödet.Kontrollera synfältets stabilitet. Om andningsrörelseartefakter är närvarande, applicera mild kompression på baksidan av körteln med ett litet skumblock och en cincture-liknande bit tejp. När kompression har applicerats, kontrollera att blodflödet upprätthålls i hela synfältet.När musen är sederad och säkert placerad på det inverterade mikroskopstadiet, börja lokalisera intressanta regioner. Använd en ljuskälla riktad mot bröstbildsfönstret, använd mikroskopets okular för att identifiera potentiella områden för undersökning. Fokus bör ligga på att se vaskulatur och blodflöde.Lägg till och spara XY-positionerna i programvaran. När lämpliga effektnivåer är inställda, sätt upp Z-stacken och observera utseendet på rikliga kollagenfibrer vid 20 till 50 mikrometer under glasytan i bröstbildsfönstret. Kollagen kommer att bli mindre utbrett som mikroskopsektionerna djupare in i tumören.Hålrummen i den andra harmoniska generationen eller SHG avslöjar placeringen av tumörmassor. Ställ in den övre Z-skivan under skiktet av ensamma celler med de första kollagenfibrerna visas vid 50 till 100 mikron. Ställ in den nedre Z-skivan på 250 mikrometer där fibrerna bleknar ut och den dåliga signalen dominerar.Upprepa sedan proceduren för alla XY-positioner som sparats. När Z-stackområdet är inställt, öka uppehållstiden till åtta mikrosekondrar och optimera effekt- och detektorinställningarna. Optimera de effektnivåer som behövs för att excitera vävnaden för varje experiment och använd krafter upp till 90 milliwatt vid 750 nanometer eller 70 milliwatt vid 890 nanometer vid målets bakre bländare.Börja sedan med 10-minutersintervall mellan insamlingspunkter för de flesta intravitala migreringsfilmer och justera tidsintervallen enligt experimentella mål. Om tecken på fototoxicitet som cellblebbning eller snabbt ökande autofluorescens och överdriven fotoblekning observeras, minska lasereffekten eller öka timelapsintervallen som förhållandena indikerar. För fluorescens livstidsavbildning eller FLIM av NADPH, börja förhandsgranska skanning och justera lasereffekten tills avläsningen av konstantfraktionsdiskriminatorn eller CFD är mellan 10 till den femte och 10 till den sjätte.Att överskrida CFD bortom 10 till det sjätte resultatet i fotonhög och dåliga övergripande resultat. När effektnivån är inställd ställer du in integrationstiden mellan 90 och 120 sekunder och startar FLIM-samlingen för att hämta fotoner från synfältet för den tilldelade tiden. Ett typiskt synfält inom en etikettfri brösttumör visade rikliga kollagenfibrer nära fönstret och en minskning av överflöd djupare in i tumören.Användningen av fluorescenslivslängd eller NADPH hjälpte till att identifiera vaskulaturen. Några mörka områden i bilderna var tumörveck eller upptändning av intilliggande tumörlober. För att identifiera vaskulatur validerades en sammansatt bild med NDPH FLIM genom att jämföra maximala intensitetsprojektioner av den intravitala stacken före och efter svansveninjektion av fluorescerande dextran.Den representativa analysen visar kvantifieringen av fyra möss och synfälten. För att avgränsa gränserna för de etikettfria tumörmassorna användes NADPH autofluorescens. Bilderna rapporterade cellernas metaboliska signaturer och blodkärlens placering.AFD-autofluorescensen identifierade också makrofagerna. Med segmenteringsschemat segmenterades den etikettfria tumören i fack för tumörboet, stroma och vaskulatur med endast SHG- och NADPH-autofluorescens. Dessutom kan stroma- och kollagenfibrerna också klassificeras i lokala regioner av de inriktade fibrerna.Det viktigaste att komma ihåg för detta protokoll är att se till att musen är ordentligt sederad och fasthållen så att synfältet förblir stabilt för bildbehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

En Mimic av tumören mikromiljö: En enkel metod för att generera anrikade cellpopulationer och undersöka kommunikationen mellan

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

En Time-lapse, etikett-fri, kvantitativa fas Imaging studie av vilande och aktiv mänskliga cancerceller

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide anrikning tillsammans med etikett-fri kvantitativa masspektrometri att undersöka Phosphoproteome vid prostatacancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinell Intravital avbildning av hjärntumör cell beteende som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Bedömning tumör mikromiljö av metastaser Doorway-medierad vaskulär permeabilitet i samband med Cancer Cell spridning med Intravital avbildning och fast vävnads analys

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analys av sidopopulation i solida tumör cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En ny Stromal Fibroblast-Modulerad 3D Tumör Spheroid modell för att studera tumör-Stroma interaktion och drug discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering av proximala vätskor för att undersöka tumörmikromiljön i bukspottskörtelns adenokarcinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Längsgående intravital avbildning genom tydliga silikonfönster

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Industrialiserad, artificiell intelligensstyrd lasermikrodissektion för mikroskalad proteomisk analys av tumörmikromiljön

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...