Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

Yazarlar, bu çalışmayı finanse etmek için NCI R01 CA216248, CA206458 ve CA179556 hibelerini kabul etmek istiyor. Ayrıca, Dr. Kevin Eliceiri ve görüntüleme grubuna, intravital programımızın erken gelişimindeki teknik uzmanlıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Ben Cox'a ve Morgridge Araştırma Enstitüsü'ndeki Eliceiri İmalat Grubu'nun diğer üyelerine, MIW'nin ilk aşamalarındaki temel teknik tasarımları için teşekkür ederiz. Dr. Ellen Dobson, ImageJ eğitilebilir WEKA segmentasyon aracı hakkında yararlı konuşmalara yardımcı oldu. Ayrıca, mikroskoplarını zamanında kullandıkları için Dr. Melissa Skala ve Dr. Alexa Barres-Heaton'a teşekkür ederiz. Son olarak, fare kullanımı ve bakımıyla ilgili tüm düşünceli tartışmalar ve tavsiyeler için Dr. Brigitte Raabe, DVM'ye teşekkür ederiz.

Açıklanan tüm deneyler Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan deneylerinde refah ve ağrı yönetimi her şeyden önemlidir. Bu nedenle, prosedürün her adımında hayvanın rahat ve bakımlı olduğundan emin olmak için her türlü çaba gösterilmektedir.
1. Meme görüntüleme penceresinin oluşturulması (MIW)
<ol><li>Meme görüntüleme penceresini inşa etmek için, cerrahi sınıf...

4D intravital görüntüleme, doğal tümör mikroçevresinin mekansal ve zamansal bağlamındaki dinamik fizyolojik etkileşimleri araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu makale, tümör kütlesi, bitişik stroma veya vasküler ağa yakın dinamik hücre etkileşimlerini sadece ikinci harmonik jenerasyondan veya NAD (P) H otofloresansından gelen endojen sinyalleri kullanarak bölümlere ayırmak için çok temel ve uyarlanabilir bir operasyonel çerçeve sunmaktadır. Bu protokol, görüntüleme penceresinin impl...

Tümör mikroortamındaki hücre dışı matriksin (ECM), hastalığın ilerlemesini daha da kolaylaştırmak için çoklu hücre tipleri tarafından dinamik olarak biriktirildiği ve yeniden şekillendirildiği bilinmektedir 1,2,3. Bu matris değişiklikleri, hücre davranışını değiştiren ve sıklıkla matris yeniden şekillenmesinin devam eden bir döngüsüyle sonuçlanan hem mekanik hem de biyolojik ipuçları sağlar4. Tümör hücreleri ve hücre dışı matriks arasındaki dinamik, karşılıklı etkileşimin araştırılması genellikle üç boyutlu (3D) in vitro kültür veya mikroakışkan sistemler kullanılarak gerçekleştirilir. Bu aşağıdan yukarıya yaklaşımlar ECM yeniden şekillenme mekanizmalarını göstermiş olsa da 5,6,7, artmış proliferasyon8, epitelden mezenkimal geçişegeçiş 9,10,11,12 ve tümör hücresi migrasyonu ve invazyonu 7,13,14,15,16 , odak noktaları öncelikle fizyolojik bir doku içinde bulunan etkileşimlerin çeşitliliği ve heterojenliği ile karşılaştırıldığında homojen bir 3D matris içindeki birkaç hücre tipi (örneğin, tümör hücreleri veya fibroblastlar) üzerinde olmuştur. İn vitro sistemlere ek olarak, ex vivo tümör histolojisi de bu hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimleri hakkında bazı bilgiler sağlayabilir17. İmmünohistokimya, ECM'nin mekansal olarak heterojen bileşimi ve mimarisi açısından çoklu hücre tiplerini analiz edebilme avantajına sahiptir, ancak sabit dokunun statik sonlanım noktaları, hücreler ve mikroçevre arasındaki etkileşimlerin dinamik doğasını yakalamaz. İntravital görüntüleme, doğal tümör mikroçevresinin fizyolojik bağlamı içinde çeşitli ve dinamik etkileşimleri sorgulamak için kapıyı açmıştır.
İntravital tümör görüntülemenin yetenekleri hızla ilerlemektedir. Görüntüleme pencerelerinin tasarımındaki gelişmeler ve pencereleri implante etmek için cerrahi teknikler, çeşitli anatomik lokalizasyonlarda (yani primer tümör, lenf nodları, metastatik bölgeler18,19,20) uzun süreli uzunlamasına tümör görüntülemesini mümkün kılmıştır. Dahası, optik enstrümantasyonun çoklu boyutlarda (yani spektral, uzamsal floresan yoğunluğu ve kullanım ömrü) ve yüksek çözünürlükte ve hızda (video hızı) verileri görselleştirme ve toplama kapasitesi yaygın olarak erişilebilir hale gelmektedir. Gelişmiş teknoloji, fizyolojik bir ortamda hücre sinyalizasyonundaki ve fenotipik dinamiklerdeki hızlı değişiklikleri keşfetme fırsatı sunar. Son olarak, optogenetik araçların genişlemesi ve çok çeşitli genetik floresan yapılar, tümör mikro ortamında hücre göçünü yakalamak için spesifik hücre tiplerinin etiketlenmesine veya gelişim veya hastalık ilerlemesi sırasında hücre soyu izlemesine izin verir21,22. Bu araçların CRISPR / Cas9 teknolojisi ile birlikte kullanılması, araştırmacılara zamanında benzersiz hayvan modelleri oluşturma fırsatı sunar.
Tüm bu ilerlemeler, intravital görüntülemeyi dinamik ve fizyolojik hücresel etkileşimleri keşfetmek için giderek daha güçlü bir yöntem haline getirirken, bu biyolojik etkileşimlere doku düzeyinde mekansal, zamansal ve yapısal bağlam sağlayan stratejiler geliştirmeye hala önemli bir ihtiyaç vardır. Şu anda, birçok intravital görüntüleme çalışması, vaskülatüre floresan boyalar enjekte ederek veya fiziksel özellikleri tanımlamak için floresan proteinleri dışsal olarak eksprese eden fare modellerini kullanarak kan damarları gibi görsel işaretlerin eksikliğini telafi etmektedir. Enjekte edilebilir boyalar ve floresan dekstrans gibi substratlar, intravital koleksiyonlarda vaskülatürü başarılı bir şekilde etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır19, 23, 24. Ancak, bu yaklaşım sınırlama olmaksızın değildir. Birincisi, ek fare manipülasyonları gerektirir ve faydası kısa vadeli deneylerle sınırlıdır. Uzunlamasına çalışmalar için, fagositik hücrelerde dekstran birikimini veya zamanla çevre dokuya difüzyonu gözlemlediğimiz için floresan dekstran sorunlu olabilir25. Fare modeline eksojen floresan protein katılımı, floresan dekstransa alternatif olarak sunulmuştur, ancak kendi sınırlamalarını sunmaktadır. Fare modellerindeki eksojen floroforların mevcudiyeti ve çeşitliliği hala sınırlı ve oluşturulması pahalıdır. Ek olarak, PDX modelleri gibi belirli modellerde, genetik manipülasyonlar arzu edilmez veya mümkün değildir. Ayrıca, hücrelerdeki floresan veya biyolüminesan proteinlerin varlığının fare içinde yabancı olarak kabul edildiği ve immünokompetan fare modellerinde, bunun konakçı bağışıklık sisteminin tepkisine bağlı metastaz miktarını azalttığı gösterilmiştir26,27. Son olarak, uzamsal bağlam için veya sonraki verileri segmentlere ayırmak için kullanılan eksojen floresan proteinler veya floresan boyalar, genellikle ilginin fizyolojik etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilecek ışık spektrumunun asal aralıklarını işgal eder.
ECM'den gelen içsel sinyalin veya doku içindeki hücrelerden endojen floresanın kullanılması, daha derinlemesine hücresel ve mekansal analiz için intravital verileri segmentlere ayırmak için potansiyel bir evrensel etiketsiz aracı temsil eder. İkinci harmonik jenerasyon (SHG), ECM28'i görselleştirmek için uzun zamandır kullanılmaktadır. Daha sonra fiber organizasyonu 29,30,31'in karakterizasyonuna yardımcı olacak önemli araçların geliştirilmesiyle, yerel ECM yapısına göre hücre davranışını karakterize etmek mümkündür. Ek olarak, endojen metabolitten gelen otofloresan olan NAD (P) H, tümör mikro ortamını in vivo olarak bölümlere ayırmak için başka bir etiketsiz araç sağlar. NAD (P) H, tümör hücrelerinde parlak bir şekilde flüoresan eder ve büyüyen tümör yuvasının sınırlarını çevresindeki stroma21,32'den ayırt etmek için kullanılabilir. Son olarak, vaskülatür, tümör mikroortamında ve anahtar hücre tipine özgü etkileşimlerin yapıldığı yerde önemli bir fizyolojik yapıdır33,34,35. Kırmızı kan hücrelerinin (RBC) veya kan plazmasının uyarılması, tümör vaskülatürünü görselleştirmek için kullanılmıştır ve iki veya üç foton uyarımı (2P; 3P) kullanılarak kan akış hızlarının ölçülmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir36. Bununla birlikte, daha büyük kan damarları endojen floresan imzaları ile kolayca tanımlanabilirken, ince, değişken ve daha az floresan küçük kan damarlarının tanımlanması daha fazla uzmanlık gerektirir. Bu doğal zorluklar optimum görüntü segmentasyonunu engeller. Neyse ki, bu endojen floresan kaynakları (yani, kırmızı kan hücreleri ve kan plazması), vaskülatürün benzersiz fotofiziksel özelliklerinden yararlanan ve büyüyen intravital alet kutusuna yararlı bir katkı sağlayan floresan ömür boyu görüntüleme37 ile de ölçülebilir.
Bu protokolde, endojen floresan ve SHG gibi içsel sinyalleri açıkça kullanarak dört boyutlu (4D) intravital görüntülemenin segmentasyonu için bir iş akışı, edinimden analize kadar tanımlanmıştır. Bu protokol, PDX modellerinde olduğu gibi, eksojen floresanın pratik veya mümkün olmayabileceği bir meme görüntüleme penceresinden geçen uzunlamasına çalışmalar için özellikle uygundur. Bununla birlikte, burada özetlenen segmentasyon ilkeleri, tümör biyolojisini, doku gelişimini ve hatta normal doku fizyolojisini araştıran intravital kullanıcılar için geniş çapta uygulanabilir. Bildirilen analiz yaklaşımları paketi, kullanıcıların hizalanmış veya rastgele kollajen lifi konfigürasyonlarının bölgeleri arasındaki hücresel davranışı ayırt etmelerine, tümör mikro ortamının belirli bölgelerinde bulunan hücrelerin sayılarını veya davranışlarını karşılaştırmalarına ve vaskülatürü yalnızca etiketsiz veya içsel sinyal kullanarak tümör mikro ortamına eşlemelerine olanak sağlayacaktır. Birlikte, bu yöntemler meme bezinin 4D intravital görüntülemesinden elde edilen bilgi derinliğini en üst düzeye çıkarmak için operasyonel bir çerçeve oluştururken, ek eksojen etiketlere olan ihtiyacı en aza indirir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

Canlı bir tümör mikroortamında çok sayıda hücre tipi ve hücre dışı matriks (ECM) arasındaki karmaşık ve dinamik fizyolojik etkileşimleri görselleştirme yeteneği, tümör progresyonunu düzenleyen mekanizmaları anlamak için önemli bir adımdır. Bu, mevcut intravital görüntüleme teknikleriyle gerçekleştirilebilse de, dokuların heterojen doğası ve deneysel gözlem içindeki mekansal bağlama duyulan ihtiyaç nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu amaçla, kollajen ikinci harmonik jenerasyon görüntülemeyi, metabolik ko-faktör NAD(P)H'den endojen floresanı ve floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunu (FLIM) tümör mikroçevresini tümör yuvasının, çevresindeki stroma veya ECM'nin ve vaskülatürün temel alanlarına invaziv olmayan bir şekilde bölümlere ayırmak için bir araç olarak eşleştiren intravital bir görüntüleme iş akışı geliştirdik. Bu non-invaziv protokol, meme tümörü modellerinin hızlandırılmış görüntülerinin elde edilmesinden işlem sonrası analiz ve görüntü segmentasyonuna kadar uzanan adım adım süreci detaylandırır. Bu iş akışının birincil avantajı, eksojen floresan etiketler kullanmadan dinamik olarak değişen canlı tümör mikro ortamını bağlamsallaştırmak için metabolik imzalardan yararlanmasıdır, bu da onu insan kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri ve dışsal floroforların kolayca uygulanamadığı gelecekteki klinik kullanım için avantajlı hale getirir.

MIW'nin kurulumu ve temel deneysel planlama bu süreçteki ilk adımlardır. Bu özel MIW tasarımı ve protokolü, uzunlamasına çalışmalara19 daha uygundur ve hem dik hem de ters mikroskoplarla başarıyla kullanılmıştır. Bu durumda, daha az solunum artefaktı ile meme bezinin daha fazla görüntü stabilitesine neden olduğu için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılmıştır. Şekil 1A'da, rijit MIW'nin boyutlarını ve implantasyon işlemine grafiksel ...

Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

İntravital görüntüleme, tümör mikroçevresi içindeki fizyolojik etkileşimleri gözlemlememizi sağlar. Ve bu yöntem kullanılarak, gözlemlenen spesifik dinamik davranışlar lokal doku özellikleri kullanılarak bölümlere ayrılabilir. Bu protokol, TME'yi segmentlere ayırmak için kollajen liflerinden veya otofloresan metabolitlerden yalnızca her yerde bulunan etiketsiz bir sinyal kullanır, böylece fareye yapılan manipülasyon miktarını en aza indirir.Bu yöntem, hücre dışı matriks yapılarına veya vasküler yapılara göre dinamik etkileşimleri anlamanın gerekli olduğu herhangi bir intravital sisteme geniş ölçüde uygulanabilir. Bu prosedürü gösteren, kıdemli araştırma uzmanı Dave Inman ve laboratuvardan yüksek lisans öğrencisi Erica Hoffmann olacak. 1,5 12 milimetrelik yuvarlak kapak camını 10 dakika boyunca% 100 etanol içine batırarak bir meme görüntüleme penceresi kapağı camı hazırlamaya başlayın, ardından kapak camını bir ısı lambası altında kurutun ve camı siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak metal meme görüntüleme penceresi çerçevesine sabitleyin.Yapıştırıcıyı gece boyunca kürleyin. Ertesi gün, temizlemeye yardımcı olmak için meme görüntüleme penceresini en az 10 dakika boyunca% 70 etanol içine batırmadan önce, fazla yapıştırıcının monte edilmiş meme görüntüleme penceresini temizlemek için asetonla ıslatılmış bir çubuk kullanın. Kuruduktan sonra, temizlenmiş meme görüntüleme penceresini steril bir Petri kabında saklayın.Pencere implantasyonu için ameliyata başlamadan önce, otoklav cerrahi aletleri ve yüzeyleri% 70 etanol ile sterilize edin. Steril bir alanla kaplı bir ısınma battaniyesi ile ameliyat için sterilize edilmiş bir masa üstü hazırlayın. Isınma battaniyesini, steril alanın üstünde ölçülen sıcaklık 40 santigrat derece olacak şekilde ayarlayın.Cerrahi prosedür için yardımcı soğuk aydınlatma ve büyüteçler kullanın. Steril tek kullanımlık laboratuvar önlüğü, cerrahi kılıflar, eldivenler, göz koruması ve yüz maskesinden oluşan KKD giyin. Daha sonra, anestezi uygulanan farenin kürkünü dördüncü kasık meme bezinde tüy dökücü bir kremle çıkarın ve cerrahi bölgeyi steril suya batırılmış bir gazlı bezle durulayın.Daha sonra cilt yüzeyini üç alternatif Betadine ve etanol ovma ile sterilize ederek epilasyonlu cerrahi bölgeyi ameliyat için hazırlayın. İşiniz bittiğinde, forseps kullanarak cildi dört numaralı meme bezinin üzerine nazikçe kaldırın. Cilt vücut duvarından çekildikten sonra, forsepslerin ucundaki dermal tabakanın bir milimetrelik bir bölümünü cerrahi mikromakasla çıkarın.Altta yatan bezi kesmeden, 10 milimetrelik bir kesi oluşturun ve daha sonra forsepslerin nazik hareketi ile meme bezini dermal tabakadan serbest bırakın. Açıkta kalan bezi örtmek için PBS ekleyin. Açıklığın çevresi boyunca bir çanta ipi dikişi oluşturmak için 5-0 ipek örgülü bir dikiş kullanın, ardından meme görüntüleme penceresinin bir kenarını yerleştirin, böylece dermal tabaka meme görüntüleme penceresinin alıcı çentiğine girer.Meme görüntüleme penceresinin karşı ucundaki epiteli gererken, metal meme görüntüleme penceresini yerine itin, böylece dermal tabaka alıcı çentiği tüm meme görüntüleme penceresi çevresine tam olarak oturtur. Ardından, dermal tabakayı çentiğin içine çekmek için çanta ipini sıkıştırın ve pencereyi sabitlemek için katmanı bağlayın. Meme görüntüleme penceresindeki dermal tabakaya topikal bir antibiyotik uygulayın ve fareyi sürekli izleyin.Sternal yatışmayı korumak için yeterli bilinci yeniden kazandıktan sonra, meme görüntüleme penceresi implante edilmiş fareyi kafese yerleştirilmiş bir iglo ile yumuşak yataklara ayrı ayrı yerleştirin ve farenin görüntülemeden önce 48 saat boyunca iyileşmesine izin verin. Görüntüleme için, 30 santigrat dereceye ayarlanmış bir cebri hava sistemi kullanın. Z odağında kaymayı önlemek için ek bir objektif ısıtıcı kullanın ve görüntülemeden önce sistemin en az bir saat boyunca 30 santigrat derecede dengeye gelmesine izin verin.Daha sonra mikroskop aşamasında bir ısıtma odası kurun. Anesteziyi ayak parmağı çimdikleme yöntemiyle onayladıktan sonra, fareye bir göz merhemi ekleyin. Uygun hidrasyonu korumak için, görüntüleme seansı boyunca her iki saatte bir deri altından 0.5 mililitre PBS enjekte edin.Hedefe su yerine su bazlı bir jel uygulayın ve fareyi önceden ısıtılmış mikroskop aşamasına aktarmadan önce meme görüntüleme penceresi camının dışını pamuklu bir aplikatör ve cam temizleyici ile temizleyin. Fareyi mikroskop aşamasına yerleştirdikten sonra, görüntüleri stabilize etmek ve izofluran hortumuna sığdırmak için meme görüntüleme penceresinin yakasını sahne ekindeki 14 milimetrelik bir alma deliğine bastırın. Ardından, mikroskop okülerlerini ve Brightfield aydınlatmasını kullanarak görüntüleme alanını odaklayın ve vaskülatürü kan akışıyla gözlemleyin.Görüş alanının kararlılığını kontrol edin. Solunum hareketi artefaktları varsa, bezin arka tarafına küçük bir köpük blok ve cincture benzeri bir yapışkan bant parçası ile nazik bir sıkıştırma uygulayın. Sıkıştırma uygulandıktan sonra, görüş alanı boyunca kan akışının korunduğunu doğrulayın.Fare sakinleştirildikten ve ters çevrilmiş mikroskop aşamasına güvenli bir şekilde yerleştirildikten sonra, ilgilenilen bölgeleri bulmaya başlayın. Meme görüntüleme penceresine yönlendirilmiş bir ışık kaynağı kullanarak, araştırma için potansiyel alanları tanımlamak için mikroskopun okülerlerini kullanın. Odak noktası vaskülatür ve kan akışını görmek olmalıdır.Yazılımdaki XY konumlarını ekleyin ve kaydedin. Uygun güç seviyeleri ayarlandığında, Z yığınını kurun ve meme görüntüleme penceresinin cam yüzeyinin altında 20 ila 50 mikrometre mesafede bol miktarda kollajen lifinin görünümünü gözlemleyin. Kollajen, mikroskop tümörün derinliklerine indikçe daha az yaygın hale gelecektir.İkinci harmonik jenerasyon veya SHG'deki boşluklar tümör kitlelerinin yerini ortaya çıkarır. Üst Z dilimini yalnız hücre tabakasının altına yerleştirin, ilk kollajen lifleri 50 ila 100 mikronda görünür. Alt Z dilimini, liflerin solduğu ve zayıf sinyalin hakim olduğu 250 mikrometreye ayarlayın.Ardından, kaydedilen tüm XY pozisyonları için prosedürü tekrarlayın. Z yığını aralığı ayarlandıktan sonra, bekleme süresini sekiz mikrosaniyeye çıkarın ve güç ve dedektör ayarlarını optimize edin. Her deney için dokuyu uyarmak için gereken güç seviyelerini optimize edin ve hedefin arka açıklığında 750 nanometrede 90 miliwatt'a veya 890 nanometrede 70 miliwatt'a kadar olan güçleri kullanın.Ardından, çoğu intravital göç filmi için toplama noktaları arasında 10 dakikalık aralıklarla başlayın ve zaman aralıklarını deneysel hedeflere göre ayarlayın. Hücre ağartması veya hızla artan otofloresan ve aşırı fotobeyazlatma gibi fototoksisite belirtileri gözlenirse, koşulların gösterdiği gibi lazer gücünü azaltın veya zaman atlama aralıklarını artırın. Floresan ömür boyu görüntüleme veya NADPH'nin FLIM'si için, önizleme taramasına başlayın ve sabit fraksiyon ayırıcısının veya CFD'nin okunması 10 ila beşinci ve 10 ila altıncı arasında olana kadar lazer gücünü ayarlayın.CFD'yi 10'dan altıncıya kadar aşmak, foton yığılmasına ve genel sonuçların kötü olmasına neden olur. Güç seviyesi ayarlandıktan sonra, entegrasyon süresini 90 ila 120 saniye arasında ayarlayın ve ayrılan süre boyunca görüş alanından fotonlar almak için FLIM koleksiyonunu başlatın. Etiketsiz bir meme tümörü içindeki tipik bir görüş alanı, pencerenin yakınında bol miktarda kollajen lifi ve tümörün derinliklerinde bollukta bir azalma olduğunu göstermiştir.Floresan ömrü veya NADPH kullanımı vaskülatürün tanımlanmasına yardımcı olmuştur. Görüntülerdeki bazı karanlık bölgeler tümör kıvrımları veya bitişik tümör loblarının poposu idi. Vaskülatürü tanımlamak için, NDPH FLIM kullanan kompozit bir görüntü, floresan dekstranın kuyruk damarı enjeksiyonundan önce ve sonra intravital yığının maksimum yoğunluk projeksiyonlarını karşılaştırarak doğrulandı.Temsili analiz, dört farenin miktarını ve görüş alanlarını gösterir. Etiketsiz tümör kitlelerinin sınırlarını belirlemek için NADPH otofloresan kullanıldı. Görüntüler, hücrelerin metabolik imzalarını ve kan damarlarının yerini bildirdi.AFD otofloresansı makrofajları da tanımladı. Segmentasyon şeması ile, etiketsiz tümör sadece SHG ve NADPH otofloresan kullanılarak tümör yuvası, stroma ve vaskülatür için bölmelere bölündü. Ek olarak, stroma ve kollajen lifleri, hizalanmış liflerin yerel bölgelerine de sınıflandırılabilir.Bu protokol için hatırlanması gereken en önemli şey, görüş alanının görüntüleme için sabit kalması için farenin uygun şekilde sakinleştirildiğinden ve kısıtlandığından emin olmaktır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

Hızlandırılmış, etiket içermeyen, nicel faz uyuyan ve aktif insan kanser hücrelerinin çalışma görüntüleme

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Invaziv cerrahi biyopsiye yanıt olarak beyin tümörü hücre davranışının boyuna Intravital görüntüleme

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Intravital görüntüleme ve sabit doku analizi kullanılarak kanserli hücre yaygınlaştırılması ile Ilişkili Metasküler kapı-aracılı vasküler geçirgenlik tümör Mikroortamının değerlendirilmesi

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tümör-Stroma Etkileşimi ve İlaç Keşfini İncelemek İçin Yeni Bir Stromal Fibroblast-Modüle 3D Tümör Küresel Modeli

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Pankreatik adenokarsinomun tümör mikroçevresini araştırmak için proksimal sıvıların izolasyonu

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Şeffaf Silikon Pencerelerle Uzunlamasına İntravital Görüntüleme

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Tümör Mikroçevresinin Mikro Ölçekli Proteomik Analizi için Endüstriyelleşmiş, Yapay Zeka Rehberliğinde Lazer Mikrodiseksiyonu

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...