Name: deploying community scientists to conduct nondestructive genetic sampling of rare butterfly populations
Uploaded: 2022-10-28T12:30:00
Duration: 7 min 17 s
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Les auteurs souhaitent remercier David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge et Jessup Weichelt pour leur aide dans divers aspects du projet, notamment la logistique, la coordination, les permis et/ou la collecte d’échantillons. Cette recherche a été financée par une subvention du U.S. Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) administrée par le Wildlife Management Institute (subvention SA 2021-01).

1. Diffusion des fournitures aux scientifiques de la communauté
<ol><li>Examinez attentivement et rassemblez la liste complète des fournitures liées à la collection nécessaires en consultant le tableau complet des matériaux.</li>
	<li>Si le prélèvement d’échantillons a lieu à plusieurs endroits et/ou par plusieurs personnes ou équipes, rassembler et organiser toutes les fournitures nécessaires dans des unités déployables distinctes (figure 1 et figure 2).</li>
	<li>Transporter des fournitures (unités déployables) aux scientifiques communautaires ou à d’autres membres du personnel responsables de la collecte sur le terrain.</li>
	<li>Si le personnel n’est pas local, emballez soigneusement les fournitures (chaque unité déployable) dans une boîte d’expédition en carton distincte avec une étiquette d’expédition complète et l’expédition. REMARQUE : L’expédition accélérée n’est pas requise à ce stade.</li>
</ol>2. Préparation de la collection scientifique communautaire
<ol><li>À la réception des fournitures de collecte, y compris la boîte à articles de collecte, examinez attentivement la liste des fournitures plastifiées et effectuez un inventaire complet. Avisez le chef de projet s’il manque des fournitures.</li>
	<li>Préremplissez les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL avec 180 μL de tampon de lyse, apposez des étiquettes avec une étiquette d’identification unique préimprimée sur chaque tube de microcentrifugation et placez tous les tubes dans la boîte de stockage des tubes de microcentrifugeuses à 64 puits. Fixez fermement le couvercle après le chargement. REMARQUE : Si les imprimantes d’étiquettes ne sont pas disponibles, apposez des numéros d’identification uniques sur le côté et le couvercle de chaque flacon à l’aide d’un marqueur résistant à l’éthanol.</li>
	<li>Assurez-vous que tout l’équipement numérique (p. ex., téléphone intelligent ou appareil photo) est complètement chargé et que toutes les piles de rechange sont emballées.</li>
	<li>Remplissez partiellement une petite glacière avec de la glace pour l’entreposage sur le terrain et le transport local des échantillons recueillis.</li>
	<li>Emballez toutes les fournitures de collecte dans la boîte de collecte ou dans un conteneur similaire robuste et résistant aux intempéries pour un transport sûr et un stockage consolidé.</li>
	<li>Examinez en détail le protocole de prélèvement d’échantillons génétiques non destructifs avant de vous rendre sur le terrain. REMARQUE : Utilisez le protocole illustré plastifié et condensé pour obtenir des conseils supplémentaires sur le terrain (figure supplémentaire S1 et figure supplémentaire S2).</li>
</ol>3. Prélèvement d’échantillons sur le terrain
<ol><li>À votre arrivée sur le terrain, utilisez un crayon ou un stylo toutes saisons pour consigner dans le carnet de notes de terrain résistant aux intempéries l’heure de la journée, la date, le nom général de la propriété (p. ex., forêt nationale d’Apalachicola), le nom ou la description de l’emplacement précis du site sur le terrain, et la lecture GPS si disponible, ainsi que le nom complet et les rôles de toutes les personnes présentes.</li>
	<li>Localiser un habitat convenable avec la présence d’espèces de plantes hôtes larvaires spécifiques au papillon ciblé. REMARQUE : Soyez prudent pour éviter ou minimiser les impacts sur les habitats sensibles, les populations végétales et la faune. De plus, assurez-vous d’obtenir toutes les autorisations et/ou permis appropriés des propriétaires fonciers avant d’accéder à un site et à des événements de prélèvement d’échantillons.</li>
	<li>À l’aide d’un téléphone intelligent ou d’un appareil photo, prenez des photos détaillées de tous les sites sur le terrain, des lieux de prélèvement d’échantillons, des plantes hôtes et de toute autre information pouvant être pertinente pour le projet. Utilisez des smartphones ou d’autres appareils photo qui enregistrent les coordonnées GPS. REMARQUE: Photo Geotagging doit être activé sur tous les smartphones.</li>
	<li>Effectuez une recherche exhaustive de toutes les parties de la plante hôte larvaire, telles que les feuilles, les boutons floraux, les fleurs ou les fruits en développement, connues pour être sélectionnées par ovipositation (ponte) des papillons femelles adultes pour les œufs éclos. Pour la plupart des Lycaenidae, recherchez des œufs blancs éclos avec un trou distinct au centre ressemblant à un beignet d’où la larve nouveau-née a émergé (Figure 3). Recherchez des œufs non éclos de couleur un peu plus foncée, souvent verts ou bleuâtres, et qui seront complètement intacts sans trou au milieu (Figure 4). Utilisez une lentille à main ou un autre appareil grossissant pour inspecter chaque œuf de près.</li>
	<li>Une fois qu’un œuf éclos a été localisé, mettez des gants en nitrile sur les deux mains.</li>
	<li>À l’aide d’une pince propre, stérile et pointue, saisir et retirer doucement l’œuf éclos de la plante hôte et le placer directement dans un tube microcentrifuge étiqueté prérempli d’un tampon de lyse prélevé dans la boîte de stockage de 64 puits. REMARQUE : Certains matériaux de transfert de plantes hôtes (de moins de 15 mm de diamètre) sont acceptables et normaux pendant la collecte.</li>
	<li>Prélever au moins 5 échantillons par parcelle ou site de plantes hôtes (chacun contenant de 1 à 20 œufs éclos), en visant un total de >50 œufs à un endroit si disponible. REMARQUE : Cela permettra de s’assurer qu’au moins un peu de tissu est prélevé à chaque plante ou parcelle d’échantillon et d’augmenter les chances de détecter l’ADN (observation personnelle).</li>
	<li>Après chaque collecte d’œufs, nettoyez soigneusement les pointes des forceps en les trempant dans un flacon d’éthanol à 95% ou en les aspergeant d’éthanol à 95% dans un flacon pressé ou en utilisant des lingettes alcoolisées. REMARQUE : Cela aidera à minimiser le transfert de tissus entre les prélèvements.</li>
	<li>Si possible, recueillir plusieurs œufs éclos (1 à 20 œufs) de plusieurs plantes dans la même parcelle hôte dans un seul tube de microcentrifugeuse et fermer fermement le couvercle. Pour les espèces de papillons utilisant de plus grandes espèces hôtes herbacées ou ligneuses, prélever plusieurs œufs à différents endroits sur la même plante si les parcelles hôtes sont limitées. NOTE: Les plantes sont dans la même parcelle hôte si leurs feuilles se touchent. S’il y a une séparation physique notable entre les plantes ou les parcelles, cela devrait être considéré comme un échantillon différent. Si vous prélevez un autre type de tissu, comme des exuvies larvaires ou une seule jambe, placez une seule patte, un seul fragment de cuisse ou une seule exuvie larvaire dans un tube microcentrifuge (un échantillon par individu).</li>
	<li>Assurez-vous que tout le matériel recueilli est complètement immergé dans le tampon de lyse dans chaque tube microcentrifuge de 1,5 mL. Tapotez le fond du tube en question sur une surface dure pour réimmerger les échantillons si nécessaire.</li>
	<li>Essuyez les forceps pour sécher avec une lingette de laboratoire propre et jetable. REMARQUE: Un nettoyage soigneux des pinces est essentiel pour éviter la contamination croisée entre les échantillons.</li>
	<li>Lors du prélèvement d’un nouvel échantillon, jetez les gants en nitrile usagés et remplacez-les par une paire propre.</li>
	<li>Dans un carnet de terrain résistant aux intempéries, utilisez un crayon ou un stylo toutes saisons pour consigner l’étiquette d’identification unique attribuée au tube de microcentrifugeuse, ainsi que le type d’échantillon (p. ex. œufs, exuvies larvaires ou cuisse), le nombre approximatif d’œufs éclos et les renseignements sur la collecte tels que le(s) nom(s) du collecteur, la date, l’emplacement, l’espèce de plante hôte et toute note supplémentaire (figure 2).</li>
	<li>Replacez le tube de microcentrifugation fermé contenant l’échantillon de débris d’œufs dans la boîte de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits.</li>
	<li>Entretenez la boîte de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits dans une glacière avec de la glace sur le terrain.</li>
	<li>Conserver toutes les autres fournitures de collecte dans la boîte de collecte sur le terrain pour un entreposage et un transport sûrs et consolidés entre les sites.</li>
</ol>4. Lorsque la collecte sur le terrain est terminée
<ol><li>Assurez-vous que tous les tubes de microcentrifugeuses contenant des échantillons sont dans la boîte de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits dans une glacière avec de la glace pour le transport.</li>
	<li>Replacez toutes les fournitures de collecte sur le terrain dans la boîte à outils de collecte.</li>
	<li>Transportez tous les échantillons au bureau ou au laboratoire et vérifiez soigneusement chaque tube microcentrifuge pour vous assurer que tout le matériel d’échantillon est complètement immergé dans le tampon de lyse.</li>
	<li>Placez la boîte d’entreposage de microcentrifugeuses à 64 puits contenant des échantillons dans un congélateur jusqu’à l’expédition ou le traitement. REMARQUE : Un congélateur commercial moyen de -18 °C est acceptable pour l’entreposage à court terme.</li>
	<li>Évaluez soigneusement toutes les fournitures de la boîte à outils de collecte et remplacez-les au besoin. Remarque : Ceci est particulièrement important si plusieurs événements de collecte de champs sont planifiés.</li>
	<li>Rangez la boîte de collecte dans un endroit sûr jusqu’au prochain événement de collecte sur le terrain.</li>
	<li>Téléchargez toutes les images numériques et assurez-vous qu’elles sont sauvegardées en toute sécurité sur un serveur ou un système de stockage basé sur le cloud.</li>
	<li>Numérisez ou photographiez les pages originales résistantes aux intempéries, les carnets de terrain ou les feuilles de données de terrain contenant les données de collecte jusqu’à ce que toutes les informations puissent être saisies dans une feuille de calcul ou une base de données de projet.</li>
</ol>5. Soumission d’échantillons et de données
<ol><li>Retirez toutes les boîtes de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits avec des échantillons du congélateur.</li>
	<li>Emballez soigneusement les boîtes de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits avec des échantillons et le carnet de terrain ou les fiches techniques de terrain dans une boîte d’expédition standard, joignez l’étiquette d’expédition fournie avec le numéro de compte de l’expéditeur d’origine et envoyez par courrier express garanti, le lendemain, livraison le lendemain au directeur de projet.</li>
	<li>Envoyez par courriel le numéro de suivi du colis et une copie des pages numérisées du carnet de notes ou des fiches techniques de terrain au directeur de projet.</li>
</ol>6. Extraction d’ADN
<ol><li>Une fois les boîtes de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits reçues, stockez-les à -20 °C pour la préservation de l’ADN dans les échantillons jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’extraction de l’ADN.</li>
	<li>En laboratoire, extraire l’ADN en broyant les tissus d’insectes stockés dans un tampon de lyse après décongélation à partir de -20 °C. Ajouter 20 μL de protéinase K et laisser l’échantillon tremper pendant une nuit à 56 °C dans un incubateur chauffé pendant au plus 24 heures.</li>
	<li>Ajouter les tampons de nettoyage et de lavage appropriés, conformément à la recommandation13 du fabricant spécifique.</li>
	<li>Transférer l’échantillon en suspension dans un tampon dans une colonne de spin fixée à un flacon de prélèvement de 2 mL.</li>
	<li>Faire tourner à 6 021 × g pendant 60 s à l’aide d’une centrifugeuse. Ajoutez les tampons de lavage appropriés et faites tourner vers le bas de manière appropriée.</li>
	<li>Libérer l’ADN lié à l’aide d’un tampon d’élusion (30 μL) et faire tourner l’échantillon dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL. Conserver à -20 °C. REMARQUE : Procéder au séquençage si la concentration d’ADN dépasse 0,010 ng/mL. Voir la figure 5 pour la concentration d’ADN par type de tissu.</li>
</ol>7. Analyse des données des séquences d’ADN
<ol><li>Rognez ou modifiez des appels de base de faible qualité dans les séquences résultantes.</li>
	<li>Interroger les séquences dans les bases de données publiques pour confirmer l’identification des espèces.</li>
	<li>Aligner les séquences les unes sur les autres pour comparer les différences entre les individus.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+sampling+of+insect+DNA+from+defensive+secretion.">Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion.</a> Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).</li><li>Feinstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+from+butterfly+frass+and+exuviae.">DNA sequence from butterfly frass and exuviae.</a> Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).</li><li>Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. 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DNeasy Blood &amp; Tissue Kit Quick Start Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&amp;lang=en</a> (2016)</li><li>Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+noninvasive+genetic+sampling+to+survey+rare+butterfly+populations.">Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations.</a> Insects. 10 (10), 311 (2019).</li><li>Wagner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+decline+in+the+Anthropocene:+Death+by+a+thousand+cuts.">Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).</li><li>Montgomery, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+insect+apocalypse+upon+us?+How+to+find+out.">Is the insect apocalypse upon us? How to find out.</a> Biological Conservation. 241, 108327 (2020).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Ce protocole décrit une méthode de terrain pour l’échantillonnage non destructif de papillons rares pour la structure génétique de la population ou les analyses de codage à barres de l’ADN. Les avantages globaux de ce protocole sont spécifiquement conçus pour aider à maximiser la mise en œuvre à grande échelle par des personnes d’expérience et de niveaux de compétence variés, telles que les scientifiques communautaires, les praticiens de la conservation et les étudiants. Il s’agit notamment d’un coût global relativement faible, de fournitures et d’équipements faciles à acquérir, d’une méthode simple et accessible sans de nombreuses étapes trop complexes et d’un déploiement facile sur une vaste zone géographique. Il cible également les matières organiques résiduelles qui éliminent le besoin de capturer ou de manipuler temporairement et, ce faisant, potentiellement nuire aux organismes vivants pour acquérir des échantillons génétiques. De plus, il prolonge la période potentielle disponible pour le prélèvement d’échantillons au-delà de la phénologie traditionnelle ou de la durée de vie d’un stade de vie particulier, ce qui accroît la souplesse et les possibilités globales de prélèvement pour aider à maximiser le nombre d’échantillons. 
Bien que le taxon central de cet effort ait été le papillon lutin givré, un spécialiste de l’habitat répandu mais en déclin, ce protocole peut être appliqué plus largement à de nombreux autres insectes, y compris ceux dont la conservation est préoccupante. De même, bien que le protocole cible la collecte d’œufs éclos comme source de matériel génétique, il peut facilement être adapté à d’autres échantillons, potentiellement plus traditionnels (p. ex. pattes, fragments d’ailes, clips antennaires) ou même à des organismes entiers. Cependant, cet aspect est également une limitation potentielle du protocole. Bien que la grande majorité des étapes soient conçues pour être relativement simples et rapides à réaliser, la recherche exhaustive de parcelles de plantes hôtes larvaires à la recherche d’œufs d’éclosion, qui mesurent généralement <1,0 mm de diamètre, demande beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Néanmoins, une activité d’échantillonnage aussi étendue est particulièrement idéale pour un réseau plus vaste de participants tels que les scientifiques communautaires. 
Comme pour d’autres projets sur le terrain, une préparation minutieuse est essentielle. Cela comprend la réalisation d’un inventaire complet des fournitures nécessaires pour s’assurer qu’aucun article ne manque, que tous les travaux de préparation requis ont été achevés et qu’ils sont bien organisés, emballés en toute sécurité et prêts pour le déploiement sur le terrain. De plus, tout le personnel sur le terrain, en particulier ceux qui effectuent la collecte de tissus, devrait examiner le protocole de collecte en détail avant tout événement de collecte et poser des questions aux personnes qui supervisent le projet. Une fois sur le terrain, la partie du protocole consacrée à la collecte d’échantillons exige une attention méticuleuse aux détails. Cela comprend la localisation et l’inspection minutieuse des ovales pour s’assurer qu’ils sont éclos et donc appropriés pour le prélèvement, le nettoyage en profondeur des pinces, le remplacement des gants pour aider à réduire le transfert de tissus entre les événements d’échantillonnage et l’assurance que les échantillons de tissus sont complètement immergés dans un tampon de lyse dans chaque tube microcentrifuge de 1,5 mL. Enfin, il est essentiel d’enregistrer des données précises et détaillées, ce qui comprend le lien entre l’étiquette d’identification unique attribuée par le tube microcentrifuge et l’échantillon spécifique prélevé et toutes les autres informations pertinentes sur la collecte. Bien que cette étape soit courante dans la recherche scientifique, elle doit souvent être clarifiée et renforcée en profondeur pour un public scientifique communautaire.
Ici, nous démontrons l’effet de levier potentiel des scientifiques communautaires pour la collecte d’échantillons non létaux d’espèces petites, rares et menacées. Cependant, il y a certaines limites potentielles à garder à l’esprit lors de l’analyse des données génétiques résultantes. Par exemple, alors que le regroupement d’échantillons d’un seul patch augmente les chances de récupérer suffisamment d’ADN pour la détection, il introduit également potentiellement une hétérozygotie. De plus, comme le protocole implique la collecte du chorion sur des ovules hachurés, seuls les papillons femelles, représentant l’ADN parental, peuvent être échantillonnés au sein d’une population. Néanmoins, comme aucune donnée génétique antérieure au niveau de la population n’était disponible pour C. irus, les connaissances acquises ne peuvent que bénéficier à la conservation et à la gestion des espèces. Par exemple, bien qu’un plan d’étude approfondi et détaillé et une sélection minutieuse des marqueurs soient nécessaires pour évaluer adéquatement la structure de la population, le protocole d’échantillonnage décrit ici et l’utilisation du codage à barres de l’ADN de la sous-unité 1 de la cytochrome c oxydase (CO1) pourraient être utilisés pour détecter la présence de taxons rares ou en péril. Une discussion supplémentaire sur l’utilité et l’application du séquençage de l’ADN à partir d’échantillons non létaux décrite ici est détaillée par Storer et. al.14.
Au-delà de l’objectif principal de recueillir des échantillons pour l’analyse génétique, le protocole met également l’accent sur le fait que les participants prennent des photographies numériques détaillées de tous les sites sur le terrain, des lieux de collecte, des plantes hôtes larvaires présentes et de tout autre élément de l’habitat environnant qui pourrait être pertinent. Une telle documentation aide à fournir une évaluation générale de l’habitat qui est utile pour illustrer les conditions existantes du site, comme la phénologie des plantes, la densité des ressources de l’hôte et l’historique de la gestion (p. ex. brûlage dirigé récent). Ces renseignements sont particulièrement utiles pour les projets où des échantillons sur le terrain sont prélevés sur une période plus longue afin de permettre des comparaisons environnementales plus détaillées. 
Enfin, alors que le déclin mondial des insectes continue de s’accélérer, il est essentiel d’intensifier les efforts d’évaluation et de surveillancedes espèces 15,16. L’utilisation d’un engagement participatif plus large de la part des scientifiques communautaires, des étudiants (p. ex., stagiaires et boursiers du U.S. Fish and Wildlife Service) et des praticiens de la conservation offre des options de plus en plus viables pour la collecte de données étendues de nombreux types, y compris des échantillons d’ADN. En conséquence, les données générées par ce protocole ont de nombreuses utilisations possibles. Il s’agit notamment d’aider à éclairer les mesures de conservation (p. ex. planification, rétablissement et gestion), les décisions d’inscription ou les évaluations de l’état des espèces, ainsi que la recherche écologique, démographique et taxonomique.

Un échantillonnage génétique efficace des populations de taxons d’insectes rares, en déclin ou inscrits est souvent essentiel pour éclairer les mesures de conservation et de gestion. Des méthodes d’échantillonnage de tissus létaux ou nuisibles sont couramment utilisées pour de nombreuses analyses génétiques. Cependant, ces méthodes sont indésirables ou interdites car elles peuvent nuire aux populations existantes vulnérables ou avoir un impact négatif sur le comportement et la forme physique. Diverses techniques d’échantillonnage non létales ou non invasives impliquant des tissus tels que des pattes entières, des rognures d’antennes ou d’ailes, des exuvies larvaires ou de l’hémolymphe provenant de sécrétions défensives et d’autres produits, tels que frass, ont été appropriées pour la recherche génétique sur les insectes 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . La faisabilité globale et l’applicabilité de ces diverses techniques d’échantillonnage tissulaire varient considérablement en fonction de la biologie, de l’écologie, du comportement, de la taille et de la rareté de l’organisme focal, de la situation et des individus collectant le matériel. Par exemple, les pattes entières ou les coupures d’appendices nécessitent une capture temporaire et une manipulation soigneuse de plusieurs personnes à un stade de vie approprié, généralement par du personnel expérimenté. De même, les sources tissulaires, telles que les exuvies larvaires ou les frass, ne sont probablement pratiques que si les organismes sont en captivité ou détenus temporairement pendant une période adéquate.
Pour les questions de recherche posées au niveau de la population, comme celles concernant la différenciation taxonomique potentielle ou la structure génétique, un échantillonnage à une échelle temporelle ou géographique plus large (c.-à-d. régionale ou continentale) est souvent nécessaire. En conséquence, certaines sources de tissus non invasives peuvent être complètement impraticables ou à tout le moins inefficaces à collecter en quantité. La collecte d’échantillons à de telles échelles peut également être irréalisable ou prohibitive sur le plan logistique ou financier pour les chercheurs individuels ou même pour les petites équipes de terrain. Bien que l’engagement direct des scientifiques de la communauté ait été de plus en plus adopté par le milieu de la recherche pour aider à relever bon nombre de ces défis et accélérer la collecte de mégadonnées, l’adoption a été limitée pour les études impliquant un échantillonnage non destructif, non invasif ou d’ADNe10,11,12.
Pour aider à surmonter certaines de ces limitations potentielles, nous avons démontré que le chorion des ovules de papillons éclos pouvait produire une quantité et une qualité d’ADN suffisamment élevées pour un séquençage génique réussi afin de confirmer l’identité de l’espèce et de quantifier la variation génétique. Nous avons par la suite testé différents protocoles de collecte en utilisant cette technique13. Ce travail pilote a servi de base à d’autres raffinements méthodologiques. Cet article décrit en détail le protocole de collecte sur le terrain révisé simple mais complet qui en a résulté pour les scientifiques communautaires et d’autres membres du personnel non experts. Ce protocole fait partie d’une analyse de la structure de la population à l’échelle de l’aire de répartition du papillon lutin givré (Callophrys irus) afin d’éclairer les futures mesures de conservation et une détermination fédérale d’une éventuelle inscription en vertu de l’Endangered Species Act des États-Unis. Bien que potentiellement plus laborieux que certaines méthodes non invasives, l’absence de contact nécessaire avec les organismes et la facilité d’utilisation en font un modèle potentiellement viable qui peut être appliqué à d’autres programmes de recherche génétique des populations ciblant une sélection d’insectes communs et ceux dont la conservation est préoccupante, qui laissent des débris d’œufs résiduels de nymphes ou de larves récemment écloses. Le langage de protocole présenté ici a été spécifiquement développé pour les papillons de la famille des Lycaenidae et pour être utilisé par des non-experts définis ici comme des scientifiques communautaires ou d’autres individus (par exemple, des biologistes d’agence, des stagiaires) ayant une expérience entomologique limitée.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 quart Igloo Playmate Cooler</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NA</td>
			<td>portable cooler 
			Amount per deployable unit: 1 cooler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>Qiagen DNeasy Blood &#38; Tissue Kit 
			Amount per deployable unit: NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>NC9280166</td>
			<td>ethanol proof lab marker 
			Amount per deployable unit: 2 markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard shipping box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>shipping box 
			Amount per deployable unit: as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>S14091</td>
			<td>lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) 
			Amount per deployable unit: 1 bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FedEx U.S. express airbill</td>
			<td>FedEx</td>
			<td>NA</td>
			<td>shipping return label 
			Amount per deployable unit: 2 labels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>NC9386261</td>
			<td>sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes 
			Amount per deployable unit: 128 tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8&#34; (111 mm) long</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4523</td>
			<td>straight tip forceps 
			Amount per deployable unit: 2 straight forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2&#34; (114 mm) long</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4527</td>
			<td>curved tip forceps 
			Amount per deployable unit: 2 curved forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>kimwipes (or other sterile wipe) 
			Amount per deployable unit: 1 box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminated Illustrated field collection protocol</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>abbreviated protocol 
			Amount per deployable unit: 1 protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminated list of materials</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>supply list 
			Amount per deployable unit: 1 list</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lily Sugar &#39;N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash &#38; Dry</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NA</td>
			<td>pink yarn (to secure to forceps for visibility) 
			Amount per deployable unit: 2 yards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe by Bausch &#38; Lomb, 10x Coddington Magnifier</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NA</td>
			<td>hand lens 
			Amount per deployable unit: 2 hand lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle &#38; Latch Lock</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NA</td>
			<td>supply storage box 
			Amount per deployable unit: 1 box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>60NU14</td>
			<td>nitrile lab gloves (large) 
			Amount per deployable unit: 1 box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>60NU13</td>
			<td>nitrile lab gloves (medium) 
			Amount per deployable unit: 1 box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Inc.&#160;BUFFER ATL (200 ML)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19076</td>
			<td>Qiagen ATL lysis buffer 
			Amount per deployable unit: 180 &#181;l/tube; 128 tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NA</td>
			<td>weatherproof field notebook 
			Amount per deployable unit: 1 notebook</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Showgard Professional Stamp Tongs 6&#34; 904 Round Tip Tweezers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NA</td>
			<td>6&#34; spade tip forceps 
			Amount per deployable unit: 2 long spade forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>18-366-231</td>
			<td>alcohol wipes 
			Amount per deployable unit: 100 wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific CryoBoxes</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>12-565-227</td>
			<td>64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes 
			Amount per deployable unit: 2 boxes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>packing material 
			Amount per deployable unit: as needed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deploying community scientists to conduct nondestructive genetic sampling of rare butterfly populations

Le déclin mondial des insectes continue de s’accélérer. Un échantillonnage génétique efficace est essentiel pour faire progresser la compréhension de nombreux taxons et combler les lacunes existantes dans les connaissances. Ce protocole représente une méthode éprouvée pour l’échantillonnage non destructif de papillons rares pour la structure génétique de la population ou les analyses de codage à barres de l’ADN. Il utilise le chorion des ovules de papillons éclos pour produire une quantité et une qualité d’ADN suffisamment élevées pour un séquençage réussi des gènes afin de confirmer l’identité de l’espèce et de quantifier la variation génétique. Il peut être particulièrement utile lorsque d’autres techniques d’échantillonnage de tissus ne sont pas pratiques ou indisponibles. Bien que développé pour un lépidoptère, il pourrait néanmoins être facilement adapté pour être utilisé avec d’autres espèces d’insectes. Il a été spécialement conçu avec la facilité d’utilisation comme objectif d’aider à maximiser la mise en œuvre à grande échelle par des personnes de différents niveaux d’expérience et de compétence, tels que les scientifiques communautaires, les praticiens de la conservation et les étudiants, et pour une utilisation dans de vastes zones géographiques afin de faciliter un large échantillonnage de la population. Les données générées peuvent aider à éclairer les décisions taxonomiques et d’inscription, les mesures de conservation et de gestion, et améliorer la recherche écologique fondamentale.

Le matériel nécessaire à la collecte de 563 échantillons a été envoyé à huit scientifiques de la conservation et des communautés de neuf États de l’aire de répartition de l’espèce dans l’est de l’Amérique du Nord. Les documents ont été envoyés pendant trois mois en 2021 avant les heures de pointe de vol locales. À ce jour, nous avons reçu un total de 160 échantillons de tissus de C. irus qui ont été prélevés (tableau 1). L’ADN génomique a été extrait selon un protocole détaillé par Storer et coll.14 pour ce type d’échantillon. Sur ces 160 échantillons, l’ADN a été extrait avec succès de 88 avec une concentration moyenne de 1,67 ng / μL (SE ± 2,98), et le rendement en ADN le plus élevé était de 26,8 ng / μL. Les concentrations ont été quantifiées à l’aide d’une trousse d’essai à haute sensibilité selon les instructions du fabricant avec 2 μL d’extrait.
Bien que le nombre total d’échantillons reçus soit considérablement inférieur à celui du nombre total total de matériaux déployés pour la collecte, il s’agit principalement d’un artefact consistant à fournir une surabondance de matériel de collecte au collecteur principal ou au chef d’équipe pour lui permettre d’avoir le maximum de souplesse pour inclure plusieurs sites de collecte et/ou scientifiques communautaires impliqués, s’il le souhaite. De plus, C. iris est un taxon rare et en déclin représenté par des populations limitées et souvent relativement petites dans toute son aire de répartition existante. Malgré cette contrainte, le nombre total d’échantillons de tissus reçus est important, surtout par rapport à ce à quoi on pourrait s’attendre avec un échantillonnage plus traditionnel de papillons adultes individuels.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig01.jpg"> Figure 1 : Unités déployables individuelles de toutes les fournitures nécessaires en attente d’expédition aux scientifiques communautaires ou à d’autres membres du personnel responsables de la collecte sur le terrain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig02.jpg"> Figure 2 : Unité individuelle déployable comprenant toutes les fournitures, la boîte de collecte en plastique transparent et l’étiquette de transporteur express remplie en attente d’expédition aux scientifiques communautaires ou à d’autres membres du personnel responsables de la collecte sur le terrain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig03.jpg"> Figure 3 : Photo de l’œuf de papillon lutin givré (Callophrys irus) éclos sur le lupin sauvage (Lupinus perennis) montrant un trou distinct au centre d’où la larve nouveau-née a émergé. Notez que la couleur générale de l’œuf éclos est blanche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig04.jpg"> Figure 4 : Photo d’œufs de papillon elfe givré (Callophrys irus) éclos non éclos sur lupin sauvage (Lupinus perennis). Notez que les œufs non éclos n’ont pas de trou central visible et que leur couleur générale est vert bleuâtre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig05.jpg"> Figure 5 : Concentration d’ADN par type de tissu. Les lignes médianes de la boîte représentent la médiane, chaque boîte étend l’IQR et les moustaches de boîte sont de 1,5 × IQR, tous les points à l’extérieur étant des valeurs aberrantes. Les échantillons contenant un seul cas d’œufs n’avaient qu’un seul cas d’œufs, et les échantillons contenant plusieurs cas d’œufs avaient au moins deux cas, le nombre de cas allant de 2 à 20 (moyenne = 5,3) par échantillon. Abréviation : IQR = intervalle interquartile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>État</td>
			<td>Étui à oeufs</td>
			<td>Caisses d’œufs</td>
			<td>Cécile</td>
			<td>Jambe</td>
			<td>Muer</td>
			<td>Total général</td>
		</tr><tr><td>Arkansas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Floride</td>
			<td>3</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td>7</td>
			<td>22</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Michigan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>New Hampshire</td>
			<td>24</td>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td>15</td>
			<td></td>
			<td>45</td>
		</tr><tr><td>New York</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30</td>
			<td></td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>Ohio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Wisconsin</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>Oklahoma</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16</td>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>Total général</td>
			<td>36</td>
			<td>21</td>
			<td>16</td>
			<td>65</td>
			<td>22</td>
			<td>160</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Nombre et type de matériel tissulaire collecté par État. 
Figure supplémentaire S1 : Page d’accueil du protocole recto-verso, laminé, condensé et illustré à utiliser sur le terrain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416_Supplemental%20Fig%20S2.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2. Page arrière du protocole illustré recto-verso, laminé, condensé et à utiliser sur le terrain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416_Supplemental%20Fig%20s1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations

Ici, nous présentons un protocole simple pour l’échantillonnage génétique non invasif des populations de papillons basé sur la collecte sur le terrain de débris d’œufs résiduels. Il peut être utilisé pour confirmer l’identité de l’espèce et quantifier la variation génétique. Ce protocole peut être facilement adapté à des groupes plus larges pour la participation scientifique communautaire.

Déployer des scientifiques communautaires pour effectuer des échantillonnages génétiques non destructifs de populations de papillons rares

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address ...

Ce protocole utilise une nouvelle approche d’échantillonnage du chorion du papillon éclos ovi pour l’analyse génétique. Il peut être particulièrement utile lorsque d’autres techniques d’échantillonnage de tissus ne sont pas pratiques, indisponibles ou non autorisées. Ce protocole a un coût global relativement faible en utilisant des fournitures faciles à acquérir et cible la matière organique résiduelle qui élimine le besoin de capturer ou de manipuler temporairement et potentiellement nuire aux organismes vivants pour acquérir des échantillons génétiques.Le protocole global est simple et facile à apprendre, mais exige de la dextérité et une attention stricte aux détails, en particulier pour localiser, identifier et retirer avec succès de très petits échantillons cibles afin d’éviter la contamination croisée entre les événements de prélèvement d’échantillons. Commencez par examiner attentivement et rassembler la liste complète des fournitures liées à la collecte nécessaires. Si le prélèvement d’échantillons a lieu à plusieurs endroits ou par plusieurs personnes ou équipes, rassembler et organiser toutes les fournitures nécessaires dans des unités déployables distinctes.Transporter les fournitures aux scientifiques de la communauté ou à d’autres membres du personnel responsables de la collecte sur le terrain. Si le personnel n’est pas local, emballez soigneusement les fournitures dans une boîte d’expédition en carton séparée avec une étiquette d’expédition complète et expédiez-les. À la réception des fournitures de collecte, y compris la boîte d’articles de collecte, examinez attentivement la liste des fournitures plastifiées et effectuez un inventaire complet.Avisez le chef de projet s’il manque des fournitures. Préremplissez les tubes microcentrifugeuses de 1,5 millilitre avec 180 microlitres de tampon de lyse. Apposez une étiquette d’identification unique préimprimée sur chaque tube de microcentrifugeuse et placez tous les tubes dans la boîte de stockage de tubes de microcentrifugeuses à 64 puits.Fixez fermement le couvercle après le chargement. Assurez-vous que tous les équipements numériques sont complètement chargés et que toutes les batteries de rechange sont emballées. Remplissez partiellement une petite glacière avec de la glace pour l’entreposage sur le terrain et le transport local des échantillons recueillis.Emballez toutes les fournitures de collecte dans la boîte d’articles de collecte ou dans un conteneur similaire robuste et résistant aux intempéries pour un transport sûr et un stockage consolidé. Passez en revue le protocole de collecte d’échantillons génétiques non destructifs et les détails avant de vous rendre sur le terrain. À votre arrivée sur le terrain, utilisez un crayon ou un stylo toutes saisons pour noter l’heure de la journée, la date, le nom général de la propriété, le nom ou la description de l’emplacement du site sur le terrain, la lecture GPS si disponible, ainsi que le nom complet et les rôles de toutes les personnes présentes dans le carnet de notes de terrain résistant aux intempéries.Trouver un habitat convenable pour la présence d’une plante hôte larvaire sur le papillon cible propre à l’espèce. À l’aide d’un téléphone intelligent ou d’un appareil photo, prenez des photos détaillées de tous les sites sur le terrain, des lieux de prélèvement d’échantillons, des plantes hôtes et d’autres informations pertinentes. Utilisez des smartphones ou d’autres appareils photo qui enregistrent les coordonnées GPS.Effectuez une recherche exhaustive de toutes les parties larvaires de la plante hôte, telles que les feuilles, les boutons floraux, les fleurs ou les fruits en développement connus pour être sélectionnés par des papillons femelles adultes qui posent des ovules pour les œufs éclos. Pour la plupart des Lycaenidae, recherchez des œufs éclos blancs avec un trou distinct au centre ressemblant à un beignet d’où la larve nouveau-née a émergé. Recherchez des œufs non éclos de couleur plus foncée, souvent verts ou bleuâtres, et qui seront complètement intacts sans trou au milieu.Une fois qu’un œuf éclos est localisé, portez des gants en nitrile. À l’aide de pinces stériles et pointues, saisir et retirer doucement l’œuf éclos de la plante hôte et le placer directement dans un tube microcentrifuge étiqueté prérempli de tampon de lyse. De même, d’autres échantillons de tissus peuvent être utilisés et traités.Assurez-vous que tout le matériel collecté est complètement immergé dans le tampon de lyse dans chaque tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Tapotez le fond du tube sur une surface dure pour réimmerger les échantillons si nécessaire. Lors du prélèvement d’un nouvel échantillon, jetez les gants en nitrile usagés et remplacez-les par une paire propre.Après chaque collecte d’œufs, nettoyez soigneusement les pointes des forceps en les trempant ou en les aspergeant dans un flacon d’éthanol à 95 % provenant d’un flacon pressé ou en utilisant des lingettes imbibées d’alcool. Prélever au moins cinq échantillons par parcelle de plante hôte par site, chaque échantillon contenant un à 20 œufs, en visant un total de plus de 50 œufs à un endroit si disponible. Recueillir un à 20 œufs éclos de plusieurs plantes dans la même parcelle hôte dans un seul tube microcentrifuge et fermer fermement le couvercle.Pour les espèces de papillons utilisant de plus grandes espèces hôtes herbacées ou ligneuses, prélever plusieurs œufs à différents endroits sur la même plante si les parcelles hôtes sont limitées. Dans le carnet de notes de terrain résistant aux intempéries, notez l’étiquette d’identification unique attribuée ainsi que le type d’échantillon, le nombre approximatif d’œufs éclos et les renseignements sur le prélèvement. Replacez le tube de microcentrifugation fermé contenant l’échantillon de débris d’œufs dans la boîte de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits.Conservez la boîte de rangement dans une glacière avec de la glace sur le terrain. Placez toutes les autres fournitures de collecte dans la boîte d’articles de collecte pour un entreposage et un transport sûrs et consolidés entre les sites. Sur ces 160 échantillons, l’ADN a été extrait avec succès de 88 avec une concentration moyenne de 1,67 nanogramme par microlitre et le rendement en ADN le plus élevé était de 26,8 nanogrammes par microlitre.Les concentrations d’ADN par type de tissu ont confirmé que les échantillons contenant un seul débris d’œuf n’avaient qu’un seul cas d’œuf et que les échantillons contenant plusieurs cas d’œufs avaient au moins deux cas, le nombre de cas allant de deux à 20, soit une moyenne de 5,3 par échantillon. Le matériel nécessaire à la collecte de 563 échantillons a été envoyé à huit scientifiques de la conservation et des communautés de neuf États de l’aire de répartition de l’espèce dans l’est de l’Amérique du Nord. Les documents ont été envoyés pendant trois mois en 2021 avant les heures de pointe de vol locales.Au total, 160 échantillons de tissus d’iris de Calephelis ont été reçus. Il est essentiel de minimiser la contamination croisée entre les échantillons, de s’assurer que l’échantillon prélevé est complètement immergé dans le tampon de lyse et d’enregistrer avec précision l’étiquette d’identification unique et les données de prélèvement pour chaque échantillon. Ce protocole a permis aux scientifiques de la communauté de se déployer et de les utiliser à grande échelle pour échantillonner de manière non destructive les populations existantes d’un papillon rare afin d’aider à effectuer une analyse de la structure génétique à l’échelle de la gamme.

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