Name: a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay at JoVE.com

这项研究由国家卫生和医学研究委员会对JRM和CJT（ID 1163732）的项目赠款资助，部分由维多利亚州政府的运营基础设施支持计划资助。SB由贝克心脏和糖尿病研究所 - 拉筹伯大学联合博士奖学金支持。KLW得到了The Shine On Foundation和澳大利亚国家心脏基金会（ID 102539）的未来领袖奖学金的支持。JRM由国家卫生和医学研究委员会高级研究奖学金（ID 1078985）提供支持。

动物护理和实验的各个方面都是按照弗洛里神经科学和心理健康研究所的指导方针和澳大利亚科学目的动物护理和使用守则进行的，遵循参考文献25。1.5-3岁的美丽诺母羊用于研究。 图1提供了测定方案的示意图。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63419/63419fig01.jpg"> 图1：N...

该报告描述了一种比色测定法，该测定法通过评估与 体外 病毒转导程度相对应的显色反应来评估给定血清样品中AAV中和的程度。该方案的开发基于碱性磷酸酶与NBT / BCIP之间的已知显色反应，NBT / BCIP已被广泛用作免疫组织化学等应用中检测蛋白质靶标的染色工具，并作为评估病毒转导的报告工具24，33，34，<sup c...

腺相关病毒（AAV）越来越多地被用作将基因疗法递送到影响心血管，肺，循环，眼部和中枢神经系统的各种健康状况的试验治疗的载体1，2，3，4，5。AAV载体作为领先的基因治疗平台的受欢迎程度源于其积极的安全性，长期转基因表达和广泛的组织特异性倾向1，6。动物研究的成功结果为五十多项AAV基因治疗临床试验铺平了道路，这些临床试验已成功达到其疗效终点7，以及美国食品和药物管理局批准的首个市售AAV基因治疗药物的发布8。继最初的成功之后，AAV作为首选载体继续在基础和临床研究领域获得牵引力，并且是目前美国和欧洲唯一批准用于临床的体内基因疗法9。尽管如此，预先存在的针对AAV载体衣壳的中和抗体（NAbs）的存在仍然是临床前研究和临床试验疗效的障碍。NAbs存在于幼稚的人类和动物种群中，并在体内施用AAV载体1后抑制基因转导。AAV血清阳性是大多数基因治疗试验的排除标准，因此宿主免疫的初步筛查在实验室和临床中都至关重要。建立一种可以检测NAbs对AAV存在的测定是任何基于AAV基因治疗的研究项目管道中必不可少的一步。本报告重点介绍AAV6，由于其在横纹肌（心脏和骨骼肌）中的高效和选择性转导，研究人员一直对AAV6感兴趣1，10，11，12。基因治疗被认为是一种针对心脏的有前途的策略，因为如果没有侵入性的心脏直视手术，很难专门针对心脏。
中和活性通常使用基于细胞的体外或体内转导抑制测定法测定。体内 NAb测定通常涉及将来自测试对象（例如，人类或大型动物）的血清施用于小鼠体内，然后使用具有报告基因的AAV，然后测试报告基因或相应抗原的表达。体外检测通过将来自人类或大型动物的血清或血浆与表达报告基因的重组 AAV （rAAV） 以连续稀释液培养来确定 NAb 滴度。细胞被血清/病毒混合物感染，并与对照组相比，评估报告基因表达被抑制的程度。体外检测广泛用于NAb筛选，因为与体内测定相比，其成本相对较低，测试速度快，标准化和验证能力更强13，14。据报道，体内测定通常具有更高的灵敏度15，16，但对体外测定也提出了相同的要求14，17。
迄今为止， 体外 NAb测定主要使用发光（荧光素酶）作为报告基因来检测中和。尽管基于光的方法在许多情况下都有其优点，但在某些情况下，比色/显色NAb测定可能是有利的。用于评估中和的比色法已成功用于其他病毒，如流感和腺病毒18，19。它们的吸引力源于其简单性，低成本以及对日常实验室仪器和工具的要求20。使用基于发光的报告基因的NAb检测需要昂贵的底物试剂盒、光度计和相应的软件进行分析21。这种比色测定的优点是只需要光学显微镜和非常便宜的底物。比色法与发光法的灵敏度报告产生了相互矛盾的结果。一项研究表明，基于发光的 ELISA 检测方法与比色法相比具有更高的灵敏度和可比的再现性22，而另一项研究表明，基于比色法的 ELISA 检测可赋予更高的灵敏度23。这里，提供了针对AAV 的体外 NAb测定的详细方案，该方案利用编码碱性磷酸酶（AP）报告基因的AAV与硝基蓝色四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸（NBT / BCIP）底物之间的显色反应。该分步方案是根据先前的一份报告开发的，该报告利用hPLAP（人胎盘碱性磷酸酶）报告基因（AAV6-hPLAP）来检测针对AAV24的中和活性。该测定具有成本效益，具有时效性，易于设置，并且需要最少的技术技能，实验室设备和试剂。此外，这种测定的简单性使其有可能针对不同类型的细胞，组织或病毒血清型的广泛应用进行优化。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 square flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottomed plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6-CMV-hPLAP Vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Muscle Research &#38; Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>610159</td>
			<td>Positive control monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>SIGMAFAST</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and tissue culture safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 &#38; 10 mL stripette inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT1080 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of taking photos with a 4x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For a 65 &#176;C incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 &#956;L, 200 &#956;L &#38; 1 mL single pipettes and tips &#38; 200 &#956;L multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup quick release filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td>Used for combining media reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>455071</td>
			<td>Used for serum collection &#38; processing from sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay

重组腺相关病毒（rAAV）已被证明是转移遗传物质以治疗实验室和临床各种健康状况的安全和成功的载体。然而，预先存在的针对AAV衣壳的中和抗体（NAbs）对在大型动物实验模型和人类群体中成功施用基因疗法构成了持续的挑战。对宿主对AAV的免疫力进行初步筛查是必要的，以确保基于AAV的基因疗法作为研究工具和临床上可行的治疗剂的有效性。该协议描述了一种比色 体外 测定，以检测针对AAV血清型6（AAV6）的中和因子。该测定利用编码碱性磷酸酶（AP）报告基因的AAV与其底物NBT / BCIP之间的反应，其组合产生不溶性可量化的紫色染色剂。 
在该协议中，将血清样品与表达AAV的AP结合并孵育以允许潜在的中和活性发生。随后将病毒血清混合物添加到细胞中，以允许任何未中和的AAV的病毒转导。加入NBT / BCIP底物并进行显色反应，对应于病毒转导和中和活性。使用免费软件工具定量着色区域的比例，以产生中和滴度。该测定显示着色与病毒浓度之间具有很强的正相关关系。在给予重组AAV6之前和之后对绵羊血清样本的评估导致中和活性急剧增加（增加125至>10，000倍）。该测定显示出足够的灵敏度，可以检测>1：32，000血清稀释液中的中和活性。该测定提供了一种简单、快速且经济高效的方法来检测针对 AAV 的 NAb。

转导测定，以确定板覆盖的最佳病毒剂量 HT1080细胞是一种成熟的纤维肉瘤细胞系，被选择用于该测定。浓度为1×104 HT1080细胞/孔，在96孔板的每个孔中提供〜50%的细胞汇合度。为了确定测定的最佳病毒浓度，在每个细胞的含vg颗粒浓度范围内（MOI：0，150 ，500，1500，1500，1500，500，1500，5000，1500，15000，15000，5000，5000和150000）的范围内...

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A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

介绍了全面的实验室实验方案和分析工作流程，用于快速、经济高效且直接的基于细胞的比色测定，以检测针对 AAV6 的中和元素。

使用基于比色细胞的测定法检测针对 AAV 的中和抗体的分步方法

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

先前存在的中和AAV的抗体对AAV基因疗法的进步构成了障碍。该测定是一种筛选工具，用于检测针对AAV的中和抗体。主要优点是它具有成本效益，省时性，易于设置，并且需要最少的技术技能，实验室设备和试剂。在第一天开始接种HT1080细胞，方法是在预热的完整DMEM培养基中将细胞稀释至每毫升1×10至第五个细胞的浓度。然后将每孔100微升细胞接种到透明的96孔平底板中，浓度为每孔1×10至第四个细胞。将板在37摄氏度下与5%二氧化碳孵育过夜16至22小时。第二天，使用预热的完整DMEM在1.5毫升微量离心管中生成目标血清样品的连续稀释液。向每个具有稀释血清样品的试管中，向每个微升病毒工作溶液中的66微升7.5x10加入66微升病毒基因组。通过移液混合病毒血清稀释液，然后将含有病毒血清混合物的管子置于37摄氏度的培养箱中，其中5%二氧化碳30分钟，以允许潜在的中和发生。30分钟后，将100微升病毒血清混合物移液到含有每孔1x10至第四个细胞的96孔板上的每个孔中，然后将板包裹在箔中，置于37摄氏度的培养箱中，用5%二氧化碳过夜16至24小时。在第三天，使用通风橱真空从96孔板的孔中吸出培养基，而不会破坏粘附的细胞，并向每个孔中加入50微升4%多聚甲醛。用铝箔包裹板后，在室温下放置10分钟。之后，在室温下用200微升PBS洗涤并吸出细胞两次。第二次洗涤后，将200微升预热的PBS移液到每个孔中，并将板包裹在箔中，然后在65摄氏度下孵育90分钟以变性内源性碱性磷酸酶活性，然后在50微升下将新鲜制备的溶解的BCIP / NBT孵育到每个孔中，并在室温下孵育包裹的板2至24小时。之后，在光学显微镜相机中使用4X物镜拍摄每个孔的照片，确保在所有测定中始终如一地使用相同的曝光，白平衡和光设置。要分析 ImageJ 中的图像，请选择该文件，然后单击"打开"。对于彩色图像，请按顺序选择"图像"、"类型"和"8 位"选项卡，转换为灰度。然后转到"图像"选项卡并选择"调整"和"阈值"以更改阈值，直到所有彩色区域都变为彩色和红色，但背景不是。单击"分析和设置测量值"，然后勾选"面积"、"面积分数"、"阈值限制"和"显示标签"复选框，OK.To 然后单击"分析和测量"，然后单击"分析和测量"，以便弹出窗口的"面积百分比"列显示信号读数。该研究通过在病毒基因组的一定浓度范围内的细胞中添加AAV6-hPLAP报告基因来确定最佳病毒剂量。15， 000的多重感染赋予36%的板着色，并被选为最佳病毒剂量。代表性分析显示了着色与感染多样性之间的相关性。获得不影响着色与病毒浓度之间线性相关性的最高测试浓度。在对数10稀释时抗AAV6单克隆抗体或AAV6抗腺结合病毒或AAV6的中和活性的研究表明，在浓度为每毫升10纳克时，AAV6转导或TI50的抑制率为50%。在中和抗体或NAb测定中，AAV中和程度在幼稚样品群体内变化，TI50滴度范围为1/2至1/80。测定结果表明，AAV给药前AAV抑制TI50滴度值范围为1/4至1/80。AAV给药后，TI50滴度增加到1/2000至大于1/32， 000之间，显示出AAV给药前后滴度值的明显对比。在拍摄孔的照片时，重要的是在整个测定过程中始终使用相同的显微镜设置，并确保照片直接在孔的中心拍摄。

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