Name: a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay at JoVE.com

Denne undersøgelse blev finansieret af et National Health and Medical Research Council Project Grant til JRM og CJT (ID 1163732) og delvist af den victorianske regerings Operational Infrastructure Support Program. SB støttes af et fælles Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral Scholarship. KLW er støttet af The Shine On Foundation og et Future Leader Fellowship fra National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM støttes af et National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (ID 1078985).

Alle aspekter af dyrepleje og eksperimenter blev udført efter Florey Institute of Neuroscience and Mental Health retningslinjer og den australske kode for pleje og brug af dyr til videnskabelige formål efter Reference25. 1,5-3-årige Merino-moderfår blev brugt til undersøgelsen. En skematisk oversigt over assayprotokollen findes i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63419/...

Denne rapport beskriver et kolorimetrisk assay, der vurderer omfanget af AAV-neutralisering i en given serumprøve ved at evaluere en kromogen reaktion svarende til graden af in vitro-viral transduktion. Udviklingen af protokollen var baseret på den kendte kromogene reaktion mellem enzymet alkalisk phosphatase og NBT/BCIP, som i vid udstrækning er blevet anvendt som et farvningsværktøj til påvisning af proteinmål i applikationer såsom immunhistokemi og som et reporterværktøj til evaluering af viral tran...

Adeno-associerede vira (AAV) anvendes i stigende grad som vektorer til levering af genterapier til forsøgsbehandlinger for forskellige sundhedsmæssige tilstande, der påvirker kardiovaskulære, lunge-, kredsløbs-, okulære og centralnervesystemer1,2,3,4,5. Populariteten af AAV-vektorer som en førende genterapiplatform stammer fra deres positive sikkerhedsprofil, langsigtede transgene ekspression og vidtrækkende vævsspecifikke tropismer1,6. Vellykkede resultater i dyreforsøg har banet vejen for over halvtreds kliniske forsøg med AAV-genterapi, der med succes har nået deres effektendepunkter7, samt frigivelsen af det første kommercielt tilgængelige AAV-genterapilægemiddel, der er godkendt af US Food and Drug Administration8. Efter de første succeser har AAV fortsat vundet indpas i grundforsknings- og klinisk forskningssektorerne som en valgfri vektor og er i øjeblikket den eneste in vivo-genterapi, der er godkendt til klinisk brug i USA og Europa9. Ikke desto mindre er tilstedeværelsen af allerede eksisterende neutraliserende antistoffer (NAb'er) mod AAV-vektorkapsider fortsat en hindring for både præklinisk forskning og effekten af kliniske forsøg. NAb'er er til stede i både naive humane og animalske populationer og hæmmer gentransduktion efter in vivo-administration af en AAV-vektor1. AAV-seropositivitet er et udelukkelseskriterium for de fleste genterapiforsøg, og derfor er foreløbig screening for værtsimmunitet afgørende i både laboratoriet og klinikken. Etablering af et assay, der kan detektere tilstedeværelsen af NAb'er mod AAV, er et vigtigt skridt i pipelinen for ethvert AAV-genterapibaseret forskningsprojekt. Denne rapport fokuserer på AAV6, som har været af interesse for forskere på grund af dens effektive og selektive transduktion i stribet muskel (hjerte- og skeletmuskulatur)1,10,11,12. Genterapi betragtes som en lovende strategi for at målrette mod hjertet, fordi det er svært at målrette specifikt mod hjertet uden invasive åbne hjerteprocedurer.
Neutraliserende aktivitet bestemmes normalt ved anvendelse af enten et cellebaseret in vitro- eller in vivo-transduktionshæmningsassay. In vivo NAb-assays involverer normalt administration af serum fra en forsøgsperson (f.eks. humant eller stort dyr) i mus, efterfulgt af en AAV med et reportergen efterfulgt af test for ekspression af reportergenet eller tilsvarende antigen. In vitro-assays bestemmer NAb-titre ved at inkubere serum eller plasma fra et humant eller stort dyr i serielle fortyndinger med en rekombinant AAV (rAAV), der udtrykker et reportergen. Celler inficeres med serum/virus-blandingen, og i hvilket omfang reportergenekspressionen hæmmes, vurderes i forhold til kontroller. In vitro-assays anvendes i vid udstrækning til NAb-screening på grund af deres forholdsvis lavere omkostninger, hurtighed i test og større kapacitet til standardisering og validering13,14 sammenlignet med in vivo-assays. In vivo-assays rapporteres ofte at have større følsomhed15,16, men den samme påstand er blevet fremsat vedrørende in vitro-assays14,17.
Hidtil har in vitro NAb-assays hovedsageligt brugt luminescens (luciferase) som reportergenet til at detektere neutralisering. Selvom en lysbaseret metode har fortjeneste i mange sammenhænge, kan et kolorimetrisk/kromogent NAb-assay være fordelagtigt under visse omstændigheder. Kolorimetriske assays til vurdering af neutralisering er blevet anvendt med succes for andre vira såsom influenza og adenovirus18,19. Deres tiltrækningskraft skyldes deres enkelhed, lavere omkostninger og kravet om kun daglige laboratorieapparater og værktøjer20. NAb-assays, der bruger et luminescensbaseret reportergen, kræver dyre substratsæt, et luminometer og tilsvarende software til analyse21. Dette kolorimetriske assay har den fordel, at det kun kræver et lysmikroskop og et meget billigt substrat. Rapportering af følsomheden af kolorimetriske versus selvlysende assays har givet modstridende resultater. En undersøgelse foreslog, at luminescensbaserede ELISA-assays viser større følsomhed og sammenlignelig reproducerbarhed med kolorimetriske assays22, mens en anden fandt kolorimetrisk-baserede ELISA-assays for at give større følsomhed23. Her tilvejebringes en detaljeret protokol for et in vitro NAb-assay mod AAV, der anvender den kromogene reaktion mellem et AAV-koder for et alkalisk phosphatase (AP) reportergen og et nitroblåt tetrazolium /5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (NBT / BCIP) substrat. Denne trinvise protokol blev udviklet på baggrund af en tidligere rapport, der anvendte et hPLAP (humant placental alkalisk phosphatase) reportergen (AAV6-hPLAP) til at detektere neutraliserende aktivitet mod AAV24. Dette assay er omkostningseffektivt, tidseffektivt, let at konfigurere og kræver minimale tekniske færdigheder, laboratorieudstyr og reagenser. Desuden giver enkelheden i dette assay det potentialet til at blive optimeret til brede anvendelser på tværs af forskellige typer celler, væv eller virale serotyper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 square flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottomed plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6-CMV-hPLAP Vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Muscle Research &#38; Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>610159</td>
			<td>Positive control monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>SIGMAFAST</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and tissue culture safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 &#38; 10 mL stripette inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT1080 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of taking photos with a 4x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For a 65 &#176;C incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 &#956;L, 200 &#956;L &#38; 1 mL single pipettes and tips &#38; 200 &#956;L multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup quick release filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td>Used for combining media reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>455071</td>
			<td>Used for serum collection &#38; processing from sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay

Rekombinante adeno-associerede vira (rAAV) har vist sig at være en sikker og vellykket vektor til overførsel af genetisk materiale til behandling af forskellige sundhedsmæssige forhold i både laboratoriet og klinikken. Imidlertid udgør allerede eksisterende neutraliserende antistoffer (NAb'er) mod AAV-kapsider en løbende udfordring for den vellykkede administration af genterapier i både store dyreforsøgsmodeller og humane populationer. Foreløbig screening for værtsimmunitet mod AAV er nødvendig for at sikre effekten af AAV-baserede genterapier som både et forskningsværktøj og som et klinisk levedygtigt terapeutisk middel. Denne protokol beskriver et kolorimetrisk in vitro-assay til påvisning af neutraliserende faktorer mod AAV-serotype 6 (AAV6). Assayet udnytter reaktionen mellem en AAV, der koder for et alkalisk fosfatase (AP) reportergen og dets substrat NBT / BCIP, som genererer en uopløselig kvantificerbar lilla plet ved kombination. 
I denne protokol kombineres serumprøver med en AAV, der udtrykker AP og inkuberes for at tillade potentiel neutraliserende aktivitet at forekomme. Virusserumblanding tilsættes efterfølgende til celler for at muliggøre viral transduktion af eventuelle AAV'er, der ikke er blevet neutraliseret. NBT/BCIP-substratet tilsættes og gennemgår en kromogen reaktion svarende til viral transduktion og neutraliserende aktivitet. Andelen af farvet areal kvantificeres ved hjælp af et frit softwareværktøj til at generere neutraliserende titre. Dette assay viser en stærk positiv sammenhæng mellem farvning og viral koncentration. Vurdering af serumprøver fra får før og efter administration af en rekombinant AAV6 førte til en dramatisk stigning i neutraliserende aktivitet (125 til >10.000 gange stigning). Assayet viste tilstrækkelig følsomhed til at detektere neutraliserende aktivitet i >1:32.000 serumfortyndelser. Dette assay giver en enkel, hurtig og omkostningseffektiv metode til at detektere NAb'er mod AAV'er.

Transduktionsassay for at etablere den optimale virale dosering til pladedækning HT1080-celler, en veletableret fibrosarkomcellelinje, blev udvalgt til dette assay. En koncentration på 1 x 104 HT1080 celler / brønd tilvejebragte ~ 50% cellesammenløb i hver brønd i en 96-brønds plade. For at bestemme den optimale virale koncentration for assayet blev en rAAV, der koder for et hPLAP (humant placental alkalisk phosphatase) reportergen (AAV6-hPLAP)31 , tilsat i tre...

Watch this Scientific Journal Video about A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay at JoVE.com

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

En omfattende laboratorieprotokol og analysearbejdsgang er beskrevet for et hurtigt, omkostningseffektivt og ligetil kolorimetrisk cellebaseret assay til detektering af neutraliserende elementer mod AAV6.

En trinvis metode til at detektere neutraliserende antistoffer mod AAV ved hjælp af et kolorimetrisk cellebaseret assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

Allerede eksisterende antistoffer, der neutraliserer AAV, udgør en barriere for udviklingen af AAV-genterapier. Dette assay er et screeningsværktøj til at detektere neutraliserende antistoffer mod AAV. Den største fordel er, at det er omkostningseffektivt, tidseffektivt, let at konfigurere og kræver minimale tekniske færdigheder, laboratorieudstyr og reagenser.Begynd at plating HT1080 celler på dag et ved at fortynde cellerne til en koncentration på 1 x 10 til de femte celler pr. Milliliter i forvarmet komplet DMEM-medier. Derefter frø 100 mikroliter celler pr. Brønd ind i klare 96-brønds fladbundede plader til koncentrationen på 1 x 10 til de fjerde celler pr. Brønd. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid natten over i 16 til 22 timer.På dag to genereres serielle fortyndinger af serumprøverne af interesse i 1,5 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af forvarmet komplet DMEM. Til hvert rør med fortyndede serumprøver tilsættes 66 mikroliter af 7,5x10 til de seks virale genomer pr. Mikrolitervirusarbejdsløsning. Bland virusserumfortyndingen ved pipettering, og anbring derefter rørene indeholdende virusserumblandingerne i en inkubator ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 30 minutter for at tillade potentiel neutralisering at forekomme.Efter 30 minutter pipetter 100 mikroliter virusserumblandingen til hver brønd på 96-brøndpladen indeholdende 1x10 til de fjerde celler pr. Brønd, og pakk derefter pladen i en folie for at placere den i en inkubator ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid natten over i 16 til 24 timer. På dag tre aspirerer medierne fra brøndene på 96-brøndspladen ved hjælp af et røghættevakuum uden at forstyrre de klæbende celler og tilsæt 50 mikroliter 4% paraformaldehyd til hver brønd. Efter indpakning af pladen i folie, lad den stå i 10 minutter ved stuetemperatur.Senere vaskes og aspireres cellerne to gange med 200 mikroliter PBS ved stuetemperatur. Efter den anden vask pipetteres 200 mikroliter forvarmet PBS i hver brønd og pakkes pladen ind i folie efterfulgt af inkubation ved 65 grader Celsius i 90 minutter for at denaturere endogen alkalisk fosfataseaktivitet efter inkubation ved 50 mikroliter af den frisklavede opløste BCIP/NBT i hver brønd og inkubere de indpakkede plader ved stuetemperatur i to til 24 timer. Senere kan du tage billeder af hver brønd ved hjælp af en 4X objektivlinse i et lysmikroskopkamera, hvilket sikrer konsekvent brug af den samme eksponering, hvidbalancering og lysindstillinger for alle analyser.Hvis du vil analysere billedet i ImageJ, skal du markere filen og klikke på Åbn. For de farvede billeder skal du konvertere til gråskala ved at vælge fanerne Billede, Type og 8-bit i rækkefølge. Gå derefter til fanen Billede, og vælg Juster og tærskel for at ændre tærsklen, indtil alle farvede områder er farvede og røde, men baggrunden ikke er det.klik på Analysér og indstil målinger, og marker afkrydsningsfelterne for Areal, Arealfraktion, Begræns til tærskel og Vis etiket, før du trykker på OK.To bestem signalaflæsningen af en given brønd, klik på Analysér og mål, så kolonnen med procentområdet i popup-vinduet viser signalaflæsningen. Undersøgelsen etablerede den optimale virale dosis ved at tilføje AAV6-hPLAP-reportergenet i cellerne ved en række koncentrationer af det virale genom. En mangfoldighed af infektion på 15.000 gav 36% pladefarve og blev valgt som den optimale virale dosis.Den repræsentative analyse viser sammenhængen mellem farvning og multiplikationer af infektion. Den højeste testede koncentration, der ikke påvirkede den lineære korrelation mellem farvning og viral koncentration, blev opnået. Undersøgelsen af neutraliserende aktivitet på et anti-AAV6 monoklonalt antistof mod adeno-associeret virus eller AAV6 ved log 10-fortynding viste 50% hæmning af AAV6-transduktion eller TI50 i en koncentration på 10 nanogram pr. Milliliter.I det neutraliserende antistof eller NAb-assay varierede graden af AAV-neutralisering inden for den naive prøvepopulation med TI50-titerværdier fra 1/2 til 1/80. Analyseresultaterne viste, at AAV-hæmning TI50-titerværdier før AAV-administration varierede fra 1/4 til 1/80. Efter AAV-administration steg TI50-titeren til mellem 1/2000 og større end 1/32.000, hvilket viste en klar kontrast i titerværdier mellem præ- og post-AAV-administration.Når du tager billeder af brøndene, er det vigtigt konsekvent at bruge de samme mikroskopindstillinger i hele analysen og også sørge for, at billederne tages direkte i midten af brøndene.

Research

JoVE Journal

Biology

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

En trin-for-trin metode til at rekonstituere en ABC Transporter ind i Nanodisc lipidpartikler

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Omdannelse af en ELISA til en Luminex xMAP assay under anvendelse af en multiplex antistof screeningsmetode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Brug cokultur Detect Kemisk medierede interspecies Interaktioner

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Analyse af apoptose i zebrafisk embryoner Whole-mount Immunofluorescens Detect Aktiveret Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Fremgangsmåde til screening og validering af resistente mutationer Against kinaseinhibitorer

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

En metode til at vælge Struktur-skifte Aptamerer Anvendt på en kolorimetrisk Gold Nanopartikel Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Kolorimetrisk påvisning af bakterier Brug lakmusprøve

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

En kvantitativ Dot skamplet Assay for AAV titrering og dets anvendelse til funktionel vurdering af Adeno-associeret Virus forsamling-aktivering proteiner

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

En trin-for-trin guide til myg elektroantennografi

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...