Name: a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00
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Diese Studie wurde durch einen Projektzuschuss des National Health and Medical Research Council für JRM und CJT (ID 1163732) und teilweise durch das Operational Infrastructure Support Program der viktorianischen Regierung finanziert. SB wird durch ein gemeinsames Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral Scholarship unterstützt. KLW wird von der Shine On Foundation und einem Future Leader Fellowship der National Heart Foundation of Australia (ID 102539) unterstützt. JRM wird durch ein Senior Research Fellowship (ID 1078985) des National Health and Medical Research Council unterstützt.

Alle Aspekte der Tierpflege und -experimente wurden gemäß den Richtlinien des Florey Institute of Neuroscience and Mental Health und dem Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes gemäß Reference25 durchgeführt. Für die Studie wurden 1,5-3-jährige Merinoschafe verwendet. Eine schematische Übersicht über das Assay-Protokoll finden Sie in Abbildung 1.
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Dieser Bericht beschreibt einen kolorimetrischen Assay, der das Ausmaß der AAV-Neutralisation in einer bestimmten Serumprobe bewertet, indem er eine chromogene Reaktion bewertet, die dem Grad der in vitro viralen Transduktion entspricht. Die Entwicklung des Protokolls basierte auf der bekannten chromogenen Reaktion zwischen dem Enzym alkalische Phosphatase und NBT/BCIP, die weithin als Färbewerkzeug für den Nachweis von Proteintargets in Anwendungen wie der Immunhistochemie und als Reporterwerkzeug zur Bewert...

Adeno-assoziierte Viren (AAV) werden zunehmend als Vektoren für die Verabreichung von Gentherapien zur Erprobung von Behandlungen für verschiedene Gesundheitszustände verwendet, die sich auf das Herz-Kreislauf-, Kreislauf-, Augen- und Zentralnervensystem auswirken1,2,3,4,5. Die Beliebtheit von AAV-Vektoren als führende Gentherapieplattform beruht auf ihrem positiven Sicherheitsprofil, ihrer langfristigen Transgenexpression und ihren weitreichenden gewebespezifischen Tropismen1,6. Erfolgreiche Ergebnisse in Tierversuchen haben den Weg für über fünfzig klinische AAV-Gentherapie-Studien geebnet, die ihre Wirksamkeitsendpunkte erfolgreich erreicht haben7, sowie für die Freigabe des ersten kommerziell erhältlichen AAV-Gentherapeutikums, das von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassen wurde8. Nach ersten Erfolgen hat AAV in der Grundlagen- und klinischen Forschung als bevorzugter Vektor weiter an Zugkraft gewonnen und ist derzeit die einzige in vivo Gentherapie, die in den USA und Europa für den klinischen Einsatz zugelassen ist9. Nichtsdestotrotz bleibt das Vorhandensein bereits vorhandener neutralisierender Antikörper (NAbs) gegen AAV-Vektorkaside ein Hindernis sowohl für die präklinische Forschung als auch für die Wirksamkeit klinischer Studien. NAbs sind sowohl in naiven menschlichen als auch in tierischen Populationen vorhanden und hemmen die Gentransduktion nach in vivo Verabreichung eines AAV-Vektors1. Die AAV-Seropositivität ist ein Ausschlusskriterium für die meisten gentherapeutischen Studien, und daher ist das vorläufige Screening auf Wirtsimmunität sowohl im Labor als auch in der Klinik von entscheidender Bedeutung. Die Etablierung eines Assays, der das Vorhandensein von NAbs gegen AAV nachweisen kann, ist ein wesentlicher Schritt in der Pipeline eines AAV-Gentherapie-basierten Forschungsprojekts. Dieser Bericht konzentriert sich auf AAV6, das für Forscher aufgrund seiner effizienten und selektiven Transduktion in quergestreiften Muskeln (Herz und Skelettmuskel) von Interesse war 1,10,11,12. Die Gentherapie gilt als vielversprechende Strategie für das Targeting des Herzens, da es schwierig ist, das Herz ohne invasive Verfahren am offenen Herzen gezielt anzusprechen.
Die neutralisierende Aktivität wird normalerweise entweder mit einem zellbasierten In-vitro- oder einem In-vivo-Transduktionshemmungsassay bestimmt. Im lebenden Organismus NAb-Assays beinhalten in der Regel die Verabreichung von Serum von einer Testperson (z. B. Mensch oder Großtier) an Mäuse, gefolgt von einem AAV mit einem Reportergen, gefolgt von einem Test auf die Expression des Reportergens oder des entsprechenden Antigens. In-vitro-Assays bestimmen NAb-Titer durch Inkubation von Serum oder Plasma von einem Menschen oder Großtier in seriellen Verdünnungen mit einem rekombinanten AAV (rAAV), das ein Reportergen exprimiert. Zellen werden mit dem Serum/Virus-Gemisch infiziert, und das Ausmaß, in dem die Reportergenexpression gehemmt wird, wird im Vergleich zu Kontrollen bewertet. In-vitro-Assays werden aufgrund ihrer vergleichsweise niedrigeren Kosten, ihrer Schnelligkeit bei Tests und ihrer größeren Kapazität für die Standardisierung und Validierung häufig für das NAb-Screening verwendet13,14 im Vergleich zu In-vivo-Assays. Es wird häufig berichtet, dass In-vivo-Assays eine höhere Sensitivität aufweisen15,16, aber die gleiche Behauptung wurde in Bezug auf In-vitro-Assays gemacht14,17.
Bisher haben In-vitro-NAb-Assays hauptsächlich Lumineszenz (Luciferase) als Reportergen verwendet, um die Neutralisation nachzuweisen. Obwohl eine lichtbasierte Methode in vielen Kontexten Von Vorteil ist, kann ein kolorimetrischer/chromogener NAb-Assay unter bestimmten Umständen vorteilhaft sein. Kolorimetrische Assays zur Beurteilung der Neutralisation wurden erfolgreich für andere Viren wie Influenza und Adenovirus eingesetzt18,19. Ihre Attraktivität ergibt sich aus ihrer Einfachheit, ihren niedrigeren Kosten und der Anforderung an alltägliche Laborgeräte und -werkzeuge20. NAb-Assays, die ein Lumineszenz-basiertes Reportergen verwenden, erfordern kostspielige Substratkits, ein Luminometer und entsprechende Software für die Analyse21. Dieser kolorimetrische Assay hat den Vorteil, dass nur ein Lichtmikroskop und ein sehr billiges Substrat benötigt werden. Die Berichterstattung über die Sensitivität von kolorimetrischen gegenüber lumineszierenden Assays hat zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt. Eine Studie schlug vor, dass lumineszenzbasierte ELISA-Assays eine höhere Sensitivität und vergleichbare Reproduzierbarkeit wie kolorimetrische Assays aufweisen22, während eine andere studierte, dass kolorimetrische ELISA-Assays eine höhere Sensitivität verleihen23. Hier wird ein detailliertes Protokoll für einen In-vitro-NAb-Assay gegen AAV bereitgestellt, der die chromogene Reaktion zwischen einem AAV- kodierenden alkalischen Phosphatase (AP) -Reportergen und einem nitroblauen Tetrazolium / 5-Brom-4-Chlor-3-indolylphosphat (NBT / BCIP) -Substrat verwendet. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll wurde auf der Grundlage eines früheren Berichts entwickelt, der ein hPLAP-Reportergen (Human Placental Alkaline Phosphatase) (AAV6-hPLAP) verwendete, um die neutralisierende Aktivität gegen AAV24 nachzuweisen. Dieser Assay ist kostengünstig, zeiteffizient, einfach einzurichten und erfordert minimale technische Fähigkeiten, Laborgeräte und Reagenzien. Darüber hinaus bietet die Einfachheit dieses Assays das Potenzial, für breite Anwendungen in verschiedenen Arten von Zellen, Geweben oder viralen Serotypen optimiert zu werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 square flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottomed plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6-CMV-hPLAP Vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Muscle Research &#38; Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>610159</td>
			<td>Positive control monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>SIGMAFAST</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and tissue culture safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 &#38; 10 mL stripette inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT1080 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of taking photos with a 4x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For a 65 &#176;C incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 &#956;L, 200 &#956;L &#38; 1 mL single pipettes and tips &#38; 200 &#956;L multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup quick release filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td>Used for combining media reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>455071</td>
			<td>Used for serum collection &#38; processing from sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay

Rekombinante Adeno-assoziierte Viren (rAAV) haben sich als sicherer und erfolgreicher Vektor für die Übertragung von genetischem Material zur Behandlung verschiedener Gesundheitszustände sowohl im Labor als auch in der Klinik erwiesen. Bereits vorhandene neutralisierende Antikörper (NAbs) gegen AAV-Kapside stellen jedoch eine ständige Herausforderung für die erfolgreiche Verabreichung von Gentherapien sowohl in experimentellen Großtiermodellen als auch in menschlichen Populationen dar. Ein vorläufiges Screening auf Wirtsimmunität gegen AAV ist notwendig, um die Wirksamkeit von AAV-basierten Gentherapien sowohl als Forschungsinstrument als auch als klinisch tragfähiges Therapeutikum sicherzustellen. Dieses Protokoll beschreibt einen kolorimetrischen In-vitro-Assay zum Nachweis neutralisierender Faktoren gegen AAV-Serotyp 6 (AAV6). Der Assay nutzt die Reaktion zwischen einem AAV, das für ein alkalisches Phosphatase (AP)-Reportergen kodiert, und seinem Substrat NBT/BCIP, das bei kombination eine unlösliche quantifizierbare violette Färbung erzeugt. 
In diesem Protokoll werden Serumproben mit einem AAV-exprimierenden AP kombiniert und inkubiert, um eine mögliche neutralisierende Aktivität zu ermöglichen. Die Virusserummischung wird anschließend den Zellen zugesetzt, um die virale Transduktion von AAVs zu ermöglichen, die nicht neutralisiert wurden. Das NBT/BCIP-Substrat wird zugegeben und durchläuft eine chromogene Reaktion, die der viralen Transduktion und neutralisierenden Aktivität entspricht. Der Anteil der farbigen Fläche wird mit einem kostenlosen Software-Tool quantifiziert, um neutralisierende Titer zu generieren. Dieser Assay zeigt eine starke positive Korrelation zwischen Färbung und Viruskonzentration. Die Beurteilung von Serumproben von Schafen vor und nach verabreichung eines rekombinanten AAV6 führte zu einem dramatischen Anstieg der neutralisierenden Aktivität (125 bis >10.000-fache Zunahme). Der Assay zeigte eine ausreichende Sensitivität, um neutralisierende Aktivität in >1:32.000 Serumverdünnungen nachzuweisen. Dieser Assay bietet eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zum Nachweis von NAbs gegen AAVs.

Transduktionsassay zur Bestimmung der optimalen Virusdosis für die Plattenabdeckung HT1080-Zellen, eine etablierte Fibrosarkom-Zelllinie, wurden für diesen Assay ausgewählt. Eine Konzentration von 1 x 104 HT1080-Zellen/Well lieferte ~50% Zellkonfluenz in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte. Um die optimale Viruskonzentration für den Assay zu bestimmen, wurde ein rAAV, das für ein hPLAP(human placental alkaline phosphatase) Reportergen (AAV6-hPLAP)31 kodiert, i...

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A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Ein umfassendes Laborprotokoll und ein Analyse-Workflow werden für einen schnellen, kostengünstigen und unkomplizierten kolorimetrischen zellbasierten Assay zur Erkennung neutralisierender Elemente gegen AAV6 beschrieben.

Eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen AAV mit einem kolorimetrischen zellbasierten Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

Bereits existierende Antikörper, die AAV neutralisieren, stellen ein Hindernis für die Weiterentwicklung von AAV-Gentherapien dar. Dieser Assay ist ein Screening-Tool zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen AAV. Der Hauptvorteil ist, dass es kostengünstig, zeiteffizient und einfach einzurichten ist und minimale technische Fähigkeiten, Laborgeräte und Reagenzien erfordert.Beginnen Sie am ersten Tag mit der Beschichtung von HT1080-Zellen, indem Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 10 auf die fünften Zellen pro Milliliter in vorgewärmten kompletten DMEM-Medien verdünnen. Dann säen Sie 100 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in klare 96-Well-Platten mit flachem Boden bis zur Konzentration von 1 x 10 auf die vierten Zellen pro Vertiefung. Die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid über Nacht für 16 bis 22 Stunden inkubieren.Erzeugen Sie am zweiten Tag serielle Verdünnungen der interessierenden Serumproben in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von vorgewärmtem vollständigem DMEM. Zu jedem Röhrchen mit verdünnten Serumproben werden 66 Mikroliter der 7,5x10 zu den sechs viralen Genomen pro Mikroliter-Virus-Arbeitslösung gegeben. Mischen Sie die Virusserumverdünnung durch Pipettieren und legen Sie dann die Röhrchen, die die Virusserummischungen enthalten, in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 30 Minuten, um eine mögliche Neutralisation zu ermöglichen.Nach 30 Minuten 100 Mikroliter der Virusserummischung zu jeder Vertiefung auf der 96-Well-Platte, die 1x10 zu den vierten Zellen pro Vertiefung enthält, pipettieren und dann die Platte in eine Folie wickeln, um sie in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid über Nacht für 16 bis 24 Stunden zu legen. Am dritten Tag saugen Sie das Medium mit einem Abzugsvakuum aus den Vertiefungen der 96-Well-Platte ab, ohne die anhaftenden Zellen zu stören, und geben Sie 50 Mikroliter 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung. Nachdem Sie den Teller in Folie eingewickelt haben, lassen Sie ihn 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen.Später waschen und aspirieren Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern PBS bei Raumtemperatur. Nach der zweiten Wäsche werden 200 Mikroliter vorgewärmtes PBS in jede Vertiefung pipettiert und die Platte in Folie gewickelt, gefolgt von einer Inkubation bei 65 Grad Celsius für 90 Minuten, um die endogene alkalische Phosphataseaktivität zu denaturieren, nach inkubiert bei 50 Mikrolitern des frisch zubereiteten gelösten BCIP/NBT in jede Vertiefung und die verpackten Platten bei Raumtemperatur für zwei bis 24 Stunden inkubiert. Machen Sie später Fotos von jedem Bohrloch mit einem 4-fachen Objektiv in einer Lichtmikroskopkamera, um die konsistente Verwendung der gleichen Belichtungs-, Weißabgleich- und Lichteinstellungen für alle Assays sicherzustellen.Um das Bild in ImageJ zu analysieren, wählen Sie die Datei aus und klicken Sie auf Öffnen. Konvertieren Sie für die farbigen Bilder in Graustufen, indem Sie die Registerkarten Bild, Typ und 8-Bit in der richtigen Reihenfolge auswählen. Gehen Sie dann zur Registerkarte Bild und wählen Sie Anpassen und Schwellenwert, um den Schwellenwert zu ändern, bis alle farbigen Bereiche farbig und rot sind, der Hintergrund jedoch nicht.Klicken Sie auf Analysieren und Messungen festlegen und aktivieren Sie die Kontrollkästchen für Fläche, Flächenanteil, Grenzwert und Anzeigebeschriftung, bevor Sie auf OK.To den Signalwert einer bestimmten Vertiefung zu bestimmen, klicken Sie auf Analysieren und messen, damit die prozentuale Flächenspalte des Popup-Fensters den Signalwert anzeigt. Die Studie ermittelte die optimale Virusdosis durch Zugabe des AAV6-hPLAP-Reportergens in den Zellen in einer Reihe von Konzentrationen des viralen Genoms. Eine Vielzahl von Infektionen von 15.000 ergab eine Plattenfärbung von 36% und wurde als optimale Virusdosis ausgewählt.Die repräsentative Analyse zeigt die Korrelation zwischen Färbung und Multiplizität der Infektion. Die höchste getestete Konzentration, die die lineare Korrelation zwischen Färbung und Viruskonzentration nicht beeinflusste, wurde erhalten. Die Untersuchung der neutralisierenden Aktivität an einem monoklonalen Anti-AAV6-Antikörper gegen das Adeno-assoziierte Virus oder AAV6 bei log 10-Verdünnung zeigte eine 50%ige Hemmung der AAV6-Transduktion oder TI50 bei einer Konzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter.Im neutralisierenden Antikörper- oder NAb-Assay variierte der Grad der AAV-Neutralisation innerhalb der naiven Probenpopulation mit TI50-Titerwerten von 1/2 bis 1/80. Die Untersuchungsergebnisse zeigten, dass die TI50-Titerwerte der AAV-Hemmung vor der Verabreichung der AAV zwischen 1/4 und 1/80 lagen. Nach AAV-Verabreichung stieg der TI50-Titer auf zwischen 1/2000 und mehr als 1/32.000, was einen deutlichen Kontrast der Titerwerte zwischen der Prä- und Post-AAV-Verabreichung zeigt.Beim Fotografieren der Bohrlöcher ist es wichtig, während des gesamten Tests konsequent die gleichen Mikroskopeinstellungen zu verwenden und sicherzustellen, dass die Fotos direkt in der Mitte der Vertiefungen aufgenommen werden.

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