Name: a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00
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この研究は、JRMとCJT(ID 1163732)への国家保健医療研究評議会プロジェクト助成金と、ビクトリア州政府の運用インフラ支援プログラムによって部分的に資金提供されました。SBは、共同ベーカーハートと糖尿病研究所 - ラトローブ大学博士奨学金によってサポートされています。KLWは、シャイン・オン・ファウンデーションとオーストラリア国立心臓財団(ID 102539)のフューチャー・リーダー・フェローシップの支援を受けています。JRMは、国立衛生医学研究評議会上級研究員(ID 1078985)の支援を受けています。

動物の世話と実験のあらゆる側面は、Florey Institute of Neuroscience and Mental Healthのガイドラインと、参考文献25に続く科学的目的のための動物の世話と使用のためのオーストラリア規範に従って実施されました。1.5-3歳のメリノ・ウエイズが研究に使用された。アッセイプロトコルの概略概要を 図1に示します。
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この報告は、インビトロウイルス形質導入の程度に対応する発色反応を評価することによって、所与の血清サンプル中のAAV中和の程度を評価する比色アッセイを記載する。このプロトコールの開発は、免疫組織化学などの用途におけるタンパク質標的検出のための染色ツールとして、またウイルス形質導入を評価するためのレポーターツールとして広く利用されてきた酵素アルカリホ?...

アデノ随伴ウイルス(AAV)は、心臓血管系、肺系、循環器系、眼系、および中枢神経系に影響を与えるさまざまな健康状態の試験的治療への遺伝子治療を提供するためのベクターとしてますます使用されています1,2,3,4,5。主要な遺伝子治療プラットフォームとしてのAAVベクターの人気は、その肯定的な安全性プロファイル、長期的な導入遺伝子発現、および広範囲の組織特異的指向性に由来しています1,6。動物実験での成功の結果は、有効性エンドポイント7に成功した50以上のAAV遺伝子治療臨床試験への道を開き、米国食品医薬品局によって承認された最初の市販のAAV遺伝子治療薬のリリース8。最初の成功の後、AAVは選択ベクターとして基礎研究および臨床研究分野で牽引力を得続けており、現在、米国とヨーロッパで臨床使用が承認された唯一のin vivo遺伝子治療です9。それにもかかわらず、AAVベクターカプシドに対する既存の中和抗体(NAbs)の存在は、前臨床研究および臨床試験の有効性の両方にとって依然として障害である。NAbは、ナイーブなヒトおよび動物集団の両方に存在し、AAVベクター1のインビボ投与後の遺伝子導入を阻害する。AAV血清陽性は、ほとんどの遺伝子治療試験の除外基準であるため、宿主免疫の予備スクリーニングは、実験室と診療所の両方で非常に重要です。AAVに対するNAbsの存在を検出できるアッセイを確立することは、AAV遺伝子治療ベースの研究プロジェクトのパイプラインにおいて不可欠なステップです。このレポートは、横紋筋(心臓および骨格筋)における効率的かつ選択的な形質導入のために研究者にとって興味深いAAV6に焦点を当てています1,10,11,12。遺伝子治療は、侵襲的な開心処置なしに心臓を特異的に標的とすることは困難であるため、心臓を標的とするための有望な戦略と考えられている。
中和活性は、通常、細胞ベースのインビトロまたはインビボ形質導入阻害アッセイのいずれかを用いて決定される。インビボでNAbアッセイは、通常、試験対象(例えば、ヒトまたは大型動物)からの血清をマウスに投与し、続いてレポーター遺伝子を有するAAVを投与し、続いてレポーター遺伝子または対応する抗原の発現について試験することを含む。インビトロアッセイは、レポーター遺伝子を発現する組換えAAV(rAAV)と共に段階希釈下でヒトまたは大型動物由来の血清または血漿をインキュベートすることによってNAb力価を決定する。細胞を血清/ウイルス混合物に感染させ、対照と比較してレポーター遺伝子発現が阻害される程度を評価する。インビトロアッセイは、インビボアッセイと比較して、比較的低コスト、試験の迅速性、標準化および検証の能力が高いため、NAbスクリーニングに広く使用されています13,14。インビボアッセイはしばしばより高い感度を有すると報告されている15,16が、インビトロアッセイに関しても同じ主張がなされている14,17。
今日まで、インビトロNAbアッセイは、中和を検出するためのレポーター遺伝子として発光(ルシフェラーゼ)を主に使用してきた。光ベースの方法は多くの文脈においてメリットを有するが、比色法/発色性NAbアッセイは状況によっては有利であり得る。中和を評価するための比色アッセイは、インフルエンザやアデノウイルスなどの他のウイルスについても成功裏に採用されています18,19。その魅力は、そのシンプルさ、低コスト、そして日常的な実験装置とツールのみの要件に由来しています20。発光ベースのレポーター遺伝子を使用するNAbアッセイには、高価な基質キット、ルミノメーター、および分析用の対応するソフトウェアが必要です21。この比色アッセイは、光学顕微鏡と非常に安価な基質のみを必要とするという利点を有する。比色アッセイと発光アッセイの感度の報告は、相反する結果をもたらしました。ある研究では、発光ベースのELISAアッセイは比色アッセイと比較してより高い感度と同等の再現性を示すことが示唆され22、別の研究では比色ベースのELISAアッセイがより高い感度を付与することが示唆されました23。ここでは、アルカリホスファターゼ(AP)レポーター遺伝子をコードするAAVとニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(NBT/BCIP)基質との間の発色反応を利用するAAVに対するインビトロNAbアッセイのための詳細なプロトコールが提供される。このステップバイステッププロトコルは、hPLAP(ヒト胎盤アルカリホスファターゼ)レポーター遺伝子(AAV6-hPLAP)を利用してAAV24に対する中和活性を検出した以前の報告に基づいて開発されました。このアッセイは、費用対効果が高く、時間効率が高く、セットアップが簡単で、最小限の技術スキル、実験装置、および試薬を必要とします。さらに、このアッセイの単純さは、異なるタイプの細胞、組織、またはウイルス血清型にわたる幅広い用途に最適化される可能性を与えます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 square flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottomed plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6-CMV-hPLAP Vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Muscle Research &#38; Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>610159</td>
			<td>Positive control monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>SIGMAFAST</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and tissue culture safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 &#38; 10 mL stripette inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT1080 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of taking photos with a 4x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For a 65 &#176;C incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 &#956;L, 200 &#956;L &#38; 1 mL single pipettes and tips &#38; 200 &#956;L multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup quick release filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td>Used for combining media reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>455071</td>
			<td>Used for serum collection &#38; processing from sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay

組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、実験室と診療所の両方でさまざまな健康状態を治療するために遺伝物質を転写するための安全で成功したベクターであることが証明されています。しかし、AAVカプシドに対する既存の中和抗体(NAbs)は、大型動物実験モデルとヒト集団の両方で遺伝子治療を成功裏に投与するための継続的な課題を提起する。AAVに対する宿主免疫の予備スクリーニングは、AAVベースの遺伝子治療が研究ツールとして、また臨床的に実行可能な治療薬としての有効性を確保するために必要です。このプロトコールは、AAV血清型6(AAV6)に対する中和因子を検出するための 比色インビトロ アッセイを記載する。このアッセイは、アルカリホスファターゼ(AP)レポーター遺伝子をコードするAAVとその基質NBT/BCIPとの間の反応を利用し、組み合わせると不溶性の定量可能な紫色の染色を生成する。 
このプロトコールでは、血清サンプルをAPを発現するAAVと組み合わせ、潜在的な中和活性が起こるようにインキュベートする。ウイルス血清混合物は、その後、中和されていない任意のAAVのウイルス形質導入を可能にするために細胞に添加される。NBT/BCIP基質が添加され、ウイルス形質導入および中和活性に対応する発色反応を受ける。着色された領域の割合は、中和力価を生成するためにフリーソフトウェアツールを使用して定量化される。このアッセイは、着色とウイルス濃度との間に強い正の相関を示す。組換えAAV6の投与前後のヒツジ由来の血清サンプルの評価は、中和活性の劇的な増加(125〜>10,000倍の増加)をもたらした。アッセイは、>1:32,000血清希釈液中の中和活性を検出するのに十分な感度を示した。このアッセイは、AAVに対してNAbsを検出するための簡単で迅速で費用対効果の高い方法を提供します。

プレートカバレッジに最適なウイルス投与量を確立するための形質導入アッセイ 十分に確立された線維肉腫細胞株であるHT1080細胞を、このアッセイのために選択した。1 x 104 HT1080細胞/ウェルの濃度は、96ウェルプレートの各ウェルにおいて〜50%の細胞コンフルエント性を提供しました。アッセイに最適なウイルス濃度を決定するために、hPLAP(ヒト胎盤アルカリホスファ...

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A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

AAV6に対する中和元素を検出するための、迅速で費用対効果が高く、簡単な比色細胞ベースのアッセイについて、包括的なラボプロトコルと分析ワークフローが説明されています。

比色細胞ベースのアッセイを用いてAAVに対する中和抗体を検出するためのステップバイステップ法

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

AAVを中和する既存の抗体は、AAV遺伝子治療の進歩に対する障壁となる。このアッセイは、AAVに対する中和抗体を検出するためのスクリーニングツールである。主な利点は、費用対効果が高く、時間効率が高く、セットアップが簡単で、技術的なスキル、ラボ機器、試薬が最小限で済むことです。HT1080細胞を1日目にプレーティングを開始するには、予め加温した完全DMEM培地中で細胞を1ミリリットル当たり1 x 10~5番目の細胞の濃度に希釈します。次いで、1ウェル当たり100マイクロリットルの細胞を透明な96ウェル平底プレートに播種し、1ウェル当たり4番目の細胞に1 x 10の濃度にする。プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素と共に一晩16〜22時間インキュベートする。2日目に、予め加温された完全DMEMを使用して、1.5ミリリットルの微量遠心チューブで目的の血清サンプルの段階希釈を生成する。希釈血清サンプルを含む各チューブに、マイクロリットルのウイルス作業溶液あたり6つのウイルスゲノムに66マイクロリットルの7.5x10を加える。ウイルス血清希釈液をピペッティングで混合し、ウイルス血清混合物を含むチューブを摂氏37度のインキュベーターに5%二酸化炭素で30分間置き、潜在的な中和が起こるようにします。30分後、1ウェルあたり1x10〜4番目の細胞を含む96ウェルプレート上の各ウェルに100マイクロリットルのウイルス血清混合物をピペットし、次いでプレートをホイルで包み、5%二酸化炭素と共に摂氏37度のインキュベーター内に一晩16〜24時間置く。3日目に、接着細胞を破壊することなくヒュームフード真空を使用して96ウェルプレートのウェルから培地を吸引し、各ウェルに50マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加える。プレートを箔で包んだ後、室温で10分間放置する。その後、室温で200マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、2回吸引する。2回目の洗浄後、200マイクロリットルの予め加温したPBSを各ウェルにピペットし、プレートをホイルで包み込み、続いて摂氏65度で90分間インキュベートして内因性アルカリホスファターゼ活性を変性させ、続いて、新たに調製した溶解BCIP/NBTを各ウェルに50マイクロリットルでインキュベートした後、ラッププレートを室温で2〜24時間インキュベートする。その後、光学顕微鏡カメラで4倍の対物レンズを使用して各ウェルの写真を撮影し、すべてのアッセイで同じ露出、ホワイトバランス、および光設定の一貫した使用を保証します。ImageJ でイメージを分析するには、ファイルを選択して「開く」をクリックします。カラー画像の場合は、「画像」、「種類」、および「8 ビット」タブを順番に選択して、グレースケールに変換します。次に、[画像]タブに移動し、[調整としきい値]を選択して、すべての色付きの領域が色と赤になるまでしきい値を変更しますが、背景はそうではありません。[測定値の分析と設定]をクリックし、[面積]、[面積の割合]、[しきい値に制限]、[表示ラベル]のチェックボックスをオンにしてから、特定のウェルの信号読み取り値を決定する OK.To にヒットする前に、[分析と測定]をクリックして、ポップアップウィンドウの面積のパーセント列に信号の読み取り値を表示します。この研究は、ウイルスゲノムの濃度の範囲で細胞内にAAV6-hPLAPレポーター遺伝子を添加することによって最適なウイルス投与量を確立した。15, 000の感染の多様性は、36%のプレート着色を与え、最適なウイルス投与量として選択された。代表的な分析は、着色と感染の多様性との間の相関関係を表示する。着色とウイルス濃度との間の線形相関に影響を及ぼさなかった最も高い試験濃度が得られた。対数10希釈時のアデノアソシエイトウイルスまたはAAV6に対する抗AAV6モノクローナル抗体に対する中和活性の研究は、1ミリリットル当たり10ナノグラムの濃度でのAAV6形質導入またはTI50の50%阻害を示した。中和抗体またはNAbアッセイにおいて、AAV中和の程度は、1/2〜1/80の範囲のTI50力価値を有するナイーブサンプル集団内で変化した。アッセイ結果は、AAV投与前のAAV阻害TI50力価値が1/4〜1/80の範囲であることを示した。AAV投与後、TI50力価は1/2000から1/32,000を超えるまで増加し、AAV投与前と投与後との間の力価値に明確な対照を示した。ウェルの写真を撮影するときは、アッセイ全体を通して一貫して同じ顕微鏡設定を使用し、写真がウェルの中央で直接撮影されていることを確認することが重要です。

Research

JoVE Journal

Biology

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