Name: a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay at JoVE.com

이 연구는 JRM과 CJT (ID 1163732)에 대한 국가 보건 및 의료 연구 위원회 프로젝트 보조금에 의해 부분적으로 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램에 의해 지원되었습니다. SB는 공동 베이커 심장과 당뇨병 연구소 - 라 트로브 대학 박사 장학금에 의해 지원됩니다. KLW는 샤인 온 재단과 호주 국립 심장 재단 (ID 102539)의 미래 지도자 펠로우십에 의해 지원됩니다. JRM은 국민 건강 및 의학 연구 위원회 수석 연구 펠로우십 (ID 1078985)에 의해 지원됩니다.

동물 관리 및 실험의 모든 측면은 신경 과학 및 정신 건강 지침의 플로리 연구소와 참조 25 다음 과학적 목적을 위한 동물의 관리 및 사용에 대 한 호주 코드에 따라 실시 되었다. 1.5-3세 메리노 에베가 연구에 사용되었습니다. 분석 프로토콜에 대한 회로도 개요는 그림 1에 제공됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg"...

이 보고서는 체외 바이러스 성 트랜스듀션의 정도에 해당하는 염색체 반응을 평가하여 주어진 혈청 샘플에서 AAV 중화의 정도를 평가하는 색법 분석법을 설명합니다. 프로토콜의 개발은 면역 조직화학과 같은 응용 분야에서 단백질 표적의 검출을 위한 스테닝 도구로 널리 활용되고 있는 효소 알칼리인인포스파아제와 NBT/BCIP 사이의 공지된 염색체 반응에 기초하여, 바이러스 성 전도를 평가...

아데노 관련 바이러스(AAV)는 심혈관, 폐, 순환, 안구 및 중추 신경계에 영향을 미치는 다양한 건강 상태에 대한 임상 시험 치료에 유전자 요법을 전달하기 위한 벡터로 점점 더 많이 사용되고 있다1,2,3,4,5. 선도적인 유전자 치료 플랫폼으로서 AAV 벡터의 인기는 양성 안전 성, 장기 간 질유전자 발현 및 광범위한 조직 별 트로피즘1,6에서 비롯됩니다. 동물 연구에서 성공적인 결과는 성공적으로 그들의 효험 끝점에 도달한 50 개 이상의 AAV 유전자 치료 임상 시험을 위한 도로를 포장했습니다7, 미국 식품 의약국에 의해 승인된 첫번째 상업적으로 유효한 AAV 유전자 치료 약의 방출8. 초기 성공에 이어, AAV는 선택의 벡터로서 기본 및 임상 연구 분야에서 견인력을 계속 얻고 있으며 현재 미국과 유럽에서 임상 사용을 위해 승인 된 유일한 생체 유전자 치료법입니다9. 그럼에도 불구하고, AAV 벡터 캡시드에 대한 기존의 중화 항체(NAbs)의 존재는 임상 전 연구와 임상 시험의 효능 모두에 방해가 되고 있다. NAbs는 순진한 인간과 동물 집단 모두에서 존재하며 AAV 벡터1의 생체 투여에 따른 유전자 전이를 억제한다. AAV 혈청화는 대부분의 유전자 치료 예심을 위한 제외 기준이고, 그러므로 호스트 면제를 위한 예비 검열은 실험실과 진료소 둘 다에서 중요합니다. AAV에 대한 NAbs의 존재를 감지할 수 있는 분석서를 확립하는 것은 모든 AAV 유전자 치료 기반 연구 프로젝트의 파이프라인에 필수적인 단계입니다. 이 보고서는 AAV6에 초점을 맞추고 있다 그 효율적이 고 선택적 변환 으로 인해 연구자에 게 관심 있다 (심장과 골격 근육)1,10,11,12. 유전자 치료는 침략적인 개방 심장 절차 없이 심혼을 구체적으로 표적으로 하기 어렵기 때문에 심혼을 표적으로 하기 위한 유망한 전략으로 여겨됩니다.
중화 활성은 일반적으로 세포 기반 의 체외 또는 생체 내 트랜스포션 억제 분석체를 사용하여 결정된다. 생체 내 NAb assays는 일반적으로 시험 대상자(예를 들어, 인간 또는 큰 동물)로부터 혈청을 마우스로 투여하고, 리포터 유전자를 가진 AAV가 그 뒤를 잇고, 이어서 리포터 유전자 또는 해당 항원의 발현을 위한 테스트를 포함한다. 시험관 내 실험은 리포터 유전자를 표현하는 재조합 AAV(rAAV)를 사용하여 인간 또는 대형 동물로부터 혈청 또는 플라즈마를 배양하여 NAb 티터를 결정합니다. 세포는 혈청/바이러스 혼합물에 감염되고, 리포터 유전자 발현이 억제되는 정도는 대조군과 비교하여 평가된다. 시험관 내 소는 상대적으로 낮은 비용, 테스트의 급속성 및 생체 내 에세이에 비해 표준화 및 유효성 검사에 대한 더 큰 용량으로 인해 NAb 스크리닝에 널리 사용됩니다. 생체 내 아세약은 종종 더 큰 감도가보고15,16, 하지만 같은 주장은 체외 애사14,17에 관한 만들어졌다.
현재까지, 시험관 내 NAb 아세약은 주로 발광(luciferase)을 중화를 검출하기 위해 기자 유전자로서 사용하였다. 빛 기반 방법은 많은 맥락에서 장점이 있지만, 색색/염색체 NAb 분석법은 어떤 상황에서도 유리할 수 있다. 중화를 평가하기 위한 색인 분석법에서는 인플루엔자 및 아데노바이러스18,19와 같은 다른 바이러스에 성공적으로 사용되었습니다. 그들의 매력은 단순함, 저렴한 비용 및 일상적인 실험실 장치 및 tools20에 대한 요구 사항에서 비롯됩니다. 발광 기반 리포터 유전자를 사용하는 NAb 분석은 분석21에 비용이 많이 드는 기판 키트, 광미계 및 해당 소프트웨어가 필요합니다. 이 색분석 분석은 가벼운 현미경과 매우 저렴한 기판을 필요로하는 장점이 있습니다. 색인과 발광 분석의 민감도에 대한 보고는 상충하는 결과를 낳았습니다. 한 연구는 발광 기반 ELISA 분석 이 더 큰 감도 및 색상 분석에 비교 재현성을 표시 제안 22, 다른 발견 된 색인식 기반 ELISA 분석 더 큰 감도23. 여기서, 알칼리인스파타제(AP) 리포터 유전자와 니트로 블루 테트라졸륨/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산염(NBT/BCIP) 기산염(NBT/BCIP) 기산염을 인코딩하는 AAV 사이의 염색체 반응을 활용하는 AAV에 대한 시험관 NAb 분석에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이러한 단계별 프로토콜은 AAV24에 대한 중화 활성을 검출하기 위해 hPLAP(인간 태반 알칼리인스파라스) 리포터 유전자(AAV6-hPLAP)를 활용한 이전 보고서에 기초하여 개발되었다. 이 분석법은 비용 효율적이고 시간 효율적이며 설치가 용이하며 최소한의 기술 기술, 실험실 장비 및 시약이 필요합니다. 더욱이, 이 분석의 단순성은 세포, 조직, 또는 바이러스성 혈청형의 다른 모형에 걸쳐 광범위한 응용에 최적화될 가능성을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 square flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottomed plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6-CMV-hPLAP Vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Muscle Research &#38; Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>610159</td>
			<td>Positive control monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>SIGMAFAST</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and tissue culture safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 &#38; 10 mL stripette inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT1080 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of taking photos with a 4x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For a 65 &#176;C incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 &#956;L, 200 &#956;L &#38; 1 mL single pipettes and tips &#38; 200 &#956;L multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup quick release filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td>Used for combining media reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>455071</td>
			<td>Used for serum collection &#38; processing from sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 실험실과 클리닉 모두에서 다양한 건강 상태를 치료하기 위해 유전 물질을 옮기는 안전하고 성공적인 벡터로 입증되었습니다. 그러나, AAV capsids에 대하여 기존의 중화 항체 (NAbs)는 큰 동물 실험 모형 및 인간 인구 둘 다에 있는 유전자 치료의 성공적인 행정을 위한 지속적인 도전을 제기합니다. AAV에 대한 숙주 면역을 위한 예비 스크리닝은 연구 도구와 임상적으로 실행 가능한 치료제로서 AAV 기반 유전자 치료의 효능을 보장하기 위해 필요하다. 이 프로토콜은 AAV 혈청형 6(AAV6)에 대한 중화 요인을 감지하기 위해 체외 분석에서 착색을 설명합니다. 분석은 알칼리성 인산화(AP) 리포터 유전자와 그 기판 NBT/BCIP 사이의 반응을 활용하여 조합시 불용성 정량화 가능한 보라색 얼룩을 생성한다. 
이 프로토콜에서 혈청 샘플은 AP를 표현하는 AAV와 결합되어 잠재적 중화 활동이 발생할 수 있도록 배양됩니다. 바이러스 혈청 혼합물은 이후에 중화되지 않은 모든 AAV의 바이러스 성 변환을 허용하기 위해 세포에 첨가됩니다. NBT/BCIP 기판이 첨가되고 바이러스 성 트랜스듀션 및 중화 활동에 대응하는 염색체 반응을 겪는다. 영역 색상의 비율은 자유 소프트웨어 도구를 사용하여 양으로 양화되어 중화 티터를 생성합니다. 이 분석은 착색과 바이러스 성 농도 사이의 강한 긍정적 인 상관 관계를 표시합니다. 재조합 AAV6의 투여 전후 양으로부터의 혈청 샘플의 평가는 중화 활성의 극적인 증가로 이어졌다 (125 받는 >10,000 배 증가). 분석은 >1:32,000 혈청 희석제에서 중화 활동을 감지하는 적절한 감도를 나타냈다. 이 분석법은 AAV에 대한 NAbs를 감지하는 간단하고 빠르며 비용 효율적인 방법을 제공합니다.

플레이트 커버리지를 위한 최적의 바이러스 성 복용량을 확립 하는 Trans유도 분석 HT1080 세포, 잘 확립 된 섬유 육종 세포주, 이 분석에 대 한 선택 되었다. 1 x 104 HT1080 셀/웰의 농도는 96웰 플레이트의 각 웰에 ~50%의 세포 결합을 제공한다. 분석에 대한 최적의 바이러스 농도를 결정하기 위해, hPLAP(인간 태반 알칼리인포스파사제) 기자 유전자(AAV6-hPLAP)31은 세?...

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A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

포괄적인 실험실 프로토콜 및 분석 워크플로우는 AAV6에 대한 중화 요소를 감지하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 간단한 색채 세포 기반 분석법을 위해 설명됩니다.

색색세포 기반 분석법을 사용하여 AAV에 대한 항체 중화를 검출하는 단계별 방법

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

AAV를 중화하는 기존의 항체는 AAV 유전자 치료의 발전에 장벽을 제기합니다. 이 분석은 AAV에 대하여 항체를 중화하는 것을 검출하는 검열 공구입니다. 가장 큰 장점은 비용 효율적이고, 시간 효율적이며, 설치가 용이하며, 최소한의 기술 력, 실험실 장비 및 시약이 필요하다는 것입니다.사전 따뜻하게 된 완전한 DMEM 미디어에서 밀리리터 당 5 세포에 1 x 10의 농도로 세포를 희석하여 첫날HT1080 세포를 도금하기 시작합니다. 그런 다음 잘 당 세포의 100 마이크로 리터를 잘 96 잘 평평한 바닥 판으로 잘 1 x 10의 농도로 잘 한다. 16~22시간 동안 밤새 이산화탄소 5%를 37도에서 배양합니다.둘째 날에는 사전 따뜻하게 된 완전한 DMEM을 사용하여 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 관심있는 혈청 샘플의 직렬 희석을 생성합니다. 희석혈청 샘플을 가진 각 관에, 마이크로리터 바이러스 작동 용액 당 6개의 바이러스 게놈에 7.5x10의 66 마이크로리터를 추가합니다. 피펫팅에 의해 바이러스 혈청 희석을 혼합한 다음 37°C의 인큐베이터에 바이러스 혈청 혼합물을 함유한 튜브를 5%의 이산화탄소와 30분 동안 배치하여 잠재적 중화가 발생할 수 있도록 한다.30분 후, 바이러스 혈청 혼합물의 파이펫 100 마이크로리터는 1x10을 함유한 96웰 플레이트에 각각 잘 하여 1x10을 함유한 후, 플레이트를 호일에 싸서 16~24시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도의 인큐베이터에 배치한다. 셋째 날에는 부착된 세포를 방해하지 않고 연기 후드 진공을 사용하여 96웰 플레이트의 우물에서 미디어를 흡인하고 각 우물에 4%의 파라포름알데히드 50마이크로리터를 첨가한다. 호일로 접시를 감싸고 나면 실온에서 10분 간 그대로 둡니다.나중에 실온에서 PBS 200 마이크로리터로 세포를 두 번 세척하고 흡입합니다. 두 번째 세척 후, 파이펫 200 마이크로리터의 미리 따뜻해진 PBS를 각 우물로 감싸고, 90분간 65도에서 배양한 후 내생 알칼리성 인산염 활성을 제거한 후, 새로 준비된 BCIP/NBT의 50 마이크로리터에서 각 웰및 2시간 동안 2시간 동안 2시간 동안 쿠베이에 싸여 있습니다. 나중에, 모든 에세이에 대해 동일한 노출, 흰색 밸런싱 및 빛 설정을 일관되게 사용할 수 있도록 가벼운 현미경 카메라에서 4X 목표 렌즈를 사용하여 각 우물의 사진을 찍습니다.ImageJ에서 이미지를 분석하려면 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다. 컬러 이미지의 경우 이미지, 유형 및 8비트 탭을 순서대로 선택하여 회색 축척으로 변환합니다. 그런 다음 이미지 탭으로 이동하여 조정 및 임계값을 선택하여 모든 색상 영역이 빨간색으로 지정되고 빨간색이 아니라 배경이 지정되지 않을 때까지 임계값을 변경합니다.측정 분석 및 설정을 클릭하고 지정된 신호 판독을 결정하기 OK.To 전에 영역, 영역 분획, 임계값 제한 및 표시 레이블에 대한 확인란을 선택하여 팝업 창의 백분율 영역 열에 신호 판독값을 표시하도록 분석 및 측정을 클릭합니다. 연구 결과는 바이러스 게놈의 사격량의 범위에서 세포에 있는 AAV6-hPLAP 기자 유전자를 추가하여 최적 바이러스성 복용량을 설치했습니다. 15, 000의 감염의 복합성은 36%의 플레이트 색화를 부여하고 최적의 바이러스 성 투여량으로 선택되었다.대표적인 분석은 착색과 감염의 복합성 사이의 상관 관계를 표시합니다. 착색과 바이러스 농도 사이의 선형 상관관계에 영향을 미치지 않은 가장 높은 시험 농도가 얻어졌다. 로그 10 희석에서 아데노 어소시에이트 바이러스 또는 AAV6에 대한 항 AAV6 단일 클론 항체에 대한 중화 활성을 중화하는 연구는 밀리리터 당 10 나노그램의 농도에서 AAV6 트랜스듀션 또는 TI50의 50% 억제를 보였다.중화 항체 또는 NAb 분석에서, AAV 중화의 정도는 1/2에서 1/80에 이르는 TI50 titre 값을 가진 순진한 견본 집단 내에서 변화하였다. 분석 결과는 AAV 투여 전에 AAV 억제 TI50 titre 값이 1/4에서 1/80까지 구역 수색했다는 것을 표시했습니다. AAV 투여 후 TI50 titre는 1/2000 사이로 증가하고 1/32, 000 이상으로 증가하여 AAV 이전 및 사후 관리 사이의 titre 값에서 명확한 대조를 보여 주어.우물의 사진을 찍을 때, 지속적으로 분석 전반에 걸쳐 동일한 현미경 설정을 사용하고 또한 사진이 우물의 중앙에 직접 촬영되도록하는 것이 중요합니다.

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