Name: a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay at JoVE.com

Denne studien ble finansiert av et National Health and Medical Research Council Project Grant til JRM og CJT (ID 1163732) og delvis av den viktorianske regjeringens operative infrastrukturstøtteprogram. SB støttes av et felles Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral Scholarship. KLW støttes av The Shine On Foundation og future leader fellowship fra National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM støttes av National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (ID 1078985).

Alle aspekter av dyrepleie og eksperimentering ble utført etter Florey Institute of Neuroscience and Mental Health retningslinjer og australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes etter Referanse25. 1,5-3 år gamle Merino ewes ble brukt til studien. En skjematisk oversikt over analyseprotokollen finnes i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63419/63419...

Denne rapporten beskriver en kolorimetrisk analyse som vurderer omfanget av AAV-nøytralisering i en gitt serumprøve ved å evaluere en kromogene reaksjon som tilsvarer graden av in vitro viral transduksjon. Utviklingen av protokollen var basert på den kjente kromogene reaksjonen mellom enzymet alkalisk fosfatase og NBT/BCIP, som har blitt mye brukt som et fargingsverktøy for påvisning av proteinmål i applikasjoner som immunhiistokjemi og som reporterverktøy for evaluering av viral transduksjon24,33,34,35<...

Adeno-assosierte virus (AAV) brukes i økende grad som vektorer for levering av genterapier for å prøve behandlinger for ulike helsetilstander som påvirker kardiovaskulære, lunge-, sirkulasjons-, okulære og sentralnervesystemer1,2,3,4,5. Populariteten til AAV-vektorer som en ledende genterapiplattform stammer fra deres positive sikkerhetsprofil, langsiktige transgene uttrykk og omfattende vevsspesifikke tropismer1,6. Vellykkede resultater i dyrestudier har banet vei for over femti kliniske studier av AAV-genterapi som har nådd sine effektendepunkter7, samt utgivelsen av det første kommersielt tilgjengelige AAV-genterapimedisinen godkjent av US Food and Drug Administration8. Etter innledende suksesser har AAV fortsatt å få trekkraft i de grunnleggende og kliniske forskningssektorene som en vektor av valg og er for tiden den eneste in vivo genterapi godkjent for klinisk bruk i USA og Europa9. Likevel, tilstedeværelsen av eksisterende nøytraliserende antistoffer (NAbs) mot AAV vektor capsids er fortsatt en hindring for både preklinisk forskning og effekten av kliniske studier. NAbs er til stede i både naive menneskelige og dyrepopulasjoner og hemmer gentransduksjon etter in vivo-administrering av en AAV-vektor1. AAV seropositivity er et eksklusjonskriterium for de fleste genterapiforsøk, og derfor er foreløpig screening for vertsimmunitet avgjørende i både laboratoriet og klinikken. Etablering av en analyse som kan oppdage tilstedeværelsen av NAbs mot AAV er et viktig skritt i rørledningen til ethvert AAV-genterapibasert forskningsprosjekt. Denne rapporten fokuserer på AAV6 som har vært av interesse for forskere på grunn av sin effektive og selektive transduksjon i strikket muskel (hjerte- og skjelettmuskulatur)1,10,11,12. Genterapi regnes som en lovende strategi for å målrette hjertet fordi det er vanskelig å spesifikt målrette hjertet uten invasive åpne hjerteprosedyrer.
Nøytraliserende aktivitet bestemmes vanligvis ved hjelp av enten en cellebasert in vitro eller in vivo transduksjonsinhiberingsanalyse. In vivo NAb-analyser innebærer vanligvis administrering av serum fra et testemne (f.eks. menneske eller stort dyr) til mus, etterfulgt av en AAV med et reportergen, etterfulgt av testing for uttrykket av reportergenet eller tilsvarende antigen. In vitro-analyser bestemmer NAb-titere ved å inkubere serum eller plasma fra et menneske eller stort dyr i serielle fortynninger med en rekombinant AAV (rAAV) som uttrykker et reportergen. Celler er smittet med serum/virusblandingen, og i hvilken grad reportergenuttrykket hemmes, vurderes sammenlignet med kontroller. In vitro-analyser er mye brukt til NAb-screening på grunn av deres relativt lavere kostnader, hurtighet i testing og større kapasitet for standardisering og validering13,14 sammenlignet med in vivo-analyser. In vivo-analyser rapporteres ofte å ha større følsomhet15,16, men det samme kravet er gjort om in vitro-analyser14,17.
Til dags dato har in vitro NAb-analyser hovedsakelig brukt luminescens (luciferase) som reportergen for å oppdage nøytralisering. Selv om en lysbasert metode har fortjeneste i mange sammenhenger, kan en kolorimetrisk/kromogene NAb-analyse i noen tilfeller være fordelaktig. Kolorimetriske analyser for å vurdere nøytralisering har blitt brukt for andre virus som influensa og adenovirus18,19. Deres attraktivitet stammer fra deres enkelhet, lavere kostnader og kravet til bare hverdagslige laboratorieapparater og verktøy20. NAb-analyser som bruker et luminescensbasert reportergen krever kostbare substratsett, et luminometer og tilsvarende programvare for analyse21. Denne kolorimetriske analysen har fordelen av å bare kreve et lett mikroskop og et veldig billig substrat. Rapportering av sensitiviteten til kolorimetriske versus luminescerende analyser har gitt motstridende resultater. En studie antydet at luminescensbaserte ELISA-analyser viser større følsomhet og sammenlignbar reproduserbarhet for kolorimetriske analyser22, mens en annen fant kolorimetriske ELISA-analyser for å gi større følsomhet23. Her er en detaljert protokoll for en in vitro NAb-analyse mot AAV som utnytter kromogene reaksjonen mellom en AAV-koding av et alkalisk fosfatase (AP) reportergen og et nitroblått tetrazolium /5-bromo-4-klor-3-indolylfosfat (NBT / BCIP) substrat gitt. Denne trinnvise protokollen ble utviklet basert på en tidligere rapport som benyttet en hPLAP (human placental alkalisk fosfatase) reportergen (AAV6-hPLAP) for å oppdage nøytraliserende aktivitet mot AAV24. Denne analysen er kostnadseffektiv, tidseffektiv, enkel å sette opp og krever minimale tekniske ferdigheter, laboratorieutstyr og reagenser. Videre gir enkelheten i denne analysen det potensialet til å bli optimalisert for brede applikasjoner på tvers av forskjellige typer celler, vev eller virale serotyper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 square flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottomed plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6-CMV-hPLAP Vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Muscle Research &#38; Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>610159</td>
			<td>Positive control monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>SIGMAFAST</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and tissue culture safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 &#38; 10 mL stripette inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT1080 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of taking photos with a 4x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For a 65 &#176;C incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 &#956;L, 200 &#956;L &#38; 1 mL single pipettes and tips &#38; 200 &#956;L multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup quick release filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td>Used for combining media reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>455071</td>
			<td>Used for serum collection &#38; processing from sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay

Rekombinante adeno-assosierte virus (rAAV) har vist seg å være en sikker og vellykket vektor for overføring av genetisk materiale for å behandle ulike helsetilstander i både laboratoriet og klinikken. Imidlertid utgjør eksisterende nøytraliserende antistoffer (NAbs) mot AAV-capsids en pågående utfordring for vellykket administrasjon av genterapier i både store dyreforsøksmodeller og menneskelige populasjoner. Foreløpig screening for vertsimmunitet mot AAV er nødvendig for å sikre effekten av AAV-baserte genterapier som både et forskningsverktøy og som et klinisk levedyktig terapeutisk middel. Denne protokollen beskriver en kolorimetrisk in vitro-analyse for å oppdage nøytraliserende faktorer mot AAV-serotype 6 (AAV6). Analysen benytter reaksjonen mellom en AAV-koding av et alkalisk fosfatase (AP) reportergen og dets substrat NBT/BCIP, som genererer en uoppløselig kvantifiserbar lilla flekk ved kombinasjon. 
I denne protokollen kombineres serumprøver med en AAV som uttrykker AP og inkuberes for å tillate potensiell nøytraliserende aktivitet. Virusserumblanding tilsettes deretter til celler for å muliggjøre viral transduksjon av AAVer som ikke er nøytralisert. NBT/BCIP-substratet tilsettes og gjennomgår en kromogene reaksjon, som tilsvarer viral transduksjon og nøytraliserende aktivitet. Andelen områdefargede er kvantisert ved hjelp av et gratis programvareverktøy for å generere nøytraliserende titere. Denne analysen viser en sterk positiv sammenheng mellom fargelegging og viruskonsentrasjon. Vurdering av serumprøver fra sau før og etter administrering av en rekombinant AAV6 førte til en dramatisk økning i nøytraliserende aktivitet (125 til > økning på 10 000 ganger). Analysen viste tilstrekkelig følsomhet for å oppdage nøytraliserende aktivitet i >1:32,000 serumfortynning. Denne analysen gir en enkel, rask og kostnadseffektiv metode for å oppdage NAbs mot AAVer.

Transduksjonsanalyse for å etablere optimal viral dosering for platedekning HT1080-celler, en veletablert fibrosarcoma-cellelinje, ble valgt for denne analysen. En konsentrasjon på 1 x 104 HT1080 celler / brønn ga ~ 50% cellesamstrømning i hver brønn av en 96-brønns plate. For å bestemme den optimale viruskonsentrasjonen for analysen ble en rAAV-koding av en hPLAP (human placental alkalisk fosfat) reportergen (AAV6-hPLAP)31 tilsatt i triplikat ved en rekke kon...

Watch this Scientific Journal Video about A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay at JoVE.com

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

En omfattende laboratorieprotokoll og analysearbeidsflyt er beskrevet for en rask, kostnadseffektiv og enkel kolorimetrisk cellebasert analyse for å oppdage nøytraliserende elementer mot AAV6.

En trinnvis metode for å oppdage nøytraliserende antistoffer mot AAV ved hjelp av en kolorimetrisk cellebasert analyse

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

Preeksisterer antistoffer som nøytraliserer AAV utgjør en barriere for fremme av AAV genterapier. Denne analysen er et screeningverktøy for å oppdage nøytraliserende antistoffer mot AAV. Den største fordelen er at den er kostnadseffektiv, tidseffektiv, enkel å sette opp og krever minimale tekniske ferdigheter, laboratorieutstyr og reagenser.Begynn å plating HT1080 celler på dag én ved å fortynne cellene til en konsentrasjon på 1 x 10 til femte celler per milliliter i forvarmet komplett DMEM media. Frø deretter 100 mikroliter celler per brønn i klare 96-brønns flatbunnede plater til konsentrasjonen på 1 x 10 til fjerde celler per brønn. Inkuber platen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid over natten i 16 til 22 timer.På dag to, generere serielle fortynning av serumprøver av interesse i 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør ved hjelp av forvarmet komplett DMEM. Til hvert rør med fortynnede serumprøver, tilsett 66 mikroliter av 7,5x10 til seks virale genomet per mikrolitervirus arbeidsløsning. Bland virusserumfortynning ved pipettering og plasser deretter rørene som inneholder virusserumblandingene i en inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 30 minutter for å tillate potensiell nøytralisering.Etter 30 minutter, pipette 100 mikroliter av viruset serum blanding til hver brønn på 96-brønnsplaten som inneholder 1x10 til fjerde celler per brønn, deretter pakke platen i en folie for å plassere i en inkubator på 37 grader Celsius med 5% karbondioksid over natten i 16 til 24 timer. På dag tre aspirerer du mediene fra brønnene på 96-brønnsplaten ved hjelp av et avtrekkshettestøvsuger uten å forstyrre de festede cellene og tilsett 50 mikroliter 4% paraformaldehyd til hver brønn. Etter å ha pakket platen i folie, la den stå i 10 minutter ved romtemperatur.Senere vasker og aspirerer cellene to ganger med 200 mikroliter PBS ved romtemperatur. Etter den andre vasken, pipette 200 mikroliter av forvarmet PBS i hver brønn og pakk platen i folie etterfulgt av inkubasjon ved 65 grader Celsius i 90 minutter for å denaturere endogen alkalisk fosfataseaktivitet, etter inkubasjon ved 50 mikroliter av den nylagde oppløste BCIP / NBT i hver brønn og inkubere de innpakkede platene ved romtemperatur i to timer. Senere kan du ta bilder av hver brønn ved hjelp av en 4X objektiv linse i et lysmikroskopkamera, noe som sikrer konsekvent bruk av samme eksponering, hvit balansering og lysinnstillinger for alle analyser.Hvis du vil analysere bildet i ImageJ, merker du filen og klikker Åpne. For de fargede bildene konverterer du til gråtoner ved å velge kategoriene Bilde, Type og 8-biters i rekkefølge. Gå deretter til Bilde-fanen og velg Juster og Terskelverdi for å endre terskelen til alle fargede områder er farget og røde, men ikke bakgrunnen.klikk på Analyser og angi målinger og merk av i avmerkingsboksene for Areal, Arealfraksjon, Begrens til terskel og Vis etikett før du treffer OK.To bestemme signalavlesningen til en gitt brønn, klikk på Analyser og mål slik at kolonnen i prosentområdet i popup-vinduet viser signalavlesningen. Studien etablerte den optimale virale doseringen ved å legge til AAV6-hPLAP-reportergenet i cellene ved en rekke konsentrasjoner av det virale genomet. En multiplisitet av infeksjon på 15.000 ga 36% platefarge og ble valgt som den optimale virale doseringen.Den representative analysen viser sammenhengen mellom fargelegging og multiplikasjoner av infeksjon. Den høyeste testede konsentrasjonen som ikke påvirket den lineære korrelasjonen mellom fargelegging og viruskonsentrasjon ble oppnådd. Studien av nøytraliserende aktivitet på et anti-AAV6 monoklonalt antistoff mot adeno-assosiert virus eller AAV6 ved logg 10 fortynning viste 50% hemming av AAV6 transduksjon eller TI50 i en konsentrasjon på 10 nanogram per milliliter.I det nøytraliserende antistoffet eller NAb-analysen varierte graden av AAV-nøytralisering innenfor den naive utvalgspopulasjonen med TI50 titreverdier fra 1/2 til 1/80. Analyseresultatene indikerte at AAV-hemming av TI50-titerverdier før AAV-administrasjon varierte fra 1/4 til 1/80. Etter AAV-administrasjonen økte TI50-titeret til mellom 1/2000 og større enn 1/32 000, noe som viste en klar kontrast i titerverdier mellom før- og etter-AAV-administrasjon.Når du tar bilder av brønnene, er det viktig å konsekvent bruke de samme mikroskopinnstillingene gjennom hele analysen og også sørge for at bildene tas direkte i midten av brønnene.

Research

JoVE Journal

Biology

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

A Step-by-step Metode for Rekonstituering av en ABC Transporter inn Nanodisc lipidpartikler

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Konvertering av en Capture ELISA til en Luminex xMAP Assay bruker en Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Bruke coculture å oppdage Kjemisk mediert uspesifikt Interaksjoner

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

En metode for screening og validering av Resistente Mutasjoner Against kinaseinhibitorer

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

En metode for å velge Struktur-bytte aptamerer Anvendt til en Colorimetric Gold Nanopartikkel analysen

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Kolo Påvisning av bakterier Bruke lakmustest

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

En kvantitativ Dot Blot analysen for AAV titrering og bruk for funksjonell vurdering av Adeno-assosiert Virus montering-aktivere proteiner

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

En trinnvis guide til Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...