Name: a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay at JoVE.com

Это исследование финансировалось грантом Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям JRM и CJT (ID 1163732) и частично Программой поддержки оперативной инфраструктуры правительства Виктории. SB поддерживается совместной докторской стипендией Института сердца и диабета Бейкера и Университета Ла Троуб. KLW поддерживается Фондом «Сияние» и стипендией «Будущий лидер» от Национального фонда сердца Австралии (ID 102539). JRM поддерживается Старшим научным сотрудником Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (ID 1078985).

Все аспекты ухода за животными и экспериментов проводились в соответствии с руководящими принципами Института неврологии и психического здоровья Флори и Австралийским кодексом по уходу за животными и их использованию в научных целях после ссылки25. Для исследования испо?...

В этом отчете описывается колориметрический анализ, который оценивает степень нейтрализации AAV в данном образце сыворотки путем оценки хромогенной реакции, соответствующей степени вирусной трансдукции in vitro. Разработка протокола была основана на известной хромогенной реакции м?...

Аденоассоциированные вирусы (AAV) все чаще используются в качестве векторов для доставки генной терапии для пробного лечения различных состояний здоровья, которые влияют на сердечно-сосудистую, легочную, кровеносную, глазную и центральную нервную системы1,2,3,4,5. Популярность векторов AAV в качестве ведущей платформы генной терапии обусловлена их положительным профилем безопасности, долгосрочной экспрессией трансгенов и широким спектром тканеспецифических тропизмов1,6. Успешные результаты в исследованиях на животных проложили путь для более чем пятидесяти клинических испытаний генной терапии AAV, которые успешно достигли своих конечных точек эффективности7, а также выпуск первого коммерчески доступного препарата генной терапии AAV, одобренного Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США8. После первоначальных успехов AAV продолжает набирать обороты в секторах фундаментальных и клинических исследований в качестве вектора выбора и в настоящее время является единственной генной терапией in vivo, одобренной для клинического использования в США и Европе9. Тем не менее, наличие ранее существовавших нейтрализующих антител (NAbs) против капсидов вектора AAV остается препятствием как для доклинических исследований, так и для эффективности клинических испытаний. NAb присутствуют как в наивных популяциях людей, так и в популяциях животных и ингибируют трансдукцию генов после введения in vivo вектора AAV1. Серопозитивность AAV является критерием исключения для большинства испытаний генной терапии, и поэтому предварительный скрининг на иммунитет хозяина имеет решающее значение как в лаборатории, так и в клинике. Создание анализа, который может обнаружить присутствие NAb против AAV, является важным шагом в рамках любого исследовательского проекта на основе генной терапии AAV. В этом отчете основное внимание уделяется AAV6, который представляет интерес для исследователей из-за его эффективной и селективной трансдукции в поперечно-полосатых мышцах (сердце и скелетные мышцы) 1,10,11,12. Генная терапия считается многообещающей стратегией для нацеливания на сердце, потому что трудно конкретно нацелиться на сердце без инвазивных процедур на открытом сердце.
Нейтрализующую активность обычно определяют с помощью клеточного анализа ингибирования трансдукции in vitro или in vivo. In vivo Анализы NAb обычно включают введение сыворотки от испытуемого (например, человека или крупного животного) мышам, за которым следует AAV с репортерным геном, с последующим тестированием экспрессии репортерного гена или соответствующего антигена. Анализы in vitro определяют титры NAb путем инкубации сыворотки или плазмы человека или крупного животного в серийных разведениях рекомбинантным AAV (rAAV), который экспрессирует репортерный ген. Клетки инфицируются смесью сыворотки и вируса, и степень, в которой экспрессия репортерного гена ингибируется, оценивается по сравнению с контрольной группой. Анализы in vitro широко используются для скрининга NAb из-за их сравнительно более низкой стоимости, быстроты тестирования и большей способности к стандартизации и валидации13,14 по сравнению с анализами in vivo. Часто сообщается, что анализы in vivo обладают большей чувствительностью15,16, но то же самое утверждение было сделано в отношении анализов in vitro14,17.
На сегодняшний день анализы in vitro NAb в основном используют люминесценцию (люциферазу) в качестве гена-репортера для обнаружения нейтрализации. Хотя метод, основанный на свете, имеет свои достоинства во многих контекстах, колориметрический/хромогенный анализ NAb может быть полезным в некоторых обстоятельствах. Колориметрические анализы для оценки нейтрализации были успешно использованы для других вирусов, таких как грипп и аденовирус18,19. Их привлекательность проистекает из их простоты, более низкой стоимости и потребности только в повседневной лабораторной аппаратуре и инструментах20. Анализы NAb, в которых используется репортерный ген на основе люминесценции, требуют дорогостоящих наборов субстратов, люминометра и соответствующего программного обеспечения для анализа21. Этот колориметрический анализ имеет то преимущество, что требует только светового микроскопа и очень дешевой подложки. Отчетность о чувствительности колориметрических и люминесцентных анализов дала противоречивые результаты. Одно исследование показало, что анализы ИФА на основе люминесценции демонстрируют большую чувствительность и сопоставимую воспроизводимость с колориметрическими анализами22, в то время как другое обнаружило, что анализы ИФА на основе колориметрии придают большую чувствительность23. Здесь представлен подробный протокол для анализа in vitro NAb против AAV, который использует хромогенную реакцию между AAV, кодирующим ген-репортер щелочной фосфатазы (AP), и нитро-синим тетразолием / 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфатным (NBT / BCIP) субстратом. Этот пошаговый протокол был разработан на основе предыдущего отчета, в котором использовался ген-репортер hPLAP (человеческая плацентарная щелочная фосфатаза) (AAV6-hPLAP) для обнаружения нейтрализующей активности против AAV24. Этот анализ является экономически эффективным, эффективным по времени, простым в настройке и требует минимальных технических навыков, лабораторного оборудования и реагентов. Кроме того, простота этого анализа дает ему возможность быть оптимизированным для широкого применения в различных типах клеток, тканей или вирусных серотипов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 square flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottomed plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6-CMV-hPLAP Vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Muscle Research &#38; Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>610159</td>
			<td>Positive control monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>SIGMAFAST</td>
			<td>B5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and tissue culture safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 &#38; 10 mL stripette inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT1080 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of taking photos with a 4x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For a 65 &#176;C incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 &#956;L, 200 &#956;L &#38; 1 mL single pipettes and tips &#38; 200 &#956;L multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup quick release filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td>Used for combining media reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>455071</td>
			<td>Used for serum collection &#38; processing from sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step-by-step method to detect neutralizing antibodies against aav using a colorimetric cell-based assay

Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV) оказались безопасным и успешным вектором для передачи генетического материала для лечения различных состояний здоровья как в лаборатории, так и в клинике. Тем не менее, ранее существовавшие нейтрализующие антитела (NAbs) против капсидов AAV представляют собой постоянную проблему для успешного введения генной терапии как в экспериментальных моделях крупных животных, так и в человеческих популяциях. Предварительный скрининг на иммунитет хозяина против AAV необходим для обеспечения эффективности генной терапии на основе AAV как исследовательского инструмента, так и в качестве клинически жизнеспособного терапевтического агента. Этот протокол описывает колориметрический анализ in vitro для обнаружения нейтрализующих факторов против серотипа AAV 6 (AAV6). Анализ использует реакцию между AAV, кодирующим ген-репортер щелочной фосфатазы (AP), и его субстратом NBT / BCIP, который генерирует нерастворимое количественно оцениваемое фиолетовое пятно при комбинации. 
В этом протоколе образцы сыворотки объединяются с AAV-экспрессирующим AP и инкубируются, чтобы обеспечить потенциальную нейтрализующую активность. Смесь вирусной сыворотки впоследствии добавляется к клеткам, чтобы обеспечить вирусную трансдукцию любых AAV, которые не были нейтрализованы. Субстрат NBT/BCIP добавляется и подвергается хромогенной реакции, соответствующей вирусной трансдукции и нейтрализующей активности. Доля окрашенной площади количественно измеряется с помощью инструмента свободного программного обеспечения для генерации нейтрализующих титров. Этот анализ показывает сильную положительную корреляцию между окраской и концентрацией вируса. Оценка образцов сыворотки крови овец до и после введения рекомбинантного AAV6 привела к резкому увеличению нейтрализующей активности (увеличение в 125->10 000 раз). Анализ показал адекватную чувствительность для выявления нейтрализующей активности в >1:32 000 сывороточных разведений. Этот анализ обеспечивает простой, быстрый и экономически эффективный метод обнаружения NAb против AAV.

Трансдукционный анализ для установления оптимальной вирусной дозировки для покрытия пластин Для этого анализа были отобраны клетки HT1080, хорошо зарекомендовавшая себя клеточная линия фибросаркомы. Концентрация 1 х 104 HT1080 клеток/лунка обеспечивала ~50% клеточного слияни...

Watch this Scientific Journal Video about A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay at JoVE.com

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Описан комплексный лабораторный протокол и рабочий процесс анализа для быстрого, экономически эффективного и простого колориметрического анализа на основе клеток для обнаружения нейтрализующих элементов против AAV6.

Пошаговый метод обнаружения нейтрализующих антител против AAV с использованием колориметрического клеточного анализа

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

Ранее существовавшие антитела, которые нейтрализуют AAV, представляют собой барьер для продвижения генной терапии AAV. Этот анализ является инструментом скрининга для выявления нейтрализующих антител против AAV. Основным преимуществом является то, что он экономичен, экономит время, прост в настройке и требует минимальных технических навыков, лабораторного оборудования и реагентов.Начните покрывать клетки HT1080 в первый день, разбавляя клетки до концентрации от 1 х 10 до пятой клетки на миллилитр в предварительно нагретой полной среде DMEM. Затем посейте 100 микролитров клеток на лунку в прозрачные 96-луночные плоскодонные пластины до концентрации 1 х 10 до четвертой ячейки на лунку. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% углекислым газом в течение 16-22 часов.На второй день генерируйте серийные разведения интересующих образцов сыворотки в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных трубках с использованием предварительно нагретого полного DMEM. К каждой пробирке с разбавленными образцами сыворотки добавляют 66 микролитров 7,5x10 к шести вирусным геномам на микролитр рабочего раствора вируса. Смешайте разбавление сыворотки вируса путем пипетирования, а затем поместите пробирки, содержащие смеси сыворотки вируса, в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 30 минут, чтобы обеспечить потенциальную нейтрализацию.Через 30 минут пипетку 100 микролитров смеси сыворотки вируса в каждую лунку на 96-луночной пластине, содержащей 1x10 до четвертой клетки на лунку, затем обернули пластину в фольгу для размещения в инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа на ночь на 16-24 часа. На третий день аспирируйте среду из скважин 96-луночной пластины с использованием вакуума дымовой вытяжки, не нарушая прилипшие ячейки, и добавьте 50 микролитров 4% параформальдегида в каждую скважину. Завернув тарелку в фольгу, оставьте ее на 10 минут при комнатной температуре.Позже промыть и аспирировать клетки дважды 200 микролитрами PBS при комнатной температуре. После второй промывки пипетку 200 микролитров предварительно нагретого ПБС в каждую лунку и заворачивают пластину в фольгу с последующей инкубацией при 65 градусах Цельсия в течение 90 минут для денатурации эндогенной щелочной активности фосфатазы после инкубации на 50 микролитрах свежеприготовленного растворенного BCIP/NBT в каждую лунку и инкубируют обернутые пластины при комнатной температуре в течение двух-24 часов. Позже сделайте фотографии каждой скважины с помощью объектива 4X в камере светового микроскопа, обеспечив последовательное использование одной и той же экспозиции, балансировки белого и настроек освещения для всех анализов.Чтобы проанализировать изображение в ImageJ, выберите файл и нажмите кнопку Открыть. Для цветных изображений преобразуйте их в шкалу серого, выбрав вкладки Изображение, Тип и 8-битные вкладки по порядку. Затем перейдите на вкладку «Изображение» и выберите «Настроить» и «Порог», чтобы изменить пороговое значение, пока все цветные области не станут окрашенными и красными, а фон — нет.нажмите «Анализировать и устанавливать измерения» и установите флажки «Площадь», «Доля площади», «Предел порога» и «Отображать метку», прежде чем нажать OK.To определить показания сигнала данной скважины, нажмите «Анализировать и измерять», чтобы в столбце процентной площади всплывающего окна отображалось показание сигнала. Исследование установило оптимальную дозу вируса путем добавления гена-репортера AAV6-hPLAP в клетки в диапазоне концентраций вирусного генома. Кратность инфекции 15 000 придавала 36% окраски пластин и была выбрана в качестве оптимальной вирусной дозы.Репрезентативный анализ отображает корреляцию между окраской и множественностью инфекции. Получена самая высокая испытанная концентрация, которая не влияла на линейную корреляцию между окраской и вирусной концентрацией. Исследование нейтрализующей активности на анти-AAV6 моноклональном антителе против аденоассоциированного вируса или AAV6 в разведении log 10 показало 50%-ное ингибирование трансдукции AAV6 или TI50 в концентрации 10 нанограмм на миллилитр.В анализе нейтрализующих антител или NAb степень нейтрализации AAV варьировалась в пределах наивной выборочной популяции со значениями титра TI50 в диапазоне от 1/2 до 1/80. Результаты анализа показали, что значения титра AAV ингибирования TI50 до введения AAV варьировались от 1/4 до 1/80. После введения AAV титр TI50 увеличился до 1/2000 и более 1/32 000, демонстрируя четкий контраст в значениях титра между введением до и после AAV.При фотографировании скважин важно последовательно использовать одни и те же настройки микроскопа на протяжении всего анализа, а также убедиться, что фотографии сделаны непосредственно в центре скважин.

Research

JoVE Journal

Biology

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Шаг за шагом метод для разведения Transporter ABC в Nanodisc липидных частиц

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Преобразование Capture ИФА в Пробирной Luminex Xmap помощью скрининга Мультиплекс антител методом

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Использование сокультивирования обнаружить химически опосредованной межвидовых взаимодействий

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Анализ апоптоза у эмбрионов данио рерио по целом монтажа иммунофлуоресценции для обнаружения активированного каспазы 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Метод скрининга и проверка мутаций устойчивости против ингибиторов киназ

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Способ выбора Структура переключения Аптамеры Применительно к колориметрическим наночастиц золота Пробирной

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Колометрической Обнаружение бактерий с помощью лакмусовой тест

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Блот Assay количественных Dot для AAV титрования и его использования для функциональной оценки аденоассоциированный вирус Ассамблеи-активации белков

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Пошаговое руководство по электроантенографии комаров

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...