Name: quail chorioallantoic membrane - a tool for photodynamic diagnosis and therapy
Uploaded: 2022-04-28T12:30:00
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O trabalho foi apoiado pela VEGA 2/0042/21 e APVV 20-0129. A contribuição de V. Huntošová é o resultado da implementação do projeto: Comunidade científica aberta para a investigação interdisciplinar moderna em medicina (Acrónimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 apoiada pelo Programa Operacional Infraestrutura Integrada, financiado pelo FEDER.

A pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais. Todos os equipamentos e reagentes devem ser autoclavados ou esterilizados com etanol a 70% ou luz UV.
1. Incubação de ovos
<ol><li>Armazenar ovos de codorna fertilizados a 10-15 °C por um máximo de 4-5 dias antes de iniciar a incubação. Use apenas ovos limpos e não danificados.</li>
	<li>Incube os ovos em uma incubadora de tração forçada por ~ 53-54 h. Coloque os ovos horizontalmente com a r...

<ol>
	<li>Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Grif&#64257;oen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+regrowth+following+photodynamic+therapy+in+the+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane.">Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane.</a> Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).</li><li>van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+photodynamic+effects+of+phthalocyanines+in+a+skin-fold+observation+chamber+model:+role+of+central+metal+ion+and+degree+of+sulfonation.">In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation.</a> Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+the+Japanese+quail.">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).</li><li>De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+microcirculation+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+during+normal+angiogenesis.">Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis.</a> Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).</li><li>Sandau, K., Kurz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+vascular+growth+processes:+a+stochastic+biophysical+approach+to+embryonic+angiogenesis.">Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis.</a> Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).</li><li>Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marm&#233;, D., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+pattern+of+capillary+endothelial+cells+in+chorioallantoic+membrane+development+indicates+local+growth+control,+which+is+counteracted+by+vascular+endothelial+growth+factor+application.">Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).</li><li>Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+quail+(Coturnix+japonica)+as+laboratory+animal+model.">Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model.</a> Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).</li><li>Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+chorioallantoic+membrane+(CAM)+as+an+in-vivo+model+for+photodynamic+therapy.">The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).</li><li>Mi&#353;kovsk&#253;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypericin+-+a+new+antiviral+and+antitumor+photosensitizer:+mechanism+of+action+and+interaction+with+biological+molecules.">Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules.</a> Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).</li><li>&#268;avarga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+effect+of+hypericin+after+topical+application+in+the+ex+ovo+quail+chorioallantoic+membrane+model.">Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model.</a> Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).</li><li>Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypericin+in+the+dark+inhibits+key+steps+of+angiogenesis+in+vitro.">Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro.</a> Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+excellent+chemical+stability+and+bioavailability+of+solvent+responsive+curcumin-loaded+2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)-+2-oxazoline+copolymer+nanoparticles+for+drug+delivery.">Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery.</a> Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).</li><li>Hunto&#353;ov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkyl+Chain+length+in+poly(2-oxazoline)-based+amphiphilic+gradient+copolymers+regulates+the+delivery+of+hydrophobic+molecules:+a+case+of+the+biodistribution+and+the+photodynamic+activity+of+the+photosensitizer+hypericin.">Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin.</a> Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).</li><li>Bur&#237;kov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypericin+fluorescence+kinetics+in+the+presence+of+low+density+lipoproteins:+study+on+quail+CAM+assay+for+topical+delivery.">Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery.</a> General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).</li><li>Lenkavska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benefits+of+hypericin+transport+and+delivery+by+low-+and+high-density+lipoproteins+to+cancer+cells:+From+in+vitro+to+ex+ovo.">Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).</li><li>R&#252;ck, A., B&#246;hmler, A., Steiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDT+with+TOOKAD+studied+in+the+chorioallantoic+membrane+of+fertilized+eggs.">PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).</li><li>Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+damage+to+chorioallantoic+membrane+blood+vessels+by+porphycene-induced+photodynamic+therapy.">In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).</li><li>Buzz&#225;, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+vascular+effect+of+Photodynamic+Therapy+in+chorioallantoic+membrane+using+different+photosensitizers.">Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).</li><li>Dougherty, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy.">Photodynamic therapy.</a> Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optoacoustic+monitoring+of+vascular+damage+during+photodynamic+therapy+treatment+of+tumor.">Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>M&#225;&#269;ajov&#225;, M., &#268;avarga, I., S&#253;korov&#225;, M., Valachovi&#269;, M., Novotn&#225;, V., Bil&#269;&#237;k, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+angiogenesis+by+topical+application+of+leptin+and+high+and+low+molecular+heparin+using+the+Japanese+quail+chorioallantoic+membrane+model.">Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).</li><li>Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ex+Ovo+chick+chorioallantoic+membrane+(CAM)+assay+to+evaluate+the+biocompatibility+and+angiogenic+response+to+biomaterials.">Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials.</a> ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).</li><li>Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+applications+of+the+egg:+chorioallantoic+membrane+assay+and+ex+vivo+organotypic+culture+of+materials+for+bone+tissue+engineering.">Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).</li><li>Merlos Rodrigo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+applicability+of+in+ovo+and+ex+ovo+chicken+chorioallantoic+membrane+assays+to+study+cytostatic+activity+in+neuroblastoma+cells.">Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).</li><li>Meta, M., Kundekov&#225;, B., Bil&#269;&#237;k, B., M&#225;&#269;ajov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+silicone+ring+application+on+CAM+vasculature+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).</li><li>Kohli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-screening+the+intrinsic+angiogenic+capacity+of+biomaterials+in+an+optimised+ex+ovo+chorioallantoic+membrane+model.">Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model.</a> Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).</li><li>Kundekov&#225;, B., M&#225;&#269;ajov&#225;, M., Meta, M., &#268;avarga, I., Bil&#269;&#237;k, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+membrane+models+of+various+avian+species+differences+and+applications.">Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications.</a> Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).</li><li>Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor-2+selectively+stimulates+angiogenesis+of+small+vessels+in+arterial+tree.">Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).</li><li>Buzz&#225;, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., G&#243;mez-Garc&#237;a, P. B., Kurachi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+a+tumor+model+in+the+chorioallantoic+membrane+used+for+the+evaluation+of+different+photosensitizers+for+photodynamic+therapy.">Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).</li></ol>

Para um cultivo ex ovo bem-sucedido, é importante seguir o protocolo acima. Além disso, se os ovos não forem abertos com cuidado suficiente ou se houver umidade insuficiente durante o cultivo, o saco de gema gruda na casca e muitas vezes se rompe. O início de um cultivo ex ovo no momento de cerca de 60 h de incubação dos ovos garante a alta taxa de sobrevivência dos embriões, pois eles já são grandes o suficiente para sobreviver ao manuseio. Nos estágios posteriores de desenvolvimento, a CAM ...

O modelo de membrana corioalantóica de frango (CAM) é bem conhecido e amplamente utilizado em várias áreas de pesquisa. É um órgão extraembrionário ricamente vascularizado que proporciona troca gasosa e transporte mineral1. Devido à transparência e acessibilidade dessa membrana, vasos sanguíneos individuais e suas alterações estruturais podem ser observados em tempo real2. Apesar das vantagens, o CAM de pintos também tem algumas limitações (por exemplo, instalações de reprodução maiores, produção de ovos e consumo de ração) que poderiam ser evitadas usando outras espécies aviárias. Neste protocolo, um modelo alternativo ex ovo CAM usando embrião de codorna japonesa (Coturnix japonica) é descrito. Devido ao seu pequeno tamanho, permite o uso de um número muito maior de indivíduos experimentais do que o CAM de frango. Além disso, o desenvolvimento embrionário mais curto de 16 dias dos embriões de codornas é outra vantagem. Os primeiros vasos maiores na CAM das codornas aparecem no dia embrionário (DE) 7. Isso pode ser diretamente comparado com o desenvolvimento do embrião de pintinho (estágios 4-35); no entanto, os estágios posteriores de desenvolvimento não são mais comparáveis e requerem menos tempo para o embrião de codorna3. De interesse é a ocorrência regular de ramificação microvascular semelhante à dos CAMs de frango 4,5,6. A rápida maturação sexual, a alta produção de ovos e a reprodução de baixo custo são outros exemplos que favorecem o uso desse modelo experimental7.
Um modelo de MAC aviário é frequentemente utilizado em estudos de terapia fotodinâmica (TFD)8. A TFD é usada para tratar várias formas de câncer (pequenos tumores localizados) e outras doenças não oncológicas. Seu princípio está na entrega de um fármaco fluorescente, um fotossensibilizador (PS), ao tecido danificado e sua ativação com luz do comprimento de onda apropriado. Uma PS prospectiva utilizada em pesquisa é a hipericina, originalmente isolada da erva medicinal de São João (Hypericum perforatum)9. Os fortes efeitos fotossensibilizantes deste composto são baseados em suas propriedades fotoquímicas e fotofísicas. Estes são caracterizados por múltiplos picos de excitação por fluorescência na faixa de 400-600 nm, que induzem a emissão de fluorescência a cerca de 600 nm. Os máximos de absorção de hipericina dentro da banda espectral estão na faixa de 540-590 nm, e os máximos de fluorescência estão na faixa de 590-640 nm9. Para alcançar esses efeitos fotossensibilizantes, a hipericina é excitada pela luz do laser a um comprimento de onda de 405 nm após a administração local10. Na presença de luz, a hipericina pode apresentar efeitos virucidados, antiproliferativos e citotóxicos11, enquanto não há toxicidade sistêmica e é rapidamente liberada do organismo. A hipericina é uma substância lipofílica que forma agregados não fluorescentes insolúveis em água, razão pela qual vários tipos de nanocarreadores, como nanopartículas poliméricas12,13 ou lipoproteínas de alta e baixa densidade (HDL, LDL)14,15, são utilizados para auxiliar sua entrega e penetração nas células. Como a CAM é um sistema naturalmente imunodeficiente, as células tumorais podem ser implantadas diretamente na superfície da membrana. O modelo também é adequado para registrar a extensão do dano vascular induzido por TFD de acordo com um escore definido16,17. Luz de menor intensidade em comparação com a TFD pode ser utilizada para o diagnóstico fotodinâmico (TGD). O monitoramento do tecido sob excitação violeta da luz LED também leva à fotoativação de fotossensibilizadores18,19,20 que resulta em uma emissão de luz fluorescente, mas não fornece energia suficiente para iniciar uma reação PDT e danificar as células. Torna-se uma boa ferramenta para visualização e diagnóstico de tumores ou monitoramento da farmacocinética dos PSs utilizados14,15.
Este artigo descreve a preparação do ensaio de codorna ex ovo CAM com taxas de sobrevivência superiores a 80%. Esta cultura ex ovo foi aplicada com sucesso em um grande número de experimentos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td>Transparent polystyrene, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator ESCO CCL-0508</td>
			<td>ESCO, Singapore</td>
			<td>CCL-050B-8</td>
			<td>CO2 cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryocut Leica CM 1800</td>
			<td>Reichert-Jung, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital camera Canon EOS 6D II</td>
			<td>Canon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diode laser 405 nm</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>dimethyl sulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15086-94-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine brush size 2</td>
			<td>Faber-Castell</td>
			<td>281802</td>
			<td>brush for CAM separation and manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>111-30-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>517-28-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hypericin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84082-80-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator Bios Midi</td>
			<td>Bios Sedl<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63422/63422eq01.jpg" style="margin: auto;" />any, Czech Republic</td>
			<td></td>
			<td>Forced draught incubator for initial incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator Memmert IF160</td>
			<td>Memmert, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Forced air circulation incubator for CAM incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser slimlite plano, LED light box</td>
			<td>Kaiser, Germany</td>
			<td>2453</td>
			<td>Transilluminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light 405 nm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>custom made circular LED light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8</td>
			<td>Canon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope Kapa 2000</td>
			<td>Kvant, Slovakia</td>
			<td></td>
			<td>optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome Auxilab 508</td>
			<td>Auxilab, Spain</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3683</td>
			<td>parafin medium for tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Phosphate saline buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors Castroviejo</td>
			<td>Orimed</td>
			<td>&#160;OR66-108</td>
			<td>micro scissors for CAM separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software ImageJ 1.53</td>
			<td>public domain</td>
			<td></td>
			<td>image processing and analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stock solution HDL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437641-10MG</td>
			<td>high density lipoproteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stock solution LDL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437644-10MG</td>
			<td>low density lipoproteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles</td>
		</tr>
	</tbody>
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quail chorioallantoic membrane - a tool for photodynamic diagnosis and therapy

A membrana corioalantóica (CAM) de um embrião aviário é uma membrana fina e extraembrionária que funciona como um órgão respiratório primário. Suas propriedades o tornam um excelente modelo experimental in vivo para estudar angiogênese, crescimento tumoral, sistemas de liberação de drogas ou diagnóstico fotodinâmico (PDD) e terapia fotodinâmica (TFD). Ao mesmo tempo, este modelo aborda a exigência de substituição de animais experimentais por uma alternativa adequada. O embrião cultivado Ex ovo permite fácil aplicação, acesso, monitoramento e documentação de substâncias. O mais utilizado é o CAM de pintinhos; no entanto, este artigo descreve as vantagens da codorna japonesa CAM como um modelo de baixo custo e alto rendimento. Outra vantagem é o menor desenvolvimento embrionário, que permite maior rotatividade experimental. A adequação da CAM de codorna para PDD e PDT de câncer e infecções microbianas é explorada aqui. Como exemplo, descreve-se o uso do fotossensibilizador hipericina em combinação com lipoproteínas ou nanopartículas como sistema de entrega. O escore de dano das imagens em luz branca e as alterações na intensidade de fluorescência do tecido CAM sob luz violeta (405 nm) foram determinados, juntamente com a análise dos cortes histológicos. A CAM de codorna mostrou claramente o efeito da TFD sobre a vasculatura e o tecido. Além disso, alterações como hemorragia capilar, trombose, lise de pequenos vasos e sangramento de vasos maiores puderam ser observadas. A CAM de codorna japonesa é um modelo in vivo promissor para diagnóstico fotodinâmico e pesquisa terapêutica, com aplicações em estudos de angiogênese tumoral, bem como terapia antivascular e antimicrobiana.

A localização do tumor na superfície CAM é difícil na luz branca. Espera-se que o fotossensibilizador (aqui, hipericina) usado no PDD seja absorvido seletivamente pelo tumor e ajude a visualizar o tumor. A adição de hipericina e o uso de luz fluorescente (por exemplo, 405 nm) mostraram a posição muito bem do tumor (carcinoma espinocelular TE1) (Figura 6A). A análise histológica mostrou células tumorais vitais invadindo tecidos saudáveis. Estruturas concêntricas de células esca...

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Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

A membrana corioalantóica (CAM) do embrião aviário é uma ferramenta muito útil e aplicável para várias áreas de pesquisa. Um modelo ex ovo especial de CAM de codorna japonesa é adequado para investigação de tratamento fotodinâmico.

Membrana corioalantóica de codorna - Uma ferramenta para diagnóstico fotodinâmico e terapia

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

Vamos mostrar-lhe como preparar a cultura japonesa de codornas ex ovo e como usar a membrana corioalantóica ou CAM em resumo para diagnóstico fotodinâmico e terapia de câncer ou infecções microbianas. As vantagens deste método são o rápido crescimento do desenvolvimento, tamanho pequeno, bom acesso ao tecido e fácil manuseio. Além disso, respeita os princípios da regra 3R para a realização de pesquisas com animais.Devido à sua semelhança estrutural com as membranas mucosas, como a bexiga, os pulmões ou a placenta, é adequado para testes in vivo de potenciais drogas, testes de toxicidade ou estudos de transplante. Demonstrando o procedimento estarão Barbora Kundekova e Majlinda Meta, estudantes de doutorado do meu laboratório. Para começar, use ovos de codorna fertilizados, frescos ou armazenados a 10 a 15 graus Celsius por um máximo de 4 a 5 dias antes do início da incubação.Use apenas ovos limpos e não danificados, em seguida, incube os ovos em uma incubadora de tração forçada a 50 a 60% de umidade e 37,5 graus Celsius por aproximadamente 54 horas colocadas horizontalmente com as rotações de ovos desligadas. Desinfete a superfície do ovo com etanol a 70% sem girar o ovo. Em seguida, em um gabinete de fluxo laminar estéril enquanto estiver usando luvas, abra a casca do ovo usando uma pequena tesoura cirúrgica estéril e transfira o conteúdo para uma placa de cultura de 6 poços.Após cada ovo, desinfete a tesoura com etanol a 70%. Adicione aproximadamente 5 mililitros de água estéril às lacunas na placa de 6 poços, pois a umidade é essencial para evitar que o CAM seque. Em seguida, aspirar embriões com pontas inadequadas ou ovos não fertilizados com um aspirador a vácuo e, em seguida, coloque os embriões em uma incubadora até novos experimentos, mantendo uma temperatura de 37 graus Celsius em 80 a 90% de umidade.Quando a CAM estiver suficientemente desenvolvida, geralmente a partir do dia embrionário 7, coloque um anel de silicone esterilizado na superfície da CAM ao longo dos pequenos capilares, evitando os principais vasos sanguíneos. Em condições estéreis, aplique um volume apropriado de solução de hipericina 30 microlitros no anel de silicone e mantenha os embriões em uma incubadora a 37 graus Celsius em 80 a 90% de umidade. Para realizar o diagnóstico fotodinâmico, ilumine a CAM usando luz de excitação violeta e registre a fluorescência de hipericina e tecido CAM e células tumorais com uma câmera digital em diferentes intervalos de tempo após a administração de hipericina.Se a pesquisa exigir uma imagem da CAM em luz branca, registre a CAM antes da administração de hipericina e no final do experimento pouco antes da fixação tecidual, pois a luz desencadeia a fotoativação da hipericina. Para realizar a terapia fotodinâmica após a aplicação de hipericina, coloque o CAM sob a fibra óptica para que o feixe de laser cubra toda a área dentro do anel de silicone. Depois de realizar irradiação in vivo, neste caso particular com uma luz laser de 405 nanômetros a uma taxa de fluência de 285 miliwatts por centímetro quadrado, registre CAM usando luz branca e / ou luz fluorescente antes e após o tratamento fotodinâmico.Fixe o tecido CAM em uma placa de cultivo com paraformaldeído a 4% em PBS por um mínimo de 2 horas e um máximo de durante a noite, em seguida, remova o paraformaldeído e corte cuidadosamente do CAM uma parte do tecido dentro do anel de silicone. Todas essas etapas devem ser feitas em um exaustor. Lave a parte cortada do tecido CAM em água por 10 minutos e posteriormente desidrate em série de álcool ascendente, colocando o tecido CAM em etanol a 70% por 3 minutos, solução de eosina por 2 minutos, trocina 96% etanol por 5 minutos, etanol a 100% por 5 minutos e duas vezes em xileno por 10 minutos em uma nova placa de Petri.Subsequentemente, transferir as amostras o mais rapidamente possível para a parafina dissolvida em placas de Petri utilizando uma espátula ou escova fina. Após 24 horas, coloque o tecido em molde histológico, preencha-o com um meio de incorporação de parafina e deixe-o solidificar na geladeira, em seguida, corte o CAM solidificado do meio de incorporação, vire-o na bandeja em 90 graus, preencha-o novamente com o meio de incorporação e deixe-o solidificar. Prepare seções de 5 a 10 micrômetros em um micrótomo para análise histopatológica para determinar o dano induzido por TFD.Para preparar as seções de CAM congeladas para histologia, monte cuidadosamente CAM fixo nativo ou 4% paraformaldeído na lâmina de vidro, encha o molde de incorporação até a metade com OCT e congele em nitrogênio líquido ou uma mistura de gelo seco e etanol. Após o congelamento, incline e deslize cuidadosamente o CAM da lâmina de vidro para a parte superior do meio OCT congelado. Coloque novamente no molde, cubra-o com o meio OCT e congele como descrito anteriormente.Para a análise da vasculatura CAM, são necessárias amostras inteiras de CAM. No gabinete de fluxo laminar, transborde CAM com uma solução de fixação pré-aquecida de aldeído paraforme a 4% e glutaraldeído a 2% em PBS, retire a solução de fixação após 48 horas. Em seguida, separe cuidadosamente o CAM do embrião com micro tesoura e uma escova fina e lave-o em PBS, em seguida, monte o CAM lavado em uma lâmina de vidro e deixe-o secar lentamente.Depois, fotografe o slide usando uma câmera digital em um transiluminador como fonte de luz branca homogênea. A localização do tumor na superfície CAM foi visualizada sob luz branca e luz fluorescente após a adição de hipericina. A análise histológica mostrou estruturas concêntricas de células escamosas anormais invadindo os tecidos sadios acompanhadas de edema e espessamento da membrana.Após o tratamento com TFD, observou-se uma clara diferença na densidade do vaso dentro do anel e da área circundante. A radiação laser sem a presença de fotossensibilizador não causou nenhum dano comparável ao controle sem qualquer tratamento. Após 3 horas de incubação com hipericina, a irradiação a laser resultou em fluorescência causada pela monomerização da hipericina agregada com extenso dano à vasculatura.A análise histológica revelou que a MAC controle não tratada apresentou espessura relativamente uniforme. No entanto, o tratamento com TFD fez com que a MAC se tornasse mais fina e frágil. Acabamos de demonstrar como preparar o ensaio de codorna ex ovo CAM e como usá-lo.Embora mantendo as diretrizes, essa metodologia é fácil de dominar e pode provar resultados rápidos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

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Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Pesquisa do câncer

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