Name: quail chorioallantoic membrane - a tool for photodynamic diagnosis and therapy
Uploaded: 2022-04-28T12:30:00
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El trabajo fue apoyado por VEGA 2/0042/21 y APVV 20-0129. La contribución de V. Huntošová es el resultado de la implementación del proyecto: Comunidad científica abierta para la investigación interdisciplinaria moderna en medicina (Acrónimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 apoyado por el Programa Operativo Infraestructura Integrada, financiado por el FEDER.

La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. Todos los equipos y reactivos deben ser esterilizados en autoclave o esterilizados con etanol al 70% o luz UV.
1. Incubación de huevos
<ol><li>Almacene los huevos de codorniz fertilizados a 10-15 °C durante un máximo de 4-5 días antes de comenzar la incubación. Use solo huevos limpios y sin daños.</li>
	<li>Incubar los huevos en una incubadora de tiro forzado durante ~ 53-54 h. Ponga los huev...

<ol>
	<li>Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Grif&#64257;oen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+regrowth+following+photodynamic+therapy+in+the+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane.">Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane.</a> Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).</li><li>van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+photodynamic+effects+of+phthalocyanines+in+a+skin-fold+observation+chamber+model:+role+of+central+metal+ion+and+degree+of+sulfonation.">In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation.</a> Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+the+Japanese+quail.">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).</li><li>De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+microcirculation+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+during+normal+angiogenesis.">Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis.</a> Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).</li><li>Sandau, K., Kurz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+vascular+growth+processes:+a+stochastic+biophysical+approach+to+embryonic+angiogenesis.">Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis.</a> Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).</li><li>Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marm&#233;, D., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+pattern+of+capillary+endothelial+cells+in+chorioallantoic+membrane+development+indicates+local+growth+control,+which+is+counteracted+by+vascular+endothelial+growth+factor+application.">Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).</li><li>Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+quail+(Coturnix+japonica)+as+laboratory+animal+model.">Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model.</a> Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).</li><li>Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+chorioallantoic+membrane+(CAM)+as+an+in-vivo+model+for+photodynamic+therapy.">The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).</li><li>Mi&#353;kovsk&#253;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypericin+-+a+new+antiviral+and+antitumor+photosensitizer:+mechanism+of+action+and+interaction+with+biological+molecules.">Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules.</a> Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).</li><li>&#268;avarga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+effect+of+hypericin+after+topical+application+in+the+ex+ovo+quail+chorioallantoic+membrane+model.">Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model.</a> Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).</li><li>Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypericin+in+the+dark+inhibits+key+steps+of+angiogenesis+in+vitro.">Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro.</a> Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+excellent+chemical+stability+and+bioavailability+of+solvent+responsive+curcumin-loaded+2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)-+2-oxazoline+copolymer+nanoparticles+for+drug+delivery.">Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery.</a> Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).</li><li>Hunto&#353;ov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkyl+Chain+length+in+poly(2-oxazoline)-based+amphiphilic+gradient+copolymers+regulates+the+delivery+of+hydrophobic+molecules:+a+case+of+the+biodistribution+and+the+photodynamic+activity+of+the+photosensitizer+hypericin.">Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin.</a> Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).</li><li>Bur&#237;kov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypericin+fluorescence+kinetics+in+the+presence+of+low+density+lipoproteins:+study+on+quail+CAM+assay+for+topical+delivery.">Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery.</a> General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).</li><li>Lenkavska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benefits+of+hypericin+transport+and+delivery+by+low-+and+high-density+lipoproteins+to+cancer+cells:+From+in+vitro+to+ex+ovo.">Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).</li><li>R&#252;ck, A., B&#246;hmler, A., Steiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDT+with+TOOKAD+studied+in+the+chorioallantoic+membrane+of+fertilized+eggs.">PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).</li><li>Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+damage+to+chorioallantoic+membrane+blood+vessels+by+porphycene-induced+photodynamic+therapy.">In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).</li><li>Buzz&#225;, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+vascular+effect+of+Photodynamic+Therapy+in+chorioallantoic+membrane+using+different+photosensitizers.">Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).</li><li>Dougherty, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy.">Photodynamic therapy.</a> Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optoacoustic+monitoring+of+vascular+damage+during+photodynamic+therapy+treatment+of+tumor.">Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>M&#225;&#269;ajov&#225;, M., &#268;avarga, I., S&#253;korov&#225;, M., Valachovi&#269;, M., Novotn&#225;, V., Bil&#269;&#237;k, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+angiogenesis+by+topical+application+of+leptin+and+high+and+low+molecular+heparin+using+the+Japanese+quail+chorioallantoic+membrane+model.">Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).</li><li>Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ex+Ovo+chick+chorioallantoic+membrane+(CAM)+assay+to+evaluate+the+biocompatibility+and+angiogenic+response+to+biomaterials.">Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials.</a> ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).</li><li>Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+applications+of+the+egg:+chorioallantoic+membrane+assay+and+ex+vivo+organotypic+culture+of+materials+for+bone+tissue+engineering.">Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).</li><li>Merlos Rodrigo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+applicability+of+in+ovo+and+ex+ovo+chicken+chorioallantoic+membrane+assays+to+study+cytostatic+activity+in+neuroblastoma+cells.">Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).</li><li>Meta, M., Kundekov&#225;, B., Bil&#269;&#237;k, B., M&#225;&#269;ajov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+silicone+ring+application+on+CAM+vasculature+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).</li><li>Kohli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-screening+the+intrinsic+angiogenic+capacity+of+biomaterials+in+an+optimised+ex+ovo+chorioallantoic+membrane+model.">Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model.</a> Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).</li><li>Kundekov&#225;, B., M&#225;&#269;ajov&#225;, M., Meta, M., &#268;avarga, I., Bil&#269;&#237;k, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+membrane+models+of+various+avian+species+differences+and+applications.">Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications.</a> Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).</li><li>Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor-2+selectively+stimulates+angiogenesis+of+small+vessels+in+arterial+tree.">Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).</li><li>Buzz&#225;, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., G&#243;mez-Garc&#237;a, P. B., Kurachi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+a+tumor+model+in+the+chorioallantoic+membrane+used+for+the+evaluation+of+different+photosensitizers+for+photodynamic+therapy.">Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).</li></ol>

Para un cultivo ex ovo exitoso, es importante seguir el protocolo anterior. Además, si los huevos no se abren con suficiente cuidado o no hay humedad suficiente durante el cultivo, el saco vitelino se adhiere a la cáscara y, a menudo, se rompe. El inicio de un cultivo ex ovo en el momento de aproximadamente 60 h de incubación de huevos asegura la alta tasa de supervivencia de los embriones, ya que ya son lo suficientemente grandes como para sobrevivir a la manipulación. En las etapas posteriores del...

El modelo de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo es bien conocido y ampliamente utilizado en diversas áreas de investigación. Es un órgano extraembrionario ricamente vascularizado que proporciona intercambio gaseoso y transporte mineral1. Debido a la transparencia y accesibilidad de esta membrana, los vasos sanguíneos individuales y sus cambios estructurales se pueden observar en tiempo real2. A pesar de las ventajas, la CAM de los pollitos también tiene algunas limitaciones (por ejemplo, instalaciones de cría más grandes, producción de huevos y consumo de alimento) que podrían evitarse mediante el uso de otras especies de aves. En este protocolo, se describe un modelo alternativo ex ovo CAM utilizando embrión de codorniz japonesa (Coturnix japonica). Debido a su pequeño tamaño, permite el uso de un número mucho mayor de individuos experimentales que el pollo CAM. Además, el desarrollo embrionario más corto de 16 días de los embriones de codorniz es otra ventaja. Los primeros vasos más grandes en la CAM de codorniz aparecen en el día embrionario (DE) 7. Esto se puede comparar directamente con el desarrollo del embrión de pollo (etapas 4-35); Sin embargo, las etapas posteriores de desarrollo ya no son comparables y requieren menos tiempo para el embrión de codorniz3. De interés es la ocurrencia regular de ramificación microvascular similar a la de las CAM de pollo 4,5,6. La rápida maduración sexual, la alta producción de huevos y la reproducción de bajo costo son otros ejemplos que favorecen el uso de este modelo experimental7.
Un modelo CAM aviar se utiliza a menudo en estudios de terapia fotodinámica (TFD)8. La TFD se utiliza para tratar varias formas de cáncer (tumores pequeños localizados) y otras enfermedades no oncológicas. Su principio está en la administración de un fármaco fluorescente, un fotosensibilizador (PS), al tejido dañado y su activación con luz de la longitud de onda adecuada. Una PS prospectiva utilizada en la investigación es la hipericina, originalmente aislada de la planta medicinal hierba de San Juan (Hypericum perforatum)9. Los fuertes efectos fotosensibilizantes de este compuesto se basan en sus propiedades fotoquímicas y fotofísicas. Estos se caracterizan por múltiples picos de excitación de fluorescencia en el rango de 400-600 nm, que inducen la emisión de fluorescencia a aproximadamente 600 nm. Los máximos de absorción de hipericina dentro de la banda espectral están en el rango de 540-590 nm, y los máximos de fluorescencia están en el rango de 590-640 nm9. Para lograr estos efectos fotosensibilizantes, la hipericina es excitada por la luz láser a una longitud de onda de 405 nm después de la administración local10. En presencia de luz, la hipericina puede exhibir efectos virucidas, antiproliferativos y citotóxicos11, mientras que no hay toxicidad sistémica y es liberada rápidamente del organismo. La hipericina es una sustancia lipofílica que forma agregados no fluorescentes insolubles en agua, por lo que se utilizan varios tipos de nanoportadores, como las nanopartículas poliméricas 12,13 o las lipoproteínas de alta y baja densidad (HDL, LDL)14,15, para ayudar a su entrega y penetración en las células. Dado que CAM es un sistema naturalmente inmunodeficiente, las células tumorales se pueden implantar directamente en la superficie de la membrana. El modelo también es adecuado para registrar la extensión del daño vascular inducido por TFD de acuerdo con una puntuación definida16,17. La luz de menor intensidad en comparación con la TFD se puede utilizar para el diagnóstico fotodinámico (PDD). El monitoreo del tejido bajo la luz LED de excitación violeta también conduce a la fotoactivación de fotosensibilizadores18,19,20 que resulta en una emisión de luz fluorescente, pero no proporciona suficiente energía para iniciar una reacción PDT y dañar las células. Lo convierte en una buena herramienta para la visualización y diagnóstico de tumores o para el monitoreo de la farmacocinética de las PSs utilizadas14,15.
Este artículo describe la preparación del ensayo de codorniz ex ovo CAM con tasas de supervivencia superiores al 80%. Este cultivo ex ovo se aplicó con éxito en un gran número de experimentos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td>Transparent polystyrene, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator ESCO CCL-0508</td>
			<td>ESCO, Singapore</td>
			<td>CCL-050B-8</td>
			<td>CO2 cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryocut Leica CM 1800</td>
			<td>Reichert-Jung, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital camera Canon EOS 6D II</td>
			<td>Canon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diode laser 405 nm</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>dimethyl sulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15086-94-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine brush size 2</td>
			<td>Faber-Castell</td>
			<td>281802</td>
			<td>brush for CAM separation and manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>111-30-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>517-28-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hypericin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84082-80-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator Bios Midi</td>
			<td>Bios Sedl<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63422/63422eq01.jpg" style="margin: auto;" />any, Czech Republic</td>
			<td></td>
			<td>Forced draught incubator for initial incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator Memmert IF160</td>
			<td>Memmert, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Forced air circulation incubator for CAM incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser slimlite plano, LED light box</td>
			<td>Kaiser, Germany</td>
			<td>2453</td>
			<td>Transilluminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light 405 nm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>custom made circular LED light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8</td>
			<td>Canon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope Kapa 2000</td>
			<td>Kvant, Slovakia</td>
			<td></td>
			<td>optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome Auxilab 508</td>
			<td>Auxilab, Spain</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3683</td>
			<td>parafin medium for tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Phosphate saline buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors Castroviejo</td>
			<td>Orimed</td>
			<td>&#160;OR66-108</td>
			<td>micro scissors for CAM separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software ImageJ 1.53</td>
			<td>public domain</td>
			<td></td>
			<td>image processing and analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stock solution HDL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437641-10MG</td>
			<td>high density lipoproteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stock solution LDL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437644-10MG</td>
			<td>low density lipoproteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles</td>
		</tr>
	</tbody>
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quail chorioallantoic membrane - a tool for photodynamic diagnosis and therapy

La membrana corioalantoidea (CAM) de un embrión aviar es una membrana delgada y extraembrionaria que funciona como un órgano respiratorio primario. Sus propiedades lo convierten en un excelente modelo experimental in vivo para estudiar angiogénesis, crecimiento tumoral, sistemas de administración de fármacos o diagnóstico fotodinámico (PDD) y terapia fotodinámica (PDT). Al mismo tiempo, este modelo aborda el requisito de reemplazar animales de experimentación con una alternativa adecuada. El embrión cultivado ex ovo permite una fácil aplicación, acceso, monitoreo y documentación de sustancias. El más utilizado es el chick CAM; sin embargo, este artículo describe las ventajas de la CAM de codorniz japonesa como un modelo de bajo costo y alto rendimiento. Otra ventaja es el desarrollo embrionario más corto, que permite una mayor rotación experimental. Aquí se explora la idoneidad de la CAM de codorniz para PDD y PDT de cáncer e infecciones microbianas. Como ejemplo, se describe el uso del fotosensibilizador hipericina en combinación con lipoproteínas o nanopartículas como sistema de administración. Se determinó la puntuación de daño de las imágenes en luz blanca y los cambios en la intensidad de fluorescencia del tejido CAM bajo luz violeta (405 nm), junto con el análisis de las secciones histológicas. La CAM de codorniz mostró claramente el efecto de la TFD en la vasculatura y el tejido. Además, se pueden observar cambios como hemorragia capilar, trombosis, lisis de vasos pequeños y sangrado de vasos más grandes. La CAM de codorniz japonesa es un modelo in vivo prometedor para el diagnóstico fotodinámico y la investigación terapéutica, con aplicaciones en estudios de angiogénesis tumoral, así como terapia antivascular y antimicrobiana.

La localización del tumor en la superficie CAM es difícil con luz blanca. Se espera que el fotosensibilizador (aquí, hipericina) utilizado en el PDD sea absorbido selectivamente por el tumor y ayude a visualizar el tumor. La adición de hipericina y el uso de luz fluorescente (p. ej., 405 nm) mostraron muy bien la posición del tumor (carcinoma de células escamosas TE1) (Figura 6A). El análisis histológico mostró células tumorales vitales invadiendo tejidos sanos. Las estructuras con...

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Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

La membrana corioalantoidea (CAM) del embrión aviar es una herramienta muy útil y aplicable para diversas áreas de investigación. Un modelo especial ex ovo de codorniz japonesa CAM es adecuado para la investigación de tratamientos fotodinámicos.

Membrana corioalantoidea de codorniz: una herramienta para el diagnóstico fotodinámico y la terapia

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

Vamos a mostrarle cómo preparar el cultivo ex ovo de codorniz japonesa y cómo usar la membrana corioalantoica o CAM en resumen para el diagnóstico fotodinámico y la terapia del cáncer o las infecciones microbianas. Las ventajas de este método son el rápido crecimiento del desarrollo, el tamaño pequeño, el buen acceso al tejido y el fácil manejo. Además, respeta los principios de la regla 3R para realizar investigaciones con animales.Debido a su similitud estructural con las membranas mucosas como la vejiga, los pulmones o la placenta, es adecuado para pruebas in vivo de posibles fármacos, pruebas de toxicidad o estudios de trasplante. Demostrando el procedimiento estarán Barbora Kundekova y Majlinda Meta, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, use huevos de codorniz fertilizados, frescos o almacenados a 10 a 15 grados centígrados durante un máximo de 4 a 5 días antes del inicio de la incubación.Use solo huevos limpios y sin daños, luego incube los huevos en una incubadora de tiro forzado a 50 a 60% de humedad y 37.5 grados centígrados durante aproximadamente 54 horas colocadas horizontalmente con las rotaciones de huevos apagadas. Desinfecte la superficie del huevo con etanol al 70% sin rotar el huevo. Luego, en un gabinete de flujo laminar estéril mientras usa guantes, abra la cáscara del huevo con tijeras quirúrgicas estériles pequeñas y transfiera el contenido a una placa de cultivo de 6 pocillos.Después de cada huevo, desinfecte las tijeras con etanol al 70%. Agregue aproximadamente 5 mililitros de agua estéril a los huecos en la placa de 6 pocillos, ya que la humedad es esencial para evitar que la CAM se seque. A continuación, aspire embriones con la punta incorrecta u óvulos no fertilizados con un aspirador al vacío, luego coloque los embriones en una incubadora hasta nuevos experimentos mientras mantiene una temperatura de 37 grados centígrados en 80 a 90% de humedad.Cuando la CAM esté lo suficientemente desarrollada, generalmente desde el día embrionario 7, coloque un anillo de silicona esterilizado en la superficie de la CAM a lo largo de los capilares pequeños evitando los vasos sanguíneos principales. En condiciones estériles, aplique un volumen apropiado de solución de hipericina 30 microlitros al anillo de silicona y mantenga los embriones en una incubadora a 37 grados centígrados en 80 a 90% de humedad. Para realizar un diagnóstico fotodinámico, ilumine el CAM con luz de excitación violeta y registre la fluorescencia de la hipericina y el tejido CAM y las células tumorales con una cámara digital en diferentes intervalos de tiempo después de la administración de hipericina.Si la investigación requiere una imagen de la CAM en luz blanca, registre la CAM antes de la administración de hipericina y al final del experimento poco antes de la fijación del tejido, ya que la luz desencadena la fotoactivación de la hipericina. Para realizar la terapia fotodinámica después de la aplicación de hipericina, coloque la CAM debajo de la fibra óptica para que el rayo láser cubra toda el área dentro del anillo de silicona. Después de realizar la irradiación in vivo, en este caso particular con una luz láser de 405 nanómetros a una tasa de fluencia de 285 milivatios por centímetro cuadrado, grabar CAM utilizando luz blanca y / o luz fluorescente antes y después del tratamiento fotodinámico.Fije el tejido CAM en una placa de cultivo con paraformaldehído al 4% en PBS durante un mínimo de 2 horas y un máximo de durante la noche, luego retire el paraformaldehído y corte cuidadosamente del CAM una parte del tejido dentro del anillo de silicona. Todos estos pasos deben hacerse en una campana extractora. Lave la parte cortada del tejido CAM en agua durante 10 minutos y luego deshidrate en series ascendentes de alcohol colocando el tejido CAM en etanol al 70% durante 3 minutos, solución de eosina durante 2 minutos, throcin 96% etanol durante 5 minutos, 100% etanol durante 5 minutos y dos veces en xileno durante 10 minutos en una nueva placa de Petri.Posteriormente, transfiera las muestras lo más rápido posible a la parafina disuelta en placas de Petri utilizando una espátula o un cepillo fino. Después de 24 horas, coloque el tejido en un molde histológico, llénelo con un medio de incorporación de parafina y deje que se solidifique en el refrigerador, luego corte el CAM solidificado del medio de inserción, gírelo en la bandeja 90 grados, llénelo nuevamente con el medio de incrustación y deje que se solidifique. Preparar secciones de 5 a 10 micrómetros en un micrótomo para el análisis histopatológico para determinar el daño inducido por PDT.Para preparar las secciones CAM congeladas para la histología, monte cuidadosamente CAM nativa o fija con paraformaldehído al 4% en el portaobjetos de vidrio, llene el molde de incrustación a la mitad con OCT y congélelo en nitrógeno líquido o una mezcla de hielo seco y etanol. Después de la congelación, incline y deslice con cuidado la CAM desde el portaobjetos de vidrio hasta la parte superior del medio OCT congelado. Colocar de nuevo en el molde, cubrirlo con medio OCT y congelar como se describió anteriormente.Para el análisis de la vasculatura CAM, se necesitan muestras CAM completas. En el gabinete de flujo laminar, desbordar CAM con una solución de fijación precalentada de aldehído paraformado al 4% y glutaraldehído al 2% en PBS, luego retire la solución de fijación después de 48 horas. A continuación, separe cuidadosamente el CAM del embrión con microtijeras y un cepillo fino y lávelo en PBS, luego monte el CAM lavado en un portaobjetos de vidrio y déjelo secar lentamente.Después, fotografíe la diapositiva usando una cámara digital en un transiluminador como fuente de luz blanca homogénea. La ubicación del tumor en la superficie CAM se visualizó bajo luz blanca y luz fluorescente tras la adición de hipericina. El análisis histológico mostró estructuras concéntricas de células escamosas anormales que invaden los tejidos sanos acompañados de edema y engrosamiento de la membrana.Después del tratamiento con TFD, se observó una clara diferencia en la densidad de los vasos dentro del anillo y el área circundante. La radiación láser sin la presencia de fotosensibilizador no causó ningún daño comparable al control sin ningún tratamiento. Después de 3 horas de incubación con hipericina, la irradiación láser resultó en fluorescencia causada por la monomerización de la hipericina agregada con daño extenso a la vasculatura.El análisis histológico reveló que la CAM de control no tratada tenía un grosor relativamente uniforme. Sin embargo, el tratamiento con TFD hizo que la CAM se volviera más delgada y frágil. Acabamos de demostrar cómo preparar el ensayo de codorniz ex ovo CAM y cómo usarlo.Mientras se mantienen las pautas, esta metodología es fácil de dominar y puede obtener resultados rápidos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Contra el cáncer eficacia de la terapia fotodinámica con nanopartículas orientada por cáncer de pulmón

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

El Colon-26 Carcinoma portadores de tumores de ratón como modelo para el estudio del cáncer de caquexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

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Inducción y diagnóstico de tumores en<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epitelio

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

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Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

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Secado de la sangre y manchas de suero como una herramienta útil para el almacenamiento de la muestra a evaluar biomarcadores de cáncer

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Comparación de metastática célula sin fin renal Modelo establecido en el riñón del ratón y en la membrana chorioalantoica del pollo

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Uso de la membrana chorioalantoica de pollo en vivo modelo para estudiar cánceres ginecológicos y urológicos

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...