Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال منحة مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF-386/18) ومنحة مؤسسة العلوم الإسرائيلية ثنائية القومية (BSF-2019008) ، الممنوحة ل L.G.

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف
<ol><li>المخازن المؤقته<ol>
<li>- مزيج تسرب Leu aa: امزج 2 جم من كل من الأدينين والوراسيل والتريبتوفان والهيستيدين والليسين والميثيونين وخزن في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>وسط انتقائي للخميرة مع رافينوز (1 لتر): امزج 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة (مع كبريتات ا...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

في هذا العمل ، يتم تقديم بروتوكول لفحص حركية جزيء واحد مع kinesin-5 Cin8 ثنائي الاتجاه وتحليل الحركة. تم تنقية Cin818 كامل الطول بما في ذلك إشارة التوطين النووي الأصلية (NLS) في المحطة C من المضيف الأصلي S. cerevisiae. نظرا لأن Cin8 هو بروتين محرك نووي ، فقد وجد أن طحن خلايا S. cerevisiae تحت الن...

يتم توسط عدد كبير من أحداث الحركة داخل الخلايا حقيقية النواة من خلال وظيفة البروتينات الحركية الجزيئية. تتحرك هذه المحركات على طول خيوط الهيكل الخلوي ، وخيوط الأكتين ، والأنابيب الدقيقة (MTs) ، وتحول الطاقة الكيميائية للتحلل المائي ATP إلى قوى حركية وميكانيكية مطلوبة لدفع الحركة البيولوجية داخل الخلايا. S. cerevisiae Cin8 القائم على MT هو بروتين محرك كينيسين -5 ثنائي القطب ، متجانس ، يربط ويمرر MTs المغزل بعيداعن 1. يؤدي Cin8 وظائف أساسية أثناء الانقسام ، في تجميع المغزل2،3،4 واستطالة المغزل خلال الطور5،6،7. في السابق ، ثبت أن Cin8 هو محرك ثنائي الاتجاه ، يقوم بتبديل الاتجاه في ظل ظروف تجريبية مختلفة. على سبيل المثال ، في ظل ظروف القوة الأيونية العالية ، تتحرك محركات Cin8 المفردة نحو الطرف السفلي من MTs ، بينما في المجموعات ، في اختبارات MT المنزلقة متعددة المحركات ، وبين MTs المضادة للتوازي ، تتحرك محركات Cin8 بشكل أساسي نحو النهايات الإضافية ل MTs 8,9,10,11,12 . كانت هذه النتائج غير متوقعة للغاية لعدة أسباب. أولا ، يحمل Cin8 مجال محركه الحفاز عند المحطة الأمينية وكان يعتقد سابقا أن هذه المحركات موجهة حصريا بالإضافة إلى النهاية ، في حين تبين أن Cin8 موجهة إلى نهاية ناقصة على مستوى الجزيء الواحد. ثانيا، كان يعتقد أن محركات كينيسين أحادية الاتجاه، إما ناقصة النهاية أو زائدة التوجيه، في حين تبين أن Cin8 ثنائي الاتجاه، اعتمادا على الظروف التجريبية. أخيرا ، بسبب اتجاه MT في المغزل الانقسامي ، لا يمكن تفسير الدور الكلاسيكي لمحركات kinesin-5 في فصل أقطاب المغزل أثناء تجميع المغزل و anaphase B إلا من خلال حركتها الموجهة ذات النهاية الإضافية على MTs التي تتقاطع معها 1,13. بعد التقارير الأولى عن ثنائية الاتجاه ل Cin8 ، ثبت أن بعض محركات كينيسين الأخرى ثنائية الاتجاه14،15،16 ، مما يشير إلى أن الحركة ثنائية الاتجاه لمحركات كينيسين قد تكون أكثر شيوعا مما كان يعتقد سابقا.
وقد أفيد سابقا أنه في الخلايا ، يتحرك Cin8 أيضا بطريقة ثنائية الاتجاه8 ، مما يدعم فكرة أن الحركة ثنائية الاتجاه لبعض محركات kinesin-5 مهمة لوظائفها داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن محركات kinesin-5 الثلاثة التي تم الإبلاغ عنها على أنها ثنائية الاتجاه هي من خلايا فطرية ، فقد تم مؤخرا اقتراح دور محتمل لمحركات kinesin-5 ثنائية الاتجاه في هذه الخلايا10. وفقا لهذا النموذج ، في الانقسام المغلق للخلايا الفطرية ، حيث لا ينهار المغلف النووي أثناء الانقسام ، توفر محركات kinesin-5 القوة الأولية التي تفصل قطبي المغزل قبل تجميع المغزل. لأداء هذه المهمة ، قبل فصل قطب المغزل ، تتمركز محركات kinesin-5 بالقرب من أقطاب المغزل ، من خلال حركتها الموجهة ذات النهاية الناقصة على MTs نووية واحدة. بمجرد الوصول إلى هذا الموضع ، تتجمع محركات kinesin-5 ، وتحول الاتجاه ، وتلتقط ، وتتقاطع مع MTs من أقطاب المغزل المجاورة. في وقت لاحق ، توفر محركات kinesin-5 الفصل الأولي للأقطاب عن طريق الحركة الموجهة زائد النهاية على MTs التي تتقاطع معها. من خلال هذا النموذج، يلزم وجود حركية موجهة ناقصة النهاية على MTs مفردة وحركية موجهة زائد النهاية على MTs متقاطعة أثناء الانزلاق المضاد للتوازي لمحركات kinesin-5 الفطرية لأداء أدوارها في تجميع المغزل 1,13.
الهدف العام من الطريقة الموصوفة هو الحصول على كينيسين الفطرية عالية النقاء الموسومة ب GFP-5 Cin8 وإجراء اختبارات حركية جزيء واحد (الشكل 1) مع تحليل حركية الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 بشكل منفصل. الفصل بين الجزيئات المفردة والعناقيد مهم لأن أحد العوامل التي ثبت أنها تؤثر على اتجاه Cin8 هو تراكمه في مجموعات على MTs10,12. لا توفر مقايسات الحركة البديلة ، مثل انزلاق سطح MT ومقايسات انزلاق MT معلومات تتعلق بنشاط البروتينات ذات المحرك الواحد17,18. تم تطبيق طرق فحص وتحليل حركية الجزيء الواحد القوية الموصوفة هنا بنجاح لتوصيف جوانب مختلفة من محركات كينيسين-5 ، Cin8 و Kip1 10،11،12،14،19،20.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل للإفراط في التعبير والتنقية Cin8 ، وبلمرة MTs ، وفحص حركية الجزيء الواحد. وعلاوة على ذلك، فإن التحليلات الرامية إلى التمييز بين الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8، وتحديد السرعات الحركية والعنقودية المفردة عن طريق تحليل متوسط الإزاحة (MD) ومتوسط الإزاحة المربعة (MSD). يهدف هذا البروتوكول إلى مساعدة الباحثين على تصور جميع خطوات الإجراءات والمساعدة في استكشاف أخطاء هذا النوع من المقايسات وإصلاحها.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> الشكل 1: التمثيل التخطيطي لفحص حركية الجزيء الواحد. يتم توصيل MTs الفلورسنت البيوتينيل بالسطح الزجاجي ، المطلي ب Avidin الذي يتفاعل مع البيوتينيل BSA المرتبط بالسطح. يمثل السهم الأخضر اتجاه حركة جزيئات Cin8 المفردة في ظل ظروف القوة الأيونية العالية. +/- تمثل قطبية MT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

تؤدي محركات كينيسين -5 ثنائية القطب الانقسامية وظائف أساسية في ديناميكيات المغزل. تظهر هذه المحركات بنية متجانسة رباعية مع زوجين من مجالات المحركات الحفازة ، وتقع في طرفي نقيض من المجمع النشط. تمكن هذه البنية الفريدة محركات kinesin-5 من الربط والانزلاق بعيدا عن الأنابيب الدقيقة المغزل المضادة للتوازي (MTs) ، وبالتالي توفير القوة الموجهة ظاهريا التي تفصل بين قطبي المغزل عن بعضهما البعض. في السابق ، كان يعتقد أن محركات kinesin-5 موجهة حصريا بالإضافة إلى النهاية. ومع ذلك ، كشفت الدراسات الحديثة أن العديد من محركات كينيسين 5 الفطرية موجهة ناقص النهاية على مستوى الجزيء الواحد ويمكنها تغيير الاتجاه في ظل ظروف تجريبية مختلفة. يعد Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 مثالا على هذا البروتين الحركي ثنائي الاتجاه: في ظروف القوة الأيونية العالية ، تتحرك جزيئات واحدة من Cin8 في اتجاه نهاية MTs ناقص. وتبين أيضا أن Cin8 تشكل مجموعات متحركة، في الغالب في الطرف الناقص من MTs، ويسمح هذا التجمع ل Cin8 بتبديل الاتجاه والخضوع لحركية بطيئة زائدة موجهة. توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لجميع خطوات العمل مع kinesin-5 Cin8 الموسوم ب GFP ، من الإفراط في التعبير عن البروتين في خلايا S. cerevisiae وتنقيته إلى فحص حركية جزيء واحد في المختبر . تساعد الطريقة المطورة حديثا الموصوفة هنا على التمييز بين الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 ، بناء على شدة التألق. تتيح هذه الطريقة تحليلا منفصلا لحركية الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 ، مما يوفر توصيف اعتماد حركية Cin8 على حجم عنقودها.

تهدف التجربة إلى التحقيق في خصائص الحركة لبروتين المحرك ثنائي الاتجاه Cin8 بأحجام عنقودية مختلفة على MTs مفردة. الحركة التمثيلية ل Cin8-GFP واضحة أيضا من الكيموغراف في الشكل 5A ، حيث يتم عرض الموقع المكاني للمحرك بمرور الوقت.
لتحليل الخصائص المتحركة ل Cin8-GFP ، أولا ، ?...

Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

يتراكم الكينيسين-5 Cin8 الانقسامي ثنائي الاتجاه في مجموعات تنقسم وتندمج أثناء حركتها. التراكم في مجموعات يغير أيضا سرعة واتجاه Cin8. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاختبارات الحركة مع Cin8-GFP المنقى وتحليل الخصائص المتحركة للجزيئات المفردة ومجموعات Cin8.

حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 هو بروتين حركي ثنائي الاتجاه. يتحرك Cin8 في اتجاه نهاية ناقص الأنابيب الدقيقة كجزيء واحد ، ويغير الاتجاه في ظل عدد من الظروف التجريبية المختلفة. الهدف العام من بحثنا هو فهم آلية الحركة ثنائية الاتجاه من خلال دراسة العوامل والعناصر الهيكلية التي تنظم الحركة ثنائية الاتجاه ل Cin8.يشرح هذا البروتوكول بشكل شامل تنقية Cin8 كامل الطول من نوع GFP في خلايا الخميرة ، وفحص حركية الجزيء الواحد ، والتحليل اللاحق للخصائص المتحركة للجزيئات المفردة ومجموعات Cin8. هذا الفصل مهم ، لأن اتجاه Cin8 يتأثر بتراكمه في مجموعات على الأنابيب الدقيقة. يمكن تكييف هذه التقنية بسهولة لتنقية البروتينات النووية الأخرى من الخميرة.بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيقه على أي جسيمات فلورسنت تحتاج إلى فصلها إلى مجموعات حجم بناء على شدة التألق. ستوضح الإجراء الدكتورة ماري بوبوف ، مديرة مختبرنا ، والدكتورة ألينا غولدشتاين ليفيتين ، والدكتورة نوريت سيغلر ، زميلات ما بعد الدكتوراه. تاتيانا زفاجيلسكي ، مايان سادان ، وشيرا هيرشفينكل ، طلاب الدراسات العليا ؛ ونيتا يانير ، ياهيل أبراهام ، روي أفراهام ، وميتال هابرمان ، طلاب البكالوريوس من مختبرنا. للبدء ، تنمو خلايا Saccharomyces cerevisiae التي تحتوي على البلازميد للإفراط في التعبير عن Cin8-GFP-6His إلى مرحلة النمو الأسي في لتر واحد من الوسط الانتقائي للخميرة ، مع استكمال 2٪ raffinose عند 28 درجة مئوية.ثم حث Cin8-GFP-6His على التعبير الزائد عن طريق إضافة 2٪ من الجالاكتوز ، ومراقبة نمو زراعة الخميرة عن طريق قياس الامتصاص عند 600 نانومتر. بعد خمس ساعات من إضافة الجالاكتوز ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا في مخزن التحلل العازل ، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل.بعد ذلك ، باستخدام هاون ومدقة مبردة ، قم بطحن الخلايا المجمدة في النيتروجين السائل. استمر في إضافة النيتروجين السائل أثناء الطحن ، بحيث تظل المستخلصات مجمدة. راقب تحلل الخلايا تحت مجهر تباين التداخل التفاضلي أو الطور التفاضلي.ثم إذابة الخلايا الأرضية ، والطرد المركزي لهم. قم بتحميل المادة الفائقة على عمود تدفق الجاذبية المملوء بملليلترين من النيكل NTA ، وقم بموازنته مسبقا باستخدام مخزن مؤقت للتحليل. دع السوبرناتانت يتدفق عبر العمود.اغسل العمود بخمسة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للتحلل ، متبوعا بخمسة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للتحلل مع إيميدازول 25 ملليمولار. ثم قم بإلغاء Cin8-GFP-6His مع المخزن المؤقت للاستخراج. قم بتحليل العينات التي تم التخلص منها عن طريق تجزئة SDS-PAGE ، متبوعة بتلطيخ Coomassie الأزرق وتحليل اللطخة الغربية التي تم فحصها باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل GFP.بعد تجميع الكسور التي تحتوي على Cin8-GFP-6His، قم بتنقيتها بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم بمعدل تدفق قدره 0.5 ملليلتر في الدقيقة، وحد ضغط عمود يبلغ 1.5 ميغاباسكال. في وقت واحد مراقبة الامتصاص عند 280 نانومتر. جمع الكسور المقابلة ل Cin8-GFP tetramer وتحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي.ثم قم باقتباس الكسور المحددة ، ثم قم بتجميدها ، وتخزينها حتى الاستخدام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لبلمرة وتثبيت البيوتين والرودامين المسمى microtubules ، امزج مكونات التفاعل في أنبوب 1.5 ملليلتر ، واحتضن الخليط لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. ثم أضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت العام للتوبولين الدافئ ، واخلطه بعناية ، وأجهزة الطرد المركزي.تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات بعناية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت العام للتوبولين الدافئ. ثم قم بتخزين التعليق عند 28 أو 37 درجة مئوية. افحص الأنابيب الدقيقة باستخدام مجهر التألق ، باستخدام قناة الرودامين 647 نانومتر.بعد ذلك ، قم بإزالة الورق الواقي من شرائط الشريط ووضع غطاء مائل على الشرائط لإنشاء ثلاث غرف تدفق بحجم 10 ميكرولتر. ثم قم بإجراء طلاء avidin للغطاء عن طريق الإضافة المتسلسلة للكواشف المشار إليها. احتضن الغطاء لمدة ثلاث إلى خمس دقائق قبل غسله ب 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت العام للتوبولين.بعد ذلك ، قم بتوصيل الأنابيب الدقيقة البيوتينيل بأغطية b-BSA / avidin-المغلفة عن طريق إدخال 20 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة في غرفة التدفق. احتضن الشرائح مع توجيه الغطاء لأسفل في غرفة الرطوبة المظلمة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الشرائح ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت العام للتوبولين.بعد ذلك ، ضع 30 ميكرولترا من مزيج تفاعل الحركة متبوعا بمحركات Cin8-GFP المخففة في 20 ميكرولتر من مزيج تفاعل الحركة في غرفة التدفق ، وانتقل على الفور إلى تصوير حركة المحركات على طول الأنابيب الدقيقة. لتصوير الحركة الحركية ، ضع قطرة من زيت الغمر على هدف المجهر ، ثم ضع غرفة التدفق على مرحلة المجهر الفلورسنت ، مع مواجهة الغطاء للهدف. قم بتشغيل قناة الرودامين للتركيز على الأنابيب الدقيقة المتصلة بسطح الغطاء.بعد ذلك ، باستخدام برنامج ImageJ Micro-Manager ، احصل على الصورة بتعريض ضوئي يبلغ 20 مللي ثانية. بعد ذلك ، قم بتشغيل قناة GFP واحصل على 90 صورة بفاصل زمني مع فاصل زمني مدته ثانية واحدة وتعرض ضوئي يبلغ 800 مللي ثانية. في برنامج ImageJ Fiji ، افتح فيلم الفاصل الزمني وصورة حقل microtubule المقابلة.قم بمزامنة هاتين النافذتين عن طريق اختيار تحليل، متبوعا بالأدوات ومزامنة Windows. للحصول على كيموجراف، قم بتمييز أنبوب دقيق واحد باستخدام خيار الخط المجزأ. ثم، من تحليل، حدد علامة التبويب متعدد Kymograph.لتحديد حجم الكتلة لجزيئات Cin8-GFP ، قم بإجراء طرح الخلفية وتصحيحها للإضاءة غير المتساوية بالنقر فوق عملية ، متبوعة بطرح الخلفية. اضبط نصف قطر الكرة المتدحرجة على 100 بكسل، وتحقق من خيار القطع المكافئ المنزلق. ثم تتبع محرك Cin8-GFP محدد غير متحرك باستخدام المكون الإضافي TrackMate لبرنامج ImageJ Fiji.اختر المكونات الإضافية ، متبوعة بالتتبع ، و TrackMate ، وكاشف LoG ، وتعقب LAP البسيط لمتابعة متوسط كثافة التألق لمحرك Cin8-GFP كدالة للوقت داخل دائرة نصف قطرها أربعة بكسل. بعد تكرار الإجراء لمحركات Cin8-GFP المختلفة ، ارسم كثافة التألق كدالة للوقت. بعد ذلك ، لتتبع حركة جزيئات Cin8-GFP على طول مسارات microtubule ، قم بقص الأنابيب الدقيقة المراد تحليلها في تسلسل الفاصل الزمني للإطارات المسجلة عن طريق تمييزها باستخدام أداة المستطيل والنقر فوق صورة ، متبوعة ب Crop.اختر جسيم Cin8-GFP الفلورسنت للتحليل. سجل إحداثيات الجسيمات في كل إطار من تسلسل الفاصل الزمني باستخدام أداة النقطة وخيارات القياس. وبالمثل ، سجل إحداثيات جزيئات الفلورسنت الأخرى في تسلسل الفاصل الزمني.ثم قم بتعيين حجم الكتلة لجميع جزيئات Cin8-GFP التي تم فحصها في الإطار الأول من ظهورها ، كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، باستخدام الصيغة المشار إليها وإحداثيات حركة Cin8-GFP المحددة ، احسب إزاحة Cin8-GFP في كل نقطة زمنية فيما يتعلق بالإحداثيات الأولية. من قيم الإزاحة هذه، احسب الإزاحة لجميع الفواصل الزمنية الممكنة لجسيم Cin8-GFP محدد.كرر الإجراء لجميع جسيمات Cin8-GFP التي تم فحصها. وأخيرا، ارسم متوسط الإزاحة لجميع جسيمات Cin8-GFP التي تم فحصها مقابل الفاصل الزمني، وقم بإخضاعها لتناسب خطي. يمثل ميل هذا التناسب متوسط سرعة جسيمات Cin8-GFP المتحركة.تظهر هنا الخصائص الحركية لبروتين المحرك ثنائي الاتجاه Cin8 بأحجام عنقودية مختلفة على الأنابيب الدقيقة المفردة. لكل فئة من فئات حجم المجموعة ، تم استخراج أكثر من 40 مسارا من Cin8-GFP الفردي من التسجيلات. أظهر رسم متوسط إزاحات الجزيئات المفردة ومجموعات محركات Cin8 كدالة للفاصل الزمني أن جزيئات Cin8-GFP المفردة تتحرك بطريقة أحادية الاتجاه ناقص النهاية موجهة بسرعة عالية.في المقابل، تظهر مجموعات Cin8 سرعة أقل وحركية أعلى ثنائية الاتجاه. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، يجب استخدام بروتين المحرك عالي النقاء لتجنب أي تلوث يمكن أن يؤثر على التجمع الحركي. عند تحليل شدة التألق الحركي ، من المهم فحص المحركات في الإطار الأول الذي تظهر فيه ، لتجنب تأثير التبييض الضوئي.عند دراسة حركية المحركات ثنائية الاتجاه ، من المهم للغاية تحليل الجزيئات والعناقيد الفردية بشكل منفصل ، لأن التجمع الحركي هو أحد العوامل الرئيسية التي تؤثر على الاتجاه الحركي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

الجمع بين علم البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية نموذج المناطق غير منظم من Nsa1 من سيريفيسيا س.

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

فحص الطيفي لمثبطات محتملة من الجلوتاثيون السيتوسولي S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

حيود الإلكترون الجهورالوفولفي للجزيئات الصغيرة

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...