Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Denne forskning blev delvist støttet af Israel Science Foundation-bevillingen (ISF-386/18) og Israel Binational Science Foundation-bevillingen (BSF-2019008), der blev tildelt L.G.

1. Fremstilling af buffere og reagenser
<ol><li>Buffere<ol>
<li>-Leu aa dropout mix: Bland 2 g hver af Adenin, Uracil, Tryptophan, Histidin, Lysin og Methionin og opbevar ved stuetemperatur.</li>
		<li>Gærselektivt medium med raffinose (1 l): Bland 6,7 g gærkvælstofbase (med ammoniumsulfat), 2 g -Leu aa-dropoutblanding og 20 g raffinose i dobbeltdestilleret vand under omrøring (uden opvarmning), indtil det er helt opløst. Brug et 0,22 μm filter til at filtrere opløsningen i en steril flaske.</li...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

I dette arbejde præsenteres en protokol for enkeltmolekylemotilitetsassay med den tovejs kinesin-5 Cin8 og motilitetsanalysen. Cin818 i fuld længde inklusive det oprindelige nukleare lokaliseringssignal (NLS) ved C-terminalen er blevet renset fra den indfødte vært S. cerevisiae. Da Cin8 er et nukleart motorprotein, viser slibning af S. cerevisiae-cellerne under flydende nitrogen sig at være den mest effektive metode til cellelyse. Efter lysis opnås der ved at kombinere meta...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63425">Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells</a>. The Authors section was updated.
One of the author names was updated from:
Roy Abraham
to:
Roy Avraham

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63425">Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Et stort antal motilitetshændelser i eukaryote celler medieres af funktionen af molekylære motoriske proteiner. Disse motorer bevæger sig langs cytoskeletale filamenter, actinfilamenter og mikrotubuli (MT'er) og omdanner den kemiske energi af ATP-hydrolyse til kinetiske og mekaniske kræfter, der kræves for at drive biologisk bevægelighed i celler. Den MT-baserede S. cerevisiae Cin8 er et bipolært, homotetramert kinesin-5 motorprotein, der tværbinder og glider spindel-MT'er fra hinanden1. Cin8 udfører væsentlige funktioner under mitose, i spindelsamling 2,3,4 og spindelforlængelse under anafase 5,6,7. Tidligere var det blevet påvist, at Cin8 er en tovejsmotor, der skifter retningsbestemthed under forskellige eksperimentelle forhold. For eksempel bevæger enkelte Cin8-motorer sig under forhold med høj ionstyrke mod minus-enden af MT'erne, mens Cin8-motorer i klynger, i multimotoriske MT-glideassays og mellem antiparallelle MT'er hovedsageligt bevæger sig mod plus-enderne af MT'erne 8,9,10,11,12 . Disse resultater var meget uventede på grund af flere grunde. For det første bærer Cin8 sit katalytiske motoriske domæne ved amino-terminus, og sådanne motorer blev tidligere antaget at være udelukkende plus-end rettet, mens Cin8 viste sig at være minus-end rettet mod enkeltmolekyleniveauet. For det andet blev kinesinmotorer antaget at være ensrettede, enten minus-end eller plus-end rettet, mens Cin8 viste sig at være tovejs, afhængigt af de eksperimentelle forhold. Endelig, på grund af MT-orienteringen ved den mitotiske spindel, kunne kinesin-5-motorernes klassiske rolle i adskillelsen af spindelpoler under spindelsamling og anafase B kun forklares ved deres plus-end-rettede bevægelighed på MT'erne, de krydsbinder 1,13. Efter de første rapporter om tovejsvirkningen af Cin8 blev et par andre kinesinmotorer påvist at være tovejs 14,15,16, hvilket indikerer, at kinesinmotorers tovejsmotilitet kan være mere almindelig end tidligere antaget.
Det er tidligere blevet rapporteret, at Cin8 i celler også bevæger sig på en tovejs måde8, hvilket understøtter forestillingen om, at den tovejsmotilitet af nogle kinesin-5-motorer er vigtig for deres intracellulære funktioner. Da de tre kinesin-5-motorer, der blev rapporteret at være tovejsmotorer, er fra svampeceller, er der desuden for nylig blevet foreslået en mulig rolle for tovejsvirkningen af kinesin-5-motorer i sådanne celler10. Ifølge denne model, i lukket mitose af svampeceller, hvor den nukleare kuvert ikke nedbrydes under mitose, giver kinesin-5-motorer den indledende kraft, der adskiller spindelpolerne fra hinanden før spindelsamling. For at udføre denne opgave, før spindelpolseparation, lokaliserer kinesin-5-motorer nær spindelpolerne ved deres minus-ende rettet bevægelighed på enkelte nukleare MT'er. En gang i denne position klynger kinesin-5-motorer, skifter retningsbestemthed, fanger og tværbinder MT'er fra nabospindelpoler. Derefter tilvejebringer kinesin-5-motorer den indledende adskillelse af polerne ved plus-end rettet bevægelighed på MT'erne, de tværbinder. Ved denne model kræves både minus-end rettet bevægelighed på enkelte MT'er og plus-end rettet bevægelighed på tværbundne MT'er under antiparallel glidning for svampekinesin-5-motorer til at udføre deres roller i spindelsamling 1,13.
Det overordnede mål med den beskrevne metode er at opnå svampe-GFP-mærket kinesin-5 Cin8 med høj renhed og at udføre enkeltmolekylemotilitetsassays (figur 1), mens man separat analyserer bevægeligheden for enkeltmolekyler og klynger af Cin8. Adskillelsen mellem enkeltmolekyler og klynger er vigtig, da en af de faktorer, der havde vist sig at påvirke retningen af Cin8, er dens ophobning i klynger på MT'erne10,12. Alternative motilitetsassays, såsom MT-overfladeglidning og MT-glideassays, giver ikke oplysninger om aktiviteten af enkeltmotoriske proteiner17,18. De robuste enkeltmolekylemotilitetsanalyse- og analysemetoder, der er beskrevet her, er blevet anvendt med succes til at karakterisere forskellige aspekter af kinesin-5-motorer, Cin8 og Kip1 10,11,12,14,19,20.
Her præsenteres en detaljeret protokol for Cin8-overekspression og oprensning, polymerisation af MT'er og enkeltmolekylemotilitetsassayet. Desuden beskrives analyserne til at skelne mellem enkeltmolekyler og klynger af Cin8 og til bestemmelse af enkeltmotor- og klyngehastigheder ved middelforskydning (MD) og gennemsnitlig kvadratforskydning (MSD) analyse. Denne protokol har til formål at hjælpe forskere med at visualisere alle trin i procedurerne og hjælpe med fejlfinding af denne type assays.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> Figur 1: Skematisk repræsentation af enkeltmolekylemotilitetsassayet. Biotinylerede fluorescerende MT'er er fastgjort til glasoverfladen, belagt med Avidin, der interagerer med den overfladebundne biotinylerede-BSA. Den grønne pil repræsenterer bevægelsesretningen for enkelte Cin8-molekyler under forhold med høj ionstyrke. +/- repræsenterer polariteten af MT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

De mitotiske bipolære kinesin-5 motorer udfører væsentlige funktioner i spindeldynamikken. Disse motorer udviser en homo-tetramere struktur med to par katalytiske motordomæner, der ligger i modsatte ender af det aktive kompleks. Denne unikke arkitektur gør det muligt for kinesin-5-motorer at tværbinde og glide fra hinanden antiparallelle spindelmikrotubuli (MT'er), hvilket giver den udadrettede kraft, der adskiller spindelpolerne fra hinanden. Tidligere blev kinesin-5 motorer antaget at være udelukkende plus-end rettet. Nylige undersøgelser afslørede imidlertid, at flere svampekinesin-5-motorer er minus-ende rettet mod enkeltmolekyleniveauet og kan skifte retningsbestemthed under forskellige eksperimentelle forhold. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 er et eksempel på et sådant tovejs motorisk protein: Under betingelser med høj ionstyrke bevæger enkelte molekyler af Cin8 sig i minus-end retning af MT'erne. Det blev også vist, at Cin8 danner bevægelige klynger, overvejende i minus-enden af MT'erne, og en sådan klyngedannelse gør det muligt for Cin8 at skifte retningsbestemthed og gennemgå langsom, plus-end rettet bevægelighed. Denne artikel indeholder en detaljeret protokol for alle trin i arbejdet med GFP-mærket kinesin-5 Cin8, fra proteinoverekspression i S. cerevisiae-celler og dets oprensning til in vitro-enkeltmolekylemotilitetsassay . En nyudviklet metode beskrevet her hjælper med at skelne mellem enkeltmolekyler og klynger af Cin8 baseret på deres fluorescensintensitet. Denne metode muliggør separat analyse af bevægeligheden af enkeltmolekyler og klynger af Cin8, hvilket giver karakteriseringen af cin8-motilitetens afhængighed af dens klyngestørrelse.

Eksperimentet har til formål at undersøge motilitetsegenskaberne ved tovejsmotorisk protein Cin8 i forskellige klyngestørrelser på enkelte MT'er. Repræsentativ bevægelighed for Cin8-GFP fremgår også af kymograferne i figur 5A, hvor motorens rumlige position over tid er vist.
Til analyse af Cin8-GFP's bevægelige egenskaber tildeles først klyngestørrelsen (trin 4.3) til hver MT-vedhæftet bevægelig Cin8-GFP-partikel, og derefter spores positionen af de u...

Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Den tovejs mitotiske kinesin-5 Cin8 akkumuleres i klynger, der splittes og fusionerer under deres bevægelighed. Akkumulering i klynger ændrer også Cin8's hastighed og retningsvirkning. Her beskrives en protokol for motilitetsassays med oprenset Cin8-GFP og analyse af bevægelige egenskaber af enkeltmolekyler og klynger af Cin8.

Motilitet af enkeltmolekyler og klynger af tovejs kinesin-5 Cin8 renset fra S. cerevisiae-celler

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 er et tovejs motorprotein. Cin8 bevæger sig i minus-end-retningen af mikrotubuli som et enkelt molekyle og ændrer retningsbestemthed under en række forskellige eksperimentelle betingelser. Det overordnede mål med vores forskning er at forstå mekanismen for tovejsmotilitet ved at studere faktorer og strukturelle elementer, der regulerer cin8's tovejsmotilitet.Denne protokol forklarer omfattende oprensningen af GFP-type Cin8 i fuld længde overudtrykt i gærceller, enkeltmolekylemotilitetsassayet og den efterfølgende analyse af bevægelige egenskaber af enkeltmolekyler og klynger af Cin8. Denne adskillelse er vigtig, da retningen af Cin8 påvirkes af dens ophobning i klynger på mikrotubuli. Denne teknik kan let tilpasses til at rense andre nukleare proteiner fra gæren.Derudover kan det påføres alle fluorescerende partikler, der skal adskilles i størrelsesgrupper baseret på deres fluorescensintensitet. Demonstration af proceduren vil være Dr.Mary Popov, vores laboratoriechef, Dr. Alina Goldstein-Levitin, og Dr. Nurit Siegler, postdoktorale stipendiater; Tatiana Zvagelsky, Maya Sadan og Shira Hershfinkel, kandidatstuderende; og Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham og Meital Haberman, bachelorstuderende fra vores laboratorium. Til at begynde med vokse Saccharomyces cerevisiae celler indeholdende plasmidet til overekspression af Cin8-GFP-6Hans til den eksponentielle vækstfase i en liter gærselektivt medium, suppleret med 2% raffinose ved 28 grader Celsius.Derefter induceres Cin8-GFP-6Hans overekspression ved at tilsætte 2% galactose og overvåge gærkulturvæksten ved at måle absorbans ved 600 nanometer. Fem timer efter galactosetilsætning høstes cellerne ved centrifugering. Ophæng cellerne igen i lysisbuffer, og frys dem i flydende nitrogen.Brug derefter en kølet mørtel og støder til at male de frosne celler i flydende nitrogen. Fortsæt med at tilsætte flydende nitrogen under slibningen, så ekstrakterne forbliver frosne. Overvåg cellelysen under et fase- eller differentiel interferenskontrastmikroskop.Optø derefter jordcellerne og centrifuger dem. Læg supernatanten på en tyngdekraftsstrømningskolonne fyldt med to milliliter nikkel-NTA, og forkalibrer den med lysisbuffer. Lad supernatanten strømme ud gennem søjlen.Kolonnen vaskes med fem kolonnevolumener lysisbuffer efterfulgt af fem kolonnevolumener lysisbuffer suppleret med 25 millimolær imidazol. Eluer derefter Cin8-GFP-6Hans med elueringsbuffer. Analyser de eluerede prøver ved SDS-PAGE fraktionering, efterfulgt af Coomassie blå farvning og Western blot analyse undersøgt med anti-GFP antistof.Efter pooling af fraktionerne indeholdende Cin8-GFP-6His, skal du rense dem ved størrelsesudelukkelseskromatografi med en strømningshastighed på 0,5 ml pr. Minut og en søjletrykgrænse på 1,5 megapascal. Overvåg samtidig absorbansen ved 280 nanometer. Saml fraktionerne svarende til Cin8-GFP-tetrameren og analyser dem ved SDS-PAGE og Western blotting.Aliquot derefter de valgte fraktioner, snap-freeze, og opbevar indtil brug ved minus 80 grader Celsius. For at polymerisere og stabilisere biotin og rhodamin mærket mikrotubuli, bland reaktionskomponenterne i et 1,5 ml rør og inkubere blandingen i en time ved 37 grader Celsius. Tilsæt derefter 80 mikroliter varm generel tubulinbuffer, bland forsigtigt og centrifuge.Kassér supernatanten, og ophæng pillen forsigtigt igen ved at pipettere op og ned med 50 mikroliter varm generel tubulinbuffer. Opbevar derefter suspensionen ved 28 eller 37 grader Celsius. Undersøg mikrotubuli med et fluorescensmikroskop ved hjælp af 647-nanometer rhodaminkanalen.Fjern derefter beskyttelsespapiret fra båndstrimlerne og læg et silaniseret dækslip på strimlerne for at skabe tre 10-mikroliter volumenflowkamre. Udfør derefter avidinbelægningen af dækslen ved sekventiel tilsætning af de angivne reagenser. Inkuber dæksedlen i tre til fem minutter, før du vasker den med 80 mikroliter generel tubulinbuffer.Fastgør derefter de biotinylerede mikrotubuli til b-BSA / avidinbelagte dæksedler ved at indsætte 20 mikroliter mikrotubuli i flowkammeret. Inkuber lysbillederne med dæksedlen nedad i et mørkt fugtighedskammer i fem minutter ved stuetemperatur. Vask derefter diasene med 200 mikroliter generel tubulinbuffer.Påfør derefter 30 mikroliter motilitetsreaktionsblanding efterfulgt af Cin8-GFP-motorer fortyndet i 20 mikroliter af motilitetsreaktionsblandingen i flowkammeret, og fortsæt straks med at afbilde motorernes bevægelse langs mikrotubuli. Til motormotilitetsbilleddannelse skal du placere en dråbe nedsænkningsolie på mikroskopmålet og derefter placere strømningskammeret på det fluorescerende mikroskoptrin med dæksedlen vendt mod målet. Tænd rhodaminkanalen for at fokusere på mikrotubuli, der er fastgjort til dæksflipoverfladen.Derefter skal du ved hjælp af ImageJ Micro-Manager-software erhverve billedet med en eksponering på 20 millisekunder. Tænd derefter GFP-kanalen, og hent 90 timelapse-billeder med et interval på et sekund og en eksponering på 800 millisekunder. I ImageJ Fiji-softwaren skal du åbne time-lapse-filmen og det tilsvarende mikrotubulifeltbillede.Synkroniser disse to vinduer ved at vælge Analysér efterfulgt af Værktøjer og Synkroniser Windows. For at få en kymograf skal du fremhæve en mikrotubuli ved hjælp af indstillingen Segmenteret linje. Vælg derefter fanen Multi Kymograph fra Analysér.For at bestemme klyngestørrelsen af Cin8-GFP-molekylerne skal du udføre baggrundssubtraktionen og korrektionen for ujævn belysning ved at klikke på Proces efterfulgt af Træk baggrund. Indstil rullekugleradius til 100 pixels, og kontroller indstillingen Glidende paraboloid. Spor derefter en bestemt ikke-bevægelig Cin8-GFP-motor ved hjælp af TrackMate-pluginet i ImageJ Fiji-softwaren.Vælg Plugins efterfulgt af Tracking, TrackMate, LoG-detektor og Simple LAP-tracker for at følge den gennemsnitlige fluorescensintensitet for Cin8-GFP-motoren som en funktion af tiden inden for en cirkel på fire pixels radius. Efter at have gentaget proceduren for forskellige Cin8-GFP-motorer, plotter fluorescensintensiteterne som en funktion af tiden. For at spore motiliteten af Cin8-GFP-molekylerne langs mikrotubulisporene skal du derefter beskære mikrotubuli, der skal analyseres i time-lapse-sekvensen af optagede rammer ved at fremhæve det med rektangelværktøjet og klikke på Billede efterfulgt af Beskær.Vælg en fluorescerende Cin8-GFP-partikel til analysen. Registrer partikelkoordinaterne i hver ramme af timelapse-sekvensen ved hjælp af punktværktøjet og måleindstillingerne. Tilsvarende registreres koordinater for andre fluorescerende partikler i time-lapse-sekvensen.Tildel derefter klyngestørrelse til alle de undersøgte Cin8-GFP-partikler i den første ramme af deres udseende, som vist tidligere. Dernæst beregnes forskydningerne af Cin8-GFP ved hjælp af den angivne formel og de bestemte Cin8-GFP-bevægelseskoordinater på hvert tidspunkt i forhold til de oprindelige koordinater. Ud fra disse forskydningsværdier beregnes forskydningen for alle mulige tidsintervaller for en specificeret Cin8-GFP-partikel.Gentag proceduren for alle de undersøgte Cin8-GFP-partikler. Endelig plotter den gennemsnitlige forskydning af alle undersøgte Cin8-GFP-partikler versus tidsinterval og underkaster den en lineær pasform. Hældningen af denne pasform repræsenterer gennemsnitshastigheden af bevægelige Cin8-GFP-partikler.Motilitetsegenskaberne ved tovejs motorprotein Cin8 af forskellige klyngestørrelser på enkelte mikrotubuli er vist her. For hver klyngestørrelseskategori blev der udtrukket mere end 40 baner af individuel Cin8-GFP fra optagelserne. Afbildning af de gennemsnitlige forskydninger af enkeltmolekyler og klynger af Cin8-motorer som en funktion af tidsintervallet viste, at enkelte Cin8-GFP-molekyler bevæger sig på en ensrettet minus-ende-rettet måde med høj hastighed.I modsætning hertil udviser Cin8-klynger lavere hastighed og højere tovejsmotilitet. Under udførelsen af denne procedure skal motorprotein med høj renhed anvendes for at undgå forureninger, der kan påvirke motorklyngedannelsen. Ved analyse af motorens fluorescensintensitet er det vigtigt at undersøge motorerne i den første ramme, de vises, for at undgå effekten af fotoblege.Når man studerer motiliteten af tovejsmotorer, er det ekstremt vigtigt at analysere enkeltmolekyler og klynger separat, da motorklyngedannelse er en af de vigtigste faktorer, der påvirker motorisk retningsbestemthed.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode til isolering af stærkt Renset RNA fra Frø til brug i Kvantitative Transkriptomet Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle Flow strækker Assay gennemførelse for at studere Transport af molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombinere røntgenkrystallografi med lille vinkel X-Ray spredning til Model ustruktureret regioner af Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Spektrofotometrisk screening for potentielle hæmmere af cytosol glutathion S-transferaser

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Mikrokrystalelektrondiffraktion af små molekyler

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Vurdering af indsendeokondrial protein lokalisering i spirende gær saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...