Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Israel Science Foundation-beurs (ISF-386/18) en de Israel Binational Science Foundation-beurs (BSF-2019008), toegekend aan L.G.

1. Bereiding van buffers en reagentia
<ol><li>Buffers<ol>
<li>-Leu aa dropout mix: Meng 2 g elk van Adenine, Uracil, Tryptofaan, Histidine, Lysine en Methionine en bewaar bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Gistselectief medium met raffinose (1 L): Meng 6,7 g giststikstofbasis (met ammoniumsulfaat), 2 g -Leu aa dropout-mix en 20 g raffinose in dubbel gedestilleerd water door roeren (zonder verhitting) totdat het volledig is opgelost. Filtreer de oplossing met een filter van 0,22 μm in een steriele fles.<...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

In dit werk wordt een protocol voor single-molecule motiliteitstest met de bidirectionele kinesine-5 Cin8 en de motiliteitsanalyse gepresenteerd. De full-length Cin818 inclusief het native nuclear localization signal (NLS) op de C-terminal is gezuiverd van de native host S. cerevisiae. Omdat de Cin8 een nucleair motoreiwit is, blijkt het malen van de S. cerevisiae-cellen onder vloeibare stikstof de meest efficiënte methode voor cellysis te zijn. Na lysis, door metaalaffiniteit e...

Een groot aantal motiliteitsgebeurtenissen in eukaryote cellen worden gemedieerd door de functie van moleculaire motoreiwitten. Deze motoren bewegen langs de cytoskeletale filamenten, actinefilamenten en microtubuli (MT's) en zetten de chemische energie van ATP-hydrolyse om in kinetische en mechanische krachten die nodig zijn om de biologische beweeglijkheid in cellen te stimuleren. De op MT gebaseerde S. cerevisiae Cin8 is een bipolair, homotetrameer kinesine-5 motoreiwit dat spindel-MT's uit elkaar schuift1. Cin8 vervult essentiële functies tijdens mitose, in spindelassemblage 2,3,4 en spilverlenging tijdens anafase 5,6,7. Eerder was aangetoond dat Cin8 een bidirectionele motor is, die directionaliteit schakelt onder verschillende experimentele omstandigheden. Onder omstandigheden met een hoge ionische sterkte bewegen enkele Cin8-motoren bijvoorbeeld naar het min-uiteinde van de MT's, terwijl cin8-motoren in clusters, in meermotorige MT-glijtests en tussen antiparallel MT's voornamelijk naar de plus-uiteinden van de MT'sbewegen 8,9,10,11,12 . Deze bevindingen waren om verschillende redenen zeer onverwacht. Ten eerste draagt Cin8 zijn katalytische motorische domein op het amino-eindpunt en dergelijke motoren werden eerder verondersteld uitsluitend plus-end gericht te zijn, terwijl Cin8 werd aangetoond dat minus-end gericht was op het niveau van één molecuul. Ten tweede werd aangenomen dat kinesinemotoren unidirectioneel waren, hetzij minus-end of plus-end gericht, terwijl Cin8 bidirectioneel bleek te zijn, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Ten slotte kon, vanwege de MT-oriëntatie op de mitotische spil, de klassieke rol van kinesine-5-motoren in de scheiding van spindelpolen tijdens spindelassemblage en anafase B alleen worden verklaard door hun plus-end gerichte motiliteit op de MT's die ze1,13 crosslinken. Na de eerste rapporten over de bidirectionaliteit van Cin8, werd aangetoond dat een paar andere kinesinemotoren bidirectioneel 14,15,16 zijn, wat aangeeft dat de bidirectionele beweeglijkheid van kinesinemotoren vaker voorkomt dan eerder werd aangenomen.
Eerder is gemeld dat Cin8 in cellen ook op een bidirectionele manier beweegt8, wat het idee ondersteunt dat de bidirectionele beweeglijkheid van sommige kinesine-5-motoren belangrijk is voor hun intracellulaire functies. Bovendien, aangezien de drie kinesine-5-motoren waarvan werd gemeld dat ze bidirectioneel waren, afkomstig zijn van schimmelcellen, is onlangs een mogelijke rol voor de bidirectionaliteit van kinesine-5-motoren voorgesteld in dergelijke cellen10. Volgens dit model, bij gesloten mitose van schimmelcellen, waarbij de nucleaire enveloppe niet afbreekt tijdens mitose, leveren kinesine-5-motoren de initiële kracht die de spindelpolen uit elkaar scheidt voorafgaand aan de spindelassemblage. Om deze taak uit te voeren, voorafgaand aan de scheiding van de spindelpool, lokaliseren kinesine-5-motoren zich in de buurt van de spilpolen, door hun minus-end gerichte motiliteit op enkele nucleaire MT's. Eenmaal op deze positie clusteren kinesine-5-motoren, schakelen ze van directionaliteit, vangen en cross-link MT's van naburige spindelpolen. Vervolgens zorgen kinesine-5-motoren voor de initiële scheiding van de polen door plus-end gerichte motiliteit op de MT's die ze crosslinken. Volgens dit model zijn zowel minus-end gerichte motiliteit op enkele MT's als plus-end gerichte motiliteit op cross-linked MT's tijdens antiparallel glijden vereist voor schimmel kinesine-5 motoren om hun rol te vervullen in spindelassemblage 1,13.
Het algemene doel van de beschreven methode is het verkrijgen van zeer zuivere schimmel GFP-gelabelde kinesine-5 Cin8 en het uitvoeren van motiliteitstests met één molecuul (figuur 1) terwijl de beweeglijkheid van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 afzonderlijk wordt geanalyseerd. De scheiding tussen afzonderlijke moleculen en clusters is belangrijk omdat een van de factoren waarvan is aangetoond dat ze de directionaliteit van Cin8 beïnvloeden, de accumulatie in clusters op de MT's 10,12 is. Alternatieve beweeglijkheidstests, zoals de MT-oppervlakteglijdende en MT-glijdende assays, geven geen informatie over de activiteit van enkelvoudige motoreiwitten17,18. De robuuste motiliteits- en analysemethoden met één molecuul die hier worden beschreven, zijn met succes toegepast om verschillende aspecten van kinesine-5-motoren, Cin8 en Kip1 10,11,12,14,19,20 te karakteriseren.
Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor Cin8-overexpressie en -zuivering, polymerisatie van MT's en de motiliteitstest met één molecuul. Verder worden ook de analyses beschreven om onderscheid te maken tussen afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8, en om enkelvoudige motor- en clustersnelheden te bepalen door middel van gemiddelde verplaatsing (MD) en gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD). Dit protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen alle stappen van de procedures te visualiseren en te helpen bij het oplossen van problemen met dit soort testen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de motiliteitstest met één molecuul. Gebiotinyleerde fluorescerende MT's zijn bevestigd aan het glazen oppervlak, gecoat met Avidin dat interageert met het aan het oppervlak gehechte biotinylated-BSA. De groene pijl vertegenwoordigt de bewegingsrichting van enkele Cin8-moleculen onder omstandigheden met een hoge ionische sterkte. +/- de polariteit van het MT <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

De mitotische bipolaire kinesine-5 motoren vervullen essentiële functies in de spindeldynamica. Deze motoren vertonen een homo-tetramere structuur met twee paar katalytische motordomeinen, gelegen aan tegenovergestelde uiteinden van het actieve complex. Deze unieke architectuur stelt kinesine-5-motoren in staat om antiparallel spindelmicrotubuli (MT's) te kruisen en uit elkaar te schuiven, waardoor de naar buiten gerichte kracht wordt geleverd die de spindelpolen uit elkaar scheidt. Voorheen werd aangenomen dat kinesine-5-motoren uitsluitend plus-end gericht waren. Recente studies toonden echter aan dat verschillende schimmelkinesisine-5-motoren minus-end gericht zijn op het niveau van één molecuul en onder verschillende experimentele omstandigheden van directionaliteit kunnen veranderen. De Saccharomyces cerevisiae kinesine-5 Cin8 is een voorbeeld van een dergelijk bidirectioneel motoreiwit: in omstandigheden met hoge ionische sterkte bewegen enkele moleculen van Cin8 in de minus-eindrichting van de MT's. Er werd ook aangetoond dat Cin8 beweeglijke clusters vormt, voornamelijk aan het min-einde van de MT's, en een dergelijke clustering stelt Cin8 in staat om van directionaliteit te veranderen en langzame, plus-end gerichte motiliteit te ondergaan. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor alle stappen van het werken met GFP-gelabelde kinesine-5 Cin8, van eiwitoverexpressie in S. cerevisiae-cellen en de zuivering ervan tot in vitro motiliteitstest met één molecuul. Een nieuw ontwikkelde methode die hier wordt beschreven, helpt onderscheid te maken tussen afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8, op basis van hun fluorescentie-intensiteit. Deze methode maakt een afzonderlijke analyse van de beweeglijkheid van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van Cin8-motiliteit van de clustergrootte wordt gekarakteriseerd.

Het experiment heeft tot doel de beweeglijkheidskenmerken van bidirectioneel motoreiwit Cin8 van verschillende clustergroottes op enkele MT's te onderzoeken. Representatieve beweeglijkheid van Cin8-GFP blijkt ook uit de kymografen in figuur 5A, waar de ruimtelijke positie van de motor in de loop van de tijd wordt getoond.
Voor de analyse van de beweeglijke eigenschappen van Cin8-GFP wordt eerst de clustergrootte toegewezen (stap 4.3) aan elk MT-bevestigd beweeglij...

Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

De Saccharomyces cerevisiae kinesine-5 Cin8 is een bidirectioneel motoreiwit. Cin8 beweegt in de min-eindrichting van de microtubuli als een enkel molecuul en verandert de directionaliteit onder een aantal verschillende experimentele omstandigheden. Het algemene doel van ons onderzoek is om het mechanisme van bidirectionele motiliteit te begrijpen door factoren en structurele elementen te bestuderen die de bidirectionele beweeglijkheid van Cin8 reguleren.Dit protocol verklaart uitgebreid de zuivering van GFP-type full-length Cin8 overexpressie in gistcellen, de single-molecule motiliteitstest en de daaropvolgende analyse van beweeglijke eigenschappen van enkele moleculen en clusters van Cin8. Deze scheiding is belangrijk, omdat de directionaliteit van Cin8 wordt beïnvloed door de accumulatie in clusters op de microtubuli. Deze techniek kan eenvoudig worden aangepast om andere nucleaire eiwitten uit de gist te zuiveren.Bovendien kan het worden toegepast op fluorescerende deeltjes die moeten worden gescheiden in groottegroepen op basis van hun fluorescentie-intensiteit. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Mary Popov, onze laboratoriummanager, Dr. Alina Goldstein-Levitin, en Dr. Nurit Siegler, postdoctorale fellows; Tatiana Zvagelsky, Maya Sadan en Shira Hershfinkel, afgestudeerde studenten; en Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham en Meital Haberman, niet-gegradueerde studenten van ons laboratorium. Om te beginnen, kweek Saccharomyces cerevisiae cellen die het plasmide bevatten voor overexpressie van Cin8-GFP-6His naar de exponentiële groeifase in één liter gistselectief medium, aangevuld met 2% raffinose bij 28 graden Celsius.Induceer vervolgens Cin8-GFP-6His overexpressie door 2% galactose toe te voegen en controleer de groei van de gistcultuur door de absorptie op 600 nanometer te meten. Vijf uur na toevoeging van galactose, oogst de cellen door centrifugeren. Suspensie de cellen opnieuw in lysisbuffer en vries ze in vloeibare stikstof in.Maal vervolgens met behulp van een gekoelde vijzel en stamper de bevroren cellen in vloeibare stikstof. Blijf tijdens het malen vloeibare stikstof toevoegen, zodat de extracten bevroren blijven. Controleer de cellyse onder een fase- of differentiële interferentiecontrastmicroscoop.Ontdooi vervolgens de grondcellen en centrifugeer ze. Laad het supernatant op een zwaartekrachtstroomkolom gevuld met twee milliliter nikkel-NTA en breng het vooraf in evenwicht met lysisbuffer. Laat het bovennatuurlijk door de kolom naar buiten stromen.Was de kolom met vijf kolomvolumes lysisbuffer, gevolgd door vijf kolomvolumes lysisbuffer aangevuld met 25-millimolair imidazool. Elueer vervolgens de Cin8-GFP-6His met elutiebuffer. Analyseer de geëlueerde monsters door SDS-PAGE fractionering, gevolgd door Coomassie blauwe kleuring en Western blot analyse onderzocht met anti-GFP antilichaam.Na het poolen van de fracties die Cin8-GFP-6His bevatten, zuivert u ze door maatuitsluitingschromatografie met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut en een kolomdruklimiet van 1,5 megapascal. Bewaak tegelijkertijd de absorptie op 280 nanometer. Verzamel de fracties die overeenkomen met het Cin8-GFP-tetrameer en analyseer ze met SDS-PAGE en Western blotting.Vul vervolgens de geselecteerde fracties aan, vries in en bewaar tot gebruik bij min 80 graden Celsius. Om de biotine en rhodamine gelabelde microtubuli te polymeriseren en te stabiliseren, mengt u de reactiecomponenten in een buis van 1,5 milliliter en incubeert u het mengsel gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 80 microliter warme algemene tubulinebuffer toe, meng voorzichtig en centrifugeer.Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet voorzichtig opnieuw door op en neer te pipetteren met 50 microliter warme algemene tubulinebuffer. Bewaar de suspensie vervolgens bij 28 of 37 graden Celsius. Onderzoek de microtubuli met een fluorescentiemicroscoop, met behulp van het 647-nanometer rhodaminekanaal.Verwijder vervolgens het beschermende papier van de tapestroken en plaats een silanized coverslip op de strips om drie 10-microliter volumestroomkamers te creëren. Voer vervolgens de avidinecoating van de coverslip uit door sequentiële toevoeging van de aangegeven reagentia. Incubeer de dekplaat gedurende drie tot vijf minuten voordat u deze wast met 80 microliter algemene tubulinebuffer.Bevestig vervolgens de gebiotinyleerde microtubuli aan de b-BSA / avidin-gecoate coverslips door 20 microliter microtub microtub in de stroomkamer in te brengen. Incubeer de dia's met de afdekplaat naar beneden gericht in een donkere vochtigheidskamer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de glaasjes met 200 microliter algemene tubulinebuffer.Breng vervolgens 30 microliter motiliteitsreactiemix aan, gevolgd door Cin8-GFP-motoren verdund in 20 microliter van het motiliteitsreactiemengsel in de stroomkamer en ga onmiddellijk verder met het in beeld brengen van de beweging van de motoren langs de microtubuli. Voor motormotiliteitsbeeldvorming plaatst u een druppel dompelolie op het microscoopobjectief en plaatst u vervolgens de stroomkamer op het fluorescerende microscoopstadium, met de coverslip naar het objectief gericht. Schakel het rhodaminekanaal in om te focussen op de microtubuli die aan het oppervlak van de dekvloer zijn bevestigd.Vervolgens kunt u met behulp van ImageJ Micro-Manager-software het beeld verkrijgen met een belichting van 20 milliseconden. Schakel vervolgens het GFP-kanaal in en verkrijg 90 time-lapse-beelden met een interval van één seconde en een belichting van 800 milliseconden. Open in de ImageJ Fiji-software de time-lapse-film en het bijbehorende microtubule-veldbeeld.Synchroniseer deze twee vensters door Analyseren te kiezen, gevolgd door Extra en Windows synchroniseren. Om een kymograaf te verkrijgen, markeert u één microtubool met de optie Gesegmenteerde lijn. Selecteer vervolgens in Analyseren het tabblad Multi-Kymograaf.Om de clustergrootte van de Cin8-GFP-moleculen te bepalen, voert u de achtergrondaftrekking en correctie voor ongelijke verlichting uit door op Verwerken te klikken, gevolgd door Achtergrond aftrekken. Stel de straal van de rollende kogel in op 100 pixels en vink de optie Glijdende paraboloïde aan. Volg vervolgens een specifieke niet-beweeglijke Cin8-GFP-motor met behulp van de TrackMate-plug-in van de ImageJ Fiji-software.Kies Plug-ins, gevolgd door Tracking, TrackMate, LoG-detector en Simple LAP-tracker om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de Cin8-GFP-motor te volgen als functie van de tijd binnen een cirkel van vier pixels radius. Na het herhalen van de procedure voor verschillende Cin8-GFP-motoren, plot de fluorescentie-intensiteiten als een functie van de tijd. Vervolgens, voor het volgen van de beweeglijkheid van de Cin8-GFP-moleculen langs de microtubulisporen, snijdt u de microtubuli bij die moeten worden geanalyseerd in de time-lapse-reeks van opgenomen frames door deze te markeren met het rechthoekgereedschap en op Afbeelding te klikken, gevolgd door Bijsnijden.Kies een fluorescerend Cin8-GFP-deeltje voor de analyse. Noteer de deeltjescoördinaten in elk frame van de time-lapse-reeks met behulp van het gereedschap Punt en de opties Meten. Registreer op dezelfde manier coördinaten voor andere fluorescerende deeltjes in de time-lapse-reeks.Wijs vervolgens clustergrootte toe aan alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes in het eerste frame van hun verschijning, zoals eerder aangetoond. Bereken vervolgens met behulp van de aangegeven formule en de bepaalde Cin8-GFP-bewegingscoördinaten de verplaatsingen van Cin8-GFP op elk tijdstip ten opzichte van de begincoördinaten. Bereken op basis van deze verplaatsingswaarden de verplaatsing voor alle mogelijke tijdsintervallen voor een gespecificeerd Cin8-GFP-deeltje.Herhaal de procedure voor alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes. Zet ten slotte de gemiddelde verplaatsing van alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes versus het tijdsinterval uit en onderwerp deze aan een lineaire pasvorm. De helling van deze fit vertegenwoordigt de gemiddelde snelheid van beweeglijke Cin8-GFP deeltjes.De beweeglijkheidskenmerken van bidirectioneel motoreiwit Cin8 van verschillende clustergroottes op enkele microtubuli worden hier getoond. Voor elke clustergroottecategorie werden meer dan 40 trajecten van individuele Cin8-GFP uit de opnames geëxtraheerd. Het uitzetten van de gemiddelde verplaatsingen van enkele moleculen en clusters van Cin8-motoren als functie van het tijdsinterval toonde aan dat enkele Cin8-GFP-moleculen op een unidirectionele minus-end-gerichte manier met hoge snelheid bewegen.Cin8-clusters vertonen daarentegen een lagere snelheid en een hogere bidirectionele beweeglijkheid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure moet een zeer zuiver motoreiwit worden gebruikt om verontreinigingen te voorkomen die de motorclustering kunnen beïnvloeden. Bij het analyseren van de motorfluorescentie-intensiteit is het belangrijk om de motoren in het eerste frame dat ze verschijnen te onderzoeken, om het effect van fotobleaching te voorkomen.Bij het bestuderen van de beweeglijkheid van bidirectionele motoren is het uiterst belangrijk om afzonderlijke moleculen en clusters afzonderlijk te analyseren, omdat motorclustering een van de belangrijkste factoren is die de motorische directionaliteit beïnvloeden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Spectrofotometrische screening op potentiële remmers van Cytosolic Glutathione S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...