Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue en partie par la subvention de la Fondation israélienne pour la science (ISF-386/18) et la subvention de la Fondation binationale pour la science d’Israël (BSF-2019008), attribuée à L.G.

1. Préparation des tampons et des réactifs
<ol><li>Tampons<ol>
<li>-Leu aa dropout mix: Mélanger 2 g chacun d’adénine, d’uracile, de tryptophane, d’histidine, de lysine et de méthionine et conserver à température ambiante.</li>
		<li>Milieu sélectif de levure avec raffinose (1 L) : Mélanger 6,7 g de base d’azote de levure (avec du sulfate d’ammonium), 2 g de mélange de gouttes -Leu aa et 20 g de raffinose dans de l’eau double distillée en remuant (sans chauffage) jusqu’à disso...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

Dans ce travail, un protocole pour le test de motilité à molécule unique avec la kinésine bidirectionnelle-5 Cin8 et l’analyse de motilité sont présentés. Le Cin818 pleine longueur, y compris le signal de localisation nucléaire natif (NLS) au terminal C, a été purifié à partir de l’hôte natif S. cerevisiae. Comme le Cin8 est une protéine du moteur nucléaire, le broyage des cellules de S. cerevisiae sous azote liquide s’avère être la méthode la plus efficac...

Un grand nombre d’événements de motilité dans les cellules eucaryotes sont médiés par la fonction des protéines motrices moléculaires. Ces moteurs se déplacent le long des filaments cytosquelettiques, des filaments d’actine et des microtubules (MT), et convertissent l’énergie chimique de l’hydrolyse de l’ATP en forces cinétiques et mécaniques nécessaires pour conduire la motilité biologique dans les cellules. Le S. cerevisiae Cin8 à base de MT est une protéine motrice bipolaire homotétramérique de la kinésine-5 qui réticule et sépare les MT du fuseau1. Cin8 remplit des fonctions essentielles pendant la mitose, dans l’assemblage de la broche 2,3,4 et l’allongement de la broche pendant l’anaphase 5,6,7. Auparavant, il avait été démontré que Cin8 est un moteur bidirectionnel, qui commute la directionnalité dans différentes conditions expérimentales. Par exemple, dans des conditions de résistance ionique élevée, les moteurs Cin8 simples se déplacent vers l’extrémité inférieure des MT, tandis que dans les clusters, dans les essais de glissement MT multimoteurs et entre les MT antiparallèles, les moteurs Cin8 se déplacent principalement vers les extrémités plus des MT 8,9,10,11,12 . Ces résultats étaient très inattendus pour plusieurs raisons. Tout d’abord, Cin8 porte son domaine moteur catalytique à l’amino-terminus et de tels moteurs étaient auparavant considérés comme exclusivement dirigés vers l’extrémité plus, tandis que Cin8 s’est avéré être dirigé vers l’extrémité moins au niveau de la molécule unique. Deuxièmement, on croyait que les moteurs à kinésine étaient unidirectionnels, soit dirigés vers l’extrémité moins, soit vers l’extrémité plus, tandis que Cin8 s’est avéré bidirectionnel, selon les conditions expérimentales. Enfin, en raison de l’orientation MT au niveau de la broche mitotique, le rôle classique des moteurs kinésine-5 dans la séparation des pôles de broche lors de l’assemblage de la broche et de l’anaphase B ne pouvait s’expliquer que par leur motilité dirigée plus-end sur les MT qu’ils réticulent 1,13. À la suite des premiers rapports sur la bidirectionnalité de Cin8, il a été démontré que quelques autres moteurs de kinésine étaient bidirectionnels 14,15,16, ce qui indique que la motilité bidirectionnelle des moteurs de kinésine pourrait être plus courante qu’on ne le croyait auparavant.
Il a déjà été rapporté que dans les cellules, Cin8 se déplace également de manière bidirectionnelle8, soutenant l’idée que la motilité bidirectionnelle de certains moteurs kinésine-5 est importante pour leurs fonctions intracellulaires. De plus, étant donné que les trois moteurs à kinésine-5 qui ont été signalés comme étant bidirectionnels proviennent de cellules fongiques, un rôle possible pour la bidirectionnalité des moteurs à la kinésine-5 a récemment été proposé dans ces cellules10. Selon ce modèle, dans la mitose fermée des cellules fongiques, où l’enveloppe nucléaire ne se décompose pas pendant la mitose, les moteurs kinésine-5 fournissent la force initiale qui sépare les pôles de la broche avant l’assemblage de la broche. Pour effectuer cette tâche, avant la séparation des pôles de la broche, les moteurs à kinésine 5 se localisent près des pôles de la broche, par leur motilité dirigée à l’extrémité négative sur les MT nucléaires simples. Une fois à cette position, les moteurs kinésine-5 se regroupent, commutent la directionnalité, capturent et réticulent les MT des pôles de broche voisins. Par la suite, les moteurs kinésine-5 assurent la séparation initiale des pôles par motilité dirigée plus-end sur les MT qu’ils réticulent. Selon ce modèle, la motilité dirigée à l’extrémité moins sur les MT simples et la motilité dirigée à extrémité plus sur les MT réticulés lors du glissement antiparallèle sont nécessaires pour que les moteurs à kinésine 5 fongique remplissent leur rôle dans l’assemblage de la broche 1,13.
L’objectif global de la méthode décrite est d’obtenir de la kinésine-5 Cin8 fongique de haute pureté marquée GFP et d’effectuer des tests de motilité à molécule unique (Figure 1) tout en analysant séparément la motilité de molécules uniques et de grappes de Cin8. La séparation entre les molécules individuelles et les amas est importante car l’un des facteurs dont il a été démontré qu’il affectait la directionnalité de Cin8 est son accumulation en grappes sur les MT10,12. Les essais de motilité alternatifs, tels que les essais de glissement de surface MT et les essais de glissement MT, ne fournissent pas d’informations concernant l’activité des protéines motrices uniques17,18. Les méthodes robustes de dosage et d’analyse de la motilité à molécule unique décrites ici ont été appliquées avec succès pour caractériser différents aspects des moteurs kinésine-5, Cin8 et Kip1 10,11,12,14,19,20.
Ici, un protocole détaillé est présenté pour la surexpression et la purification de Cin8, la polymérisation des MT et le test de motilité à molécule unique. En outre, les analyses visant à différencier les molécules uniques et les amas de Cin8 et à déterminer les vitesses des moteurs et des grappes par l’analyse du déplacement moyen (MD) et du déplacement carré moyen (MSD) sont également décrites. Ce protocole vise à aider les chercheurs à visualiser toutes les étapes des procédures et à faciliter le dépannage de ce type de tests.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique du test de motilité à molécule unique. Les MT fluorescents biotinylés sont fixés à la surface du verre, recouverts d’avidine qui interagit avec le BSA biotinylé attaché à la surface. La flèche verte représente la direction du mouvement des molécules uniques de Cin8 dans des conditions de force ionique élevée. +/- représentent la polarité du MT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

Les moteurs bipolaires mitotiques kinésine-5 remplissent des fonctions essentielles dans la dynamique de la broche. Ces moteurs présentent une structure homo-tétramérique avec deux paires de domaines moteurs catalytiques, situés aux extrémités opposées du complexe actif. Cette architecture unique permet aux moteurs kinésine-5 de se réticuler et de séparer les microtubules de broche antiparallèles (MT), fournissant ainsi la force dirigée vers l’extérieur qui sépare les pôles de broche. Auparavant, on croyait que les moteurs kinésine-5 étaient exclusivement dirigés vers des extrémités plus. Cependant, des études récentes ont révélé que plusieurs moteurs fongiques à kinésine 5 sont dirigés vers l’extrémité négative au niveau de la molécule unique et peuvent changer de directionnalité dans diverses conditions expérimentales. La Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 est un exemple d’une telle protéine motrice bidirectionnelle: dans des conditions de force ionique élevée, des molécules uniques de Cin8 se déplacent dans la direction de l’extrémité négative des MT. Il a également été démontré que Cin8 forme des amas mobiles, principalement à l’extrémité inférieure des MT, et un tel regroupement permet à Cin8 de changer de directionnalité et de subir une motilité dirigée lente et plus- Cet article fournit un protocole détaillé pour toutes les étapes du travail avec la kinésine-5 Cin8 marquée GFP, de la surexpression des protéines dans les cellules de S. cerevisiae et de sa purification au test de motilité in vitro à molécule unique. Une méthode nouvellement développée décrite ici aide à différencier les molécules uniques et les amas de Cin8, en fonction de leur intensité de fluorescence. Cette méthode permet une analyse séparée de la motilité des molécules individuelles et des amas de Cin8, fournissant ainsi la caractérisation de la dépendance de la motilité de Cin8 sur sa taille de cluster.

L’expérience vise à étudier les caractéristiques de motilité de la protéine motrice bidirectionnelle Cin8 de différentes tailles de grappes sur des MT uniques. La motilité représentative de Cin8-GFP est également évidente à partir des kymographes de la figure 5A, où la position spatiale du moteur au fil du temps est montrée.
Pour l’analyse des propriétés mobiles de Cin8-GFP, la taille du cluster est d’abord attribuée (étape 4.3) à chaque p...

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Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

La kinésine mitotique bidirectionnelle-5 Cin8 s’accumule en grappes qui se divisent et fusionnent au cours de leur motilité. L’accumulation en amas modifie également la vitesse et la directionnalité de Cin8. Ici, un protocole pour les tests de motilité avec Cin8-GFP purifié et l’analyse des propriétés mobiles de molécules uniques et de grappes de Cin8 est décrit.

Motilité de molécules uniques et d’amas de kinésine-5 Cin8 bidirectionnelle purifiée à partir de cellules de S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

La Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 est une protéine motrice bidirectionnelle. Cin8 se déplace dans la direction de l’extrémité inférieure des microtubules en tant que molécule unique et change de directionnalité dans un certain nombre de conditions expérimentales différentes. L’objectif global de notre recherche est de comprendre le mécanisme de la motilité bidirectionnelle en étudiant les facteurs et les éléments structurels qui régulent la motilité bidirectionnelle de Cin8.Ce protocole explique de manière exhaustive la purification du Cin8 pleine longueur de type GFP surexprimé dans les cellules de levure, le test de motilité à molécule unique et l’analyse ultérieure des propriétés mobiles des molécules uniques et des amas de Cin8. Cette séparation est importante, car la directionnalité de Cin8 est affectée par son accumulation en grappes sur le microtubule. Cette technique peut être facilement adaptée pour purifier d’autres protéines nucléaires de la levure.De plus, il peut être appliqué à toutes les particules fluorescentes qui doivent être séparées en groupes de taille en fonction de leur intensité de fluorescence. La Dre Mary Popov, notre directrice de laboratoire, la Dre Alina Goldstein-Levitin, et le Dr Nurit Siegler, boursiers postdoctoraux, feront la démonstration de la procédure; Tatiana Zvagelsky, Mayan Sadan et Shira Hershfinkel, étudiantes diplômées, et Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham et Meital Haberman, étudiantes de premier cycle de notre laboratoire. Pour commencer, cultivez des cellules Saccharomyces cerevisiae contenant le plasmide pour la surexpression de Cin8-GFP-6His à la phase de croissance exponentielle dans un litre de milieu sélectif de levure, complété par 2% de raffinose à 28 degrés Celsius.Ensuite, induisez la surexpression de Cin8-GFP-6His en ajoutant 2% de galactose, et surveillez la croissance de la culture de levure en mesurant l’absorbance à 600 nanomètres. Cinq heures après l’ajout de galactose, récoltez les cellules par centrifugation. Remettez les cellules en suspension dans un tampon de lyse et congelez-les dans de l’azote liquide.Ensuite, à l’aide d’un mortier et d’un pilon réfrigérés, broyer les cellules congelées dans de l’azote liquide. Continuez à ajouter de l’azote liquide pendant le broyage, afin que les extraits restent congelés. Surveillez la lyse cellulaire sous un microscope à contraste de phase ou d’interférence différentielle.Ensuite, décongelez les cellules au sol et centrifugez-les. Chargez le surnageant sur une colonne d’écoulement gravitaire remplie de deux millilitres de nickel-NTA et pré-équilibrez-le avec un tampon de lyse. Laissez le surnageant s’écouler à travers la colonne.Lavez la colonne avec cinq volumes de colonne de tampon de lyse, suivis de cinq volumes de colonne de tampon de lyse complétés par de l’imidazole de 25 millimolaires. Éluez ensuite le Cin8-GFP-6His avec un tampon d’élution. Analysez les échantillons élués par fractionnement SDS-PAGE, suivi d’une coloration bleue de Coomassie et d’une analyse par transfert Western avec un anticorps anti-GFP.Après avoir regroupé les fractions contenant du Cin8-GFP-6His, purifiez-les par chromatographie d’exclusion de taille à un débit de 0,5 millilitre par minute et une limite de pression de colonne de 1,5 mégapascals. Surveillez simultanément l’absorbance à 280 nanomètres. Collectez les fractions correspondant au tétramère Cin8-GFP et analysez-les par SDS-PAGE et Western blotting.Ensuite, aliquotez les fractions sélectionnées, congelez-les instantanément et conservez-les jusqu’à utilisation à moins 80 degrés Celsius. Pour polymériser et stabiliser les microtubules marqués à la biotine et à la rhodamine, mélanger les composants de la réaction dans un tube de 1,5 millilitre et incuber le mélange pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 80 microlitres de tampon de tubuline général chaud, mélangez soigneusement et centrifugez.Jetez le surnageant et remettez-le soigneusement en suspension en pipetant de haut en bas avec 50 microlitres de tampon de tubuline général chaud. Conservez ensuite la suspension à 28 ou 37 degrés Celsius. Examinez les microtubules avec un microscope à fluorescence, en utilisant le canal rhodamine de 647 nanomètres.Ensuite, retirez le papier protecteur des bandes de ruban adhésif et placez un couvercle silanisé sur les bandes pour créer trois chambres d’écoulement volumétrique de 10 microlitres. Effectuez ensuite le revêtement avidin du couvercle par addition séquentielle des réactifs indiqués. Incuber le couvercle pendant trois à cinq minutes avant de le laver avec 80 microlitres de tampon général à base de tubuline.Ensuite, fixez les microtubules biotinylés aux couvercles recouverts de b-BSA / avidine en insérant 20 microlitres de microtubules dans la chambre d’écoulement. Incuber les glissières avec le couvercle orienté vers le bas dans une chambre d’humidité sombre pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les lames avec 200 microlitres de tampon général à base de tubuline.Ensuite, appliquez 30 microlitres de mélange de réaction de motilité suivis de moteurs Cin8-GFP dilués dans 20 microlitres du mélange de réaction de motilité dans la chambre d’écoulement, et procédez immédiatement à l’image du mouvement des moteurs le long des microtubules. Pour l’imagerie de la motilité motrice, placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif du microscope, puis placez la chambre d’écoulement sur l’étage du microscope fluorescent, avec le couvercle tourné vers l’objectif. Activez le canal rhodamine pour vous concentrer sur les microtubules attachés à la surface du couvercle.Ensuite, à l’aide du logiciel ImageJ Micro-Manager, acquérez l’image avec une exposition de 20 millisecondes. Ensuite, activez le canal GFP et acquérez 90 images time-lapse avec un intervalle d’une seconde et une exposition de 800 millisecondes. Dans le logiciel ImageJ Fiji, ouvrez le film time-lapse et l’image de champ de microtubule correspondante.Synchronisez ces deux fenêtres en choisissant Analyser, puis Outils et Synchroniser Windows. Pour obtenir un kymographe, mettez en surbrillance un microtubule à l’aide de l’option Ligne segmentée. Ensuite, dans Analyser, sélectionnez l’onglet Multi Kymograph.Pour déterminer la taille de l’amas des molécules Cin8-GFP, effectuez la soustraction et la correction de fond pour un éclairage inégal en cliquant sur Processus, puis sur Soustraire l’arrière-plan. Réglez le rayon de la boule de roulement sur 100 pixels et cochez l’option Paraboloïde coulissant. Suivez ensuite un moteur Cin8-GFP spécifique non mobile à l’aide du plugin TrackMate du logiciel ImageJ Fiji.Choisissez Plugins, suivis de Tracking, TrackMate, détecteur LoG et Simple LAP tracker pour suivre l’intensité de fluorescence moyenne du moteur Cin8-GFP en fonction du temps dans un cercle de rayon de quatre pixels. Après avoir répété la procédure pour différents moteurs Cin8-GFP, tracez les intensités de fluorescence en fonction du temps. Ensuite, pour suivre la motilité des molécules Cin8-GFP le long des pistes de microtubules, recadrez les microtubules à analyser dans la séquence time-lapse des images enregistrées en les mettant en surbrillance avec l’outil rectangle et en cliquant sur Image, suivi de Recadrage.Choisissez une particule fluorescente Cin8-GFP pour l’analyse. Enregistrez les coordonnées des particules dans chaque image de la séquence time-lapse à l’aide de l’outil de point et des options de mesure. De même, enregistrez les coordonnées d’autres particules fluorescentes dans la séquence time-lapse.Attribuez ensuite la taille du cluster à toutes les particules Cin8-GFP examinées dans la première image de leur apparition, comme démontré précédemment. Ensuite, en utilisant la formule indiquée et les coordonnées de mouvement Cin8-GFP déterminées, calculez les déplacements de Cin8-GFP à chaque point temporel par rapport aux coordonnées initiales. À partir de ces valeurs de déplacement, calculez le déplacement pour tous les intervalles de temps possibles pour une particule Cin8-GFP spécifiée.Répétez la procédure pour toutes les particules de Cin8-GFP examinées. Enfin, tracez le déplacement moyen de toutes les particules de Cin8-GFP examinées par rapport à l’intervalle de temps et soumettez-le à un ajustement linéaire. La pente de cet ajustement représente la vitesse moyenne des particules mobiles de Cin8-GFP.Les caractéristiques de motilité de la protéine motrice bidirectionnelle Cin8 de différentes tailles de grappes sur des microtubules simples sont montrées ici. Pour chaque catégorie de taille de grappe, plus de 40 trajectoires de Cin8-GFP individuelles ont été extraites des enregistrements. Le tracé des déplacements moyens de molécules uniques et d’amas de moteurs Cin8 en fonction de l’intervalle de temps a démontré que les molécules uniques de Cin8-GFP se déplacent de manière unidirectionnelle dirigée vers l’extrémité moins avec une vitesse élevée.En revanche, les amas de Cin8 présentent une vitesse plus faible et une motilité bidirectionnelle plus élevée. Lors de l’exécution de cette procédure, une protéine motrice de haute pureté doit être utilisée pour éviter toute contamination pouvant affecter le regroupement moteur. Lors de l’analyse de l’intensité de fluorescence du moteur, il est important d’examiner les moteurs dans la première image qu’ils apparaissent, afin d’éviter l’effet de photoblanchiment.Lors de l’étude de la motilité des moteurs bidirectionnels, il est extrêmement important d’analyser séparément les molécules et les grappes individuelles, car le regroupement moteur est l’un des facteurs clés qui affectent la directionnalité motrice.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Une méthode efficace pour l&#39;isolement de l&#39;ARN hautement purifiées de semences pour une utilisation dans quantitative transcriptome Analyse

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Recherche

Biochimie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

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We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

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Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

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Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae

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Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Microscopie de suivi à molécule unique - Outil pour déterminer les états diffusifs des molécules cytosoliques

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Dépistage spectrophotométrique des inhibiteurs potentiels du glutathion cytosolique S-Transferases

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Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

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Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

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