Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Diese Forschung wurde zum Teil durch das Stipendium der Israel Science Foundation (ISF-386/18) und das Stipendium der Israel Binational Science Foundation (BSF-2019008) unterstützt, das an L.G.

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien
<ol><li>Puffer<ol>
<li>-Leu aa Dropout-Mix: Je 2 g Adenin, Uracil, Tryptophan, Histidin, Lysin und Methionin mischen und bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>Hefeselektives Medium mit Raffinose (1 L): 6,7 g Hefestickstoffbasis (mit Ammoniumsulfat), 2 g -Leu-aa-Tropfenmischung und 20 g Raffinose in doppelt destilliertem Wasser unter Rühren (ohne Erhitzen) mischen, bis sie vollständig aufgelöst sind. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter in eine s...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für den Einzelmolekül-Motilitätsassay mit dem bidirektionalen Kinesin-5 Cin8 und die Motilitätsanalyse vorgestellt. Das Cin818 in voller Länge einschließlich des nativen nuklearen Lokalisierungssignals (NLS) am C-Terminal wurde vom nativen Wirt S. cerevisiae gereinigt. Da das Cin8 ein Kernmotorprotein ist, erweist sich das Mahlen der S. cerevisiae-Zellen unter flüssigem Stickstoff als die effizienteste Methode für die Zelllyse. Nach der...

Eine große Anzahl von Motilitätsereignissen in eukaryotischen Zellen wird durch die Funktion molekularer Motorproteine vermittelt. Diese Motoren bewegen sich entlang der zytoskelettalen Filamente, Aktinfilamente und Mikrotubuli (MTs) und wandeln die chemische Energie der ATP-Hydrolyse in kinetische und mechanische Kräfte um, die erforderlich sind, um die biologische Motilität in Zellen anzutreiben. Das MT-basierte S. cerevisiae Cin8 ist ein bipolares, homotetrameres Kinesin-5-Motorprotein, das Spindel-MTs vernetzt und auseinanderschiebt1. Cin8 erfüllt wesentliche Funktionen während der Mitose, bei der Spindelmontage 2,3,4 und bei der Spindeldehnung während der Anaphase 5,6,7. Zuvor war gezeigt worden, dass Cin8 ein bidirektionaler Motor ist, der die Richtungsabhängigkeit unter verschiedenen experimentellen Bedingungen schaltet. Zum Beispiel bewegen sich einzelne Cin8-Motoren unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke in Richtung des Minus-Endes der MTs, während sich Cin8-Motoren in Clustern, in mehrmotorigen MT-Gleitassays und zwischen antiparallelen MTs hauptsächlich in Richtung der Plus-Enden der MTsbewegen 8,9,10,11,12 . Diese Ergebnisse waren aus mehreren Gründen höchst unerwartet. Erstens trägt Cin8 seine katalytische motorische Domäne am Amino-Terminus, und es wurde bisher angenommen, dass solche Motoren ausschließlich plus-end gerichtet sind, während Cin8 als minus-end auf der Einzelmolekülebene gerichtet gezeigt wurde. Zweitens wurde angenommen, dass Kinesin-Motoren unidirektional sind, entweder minus-end oder plus-end gerichtet, während Cin8 abhängig von den experimentellen Bedingungen als bidirektional gezeigt wurde. Schließlich konnte aufgrund der MT-Orientierung an der mitotischen Spindel die klassische Rolle von Kinesin-5-Motoren bei der Trennung von Spindelpolen während der Spindelmontage und der Anaphase B nur durch ihre Plus-End-gerichtete Motilität auf den MTs, die sie vernetzen 1,13, erklärt werden. Nach den ersten Berichten über die Bidirektionalität von Cin8 wurde gezeigt, dass einige andere Kinesin-Motoren bidirektional14,15,16 sind, was darauf hindeutet, dass die bidirektionale Motilität von Kinesin-Motoren häufiger sein könnte als bisher angenommen.
Es wurde bereits berichtet, dass sich Cin8 in Zellen auch in einer bidirektionalen Weisebewegt 8, was die Vorstellung unterstützt, dass die bidirektionale Motilität einiger Kinesin-5-Motoren für ihre intrazellulären Funktionen wichtig ist. Da die drei Kinesin-5-Motoren, von denen berichtet wurde, dass sie bidirektional sind, aus Pilzzellen stammen, wurde kürzlich eine mögliche Rolle für die Bidirektionalität von Kinesin-5-Motoren in solchen Zellenvorgeschlagen 10. Nach diesem Modell liefern Kinesin-5-Motoren bei geschlossener Mitose von Pilzzellen, bei denen die Kernhülle während der Mitose nicht zusammenbricht, die Anfangskraft, die die Spindelpole vor der Spindelmontage voneinander trennt. Um diese Aufgabe zu erfüllen, lokalisieren sich Kinesin-5-Motoren vor der Spindelpoltrennung in der Nähe der Spindelpole durch ihre minus-endgerichtete Motilität auf einzelnen Kern-MTs. An dieser Position angekommen, gruppieren, schalten Kinesin-5-Motoren die Richtungsabhängigkeit, erfassen und vernetzen MTs von benachbarten Spindelpolen. Anschließend sorgen Kinesin-5-Motoren für die anfängliche Trennung der Pole durch Plus-End-gerichtete Motilität auf den MTs, die sie vernetzen. Bei diesem Modell sind sowohl eine gerichtete Minus-End-Motilität auf einzelnen MTs als auch eine gerichtete Plus-End-Motilität auf vernetzten MTs während des antiparallelen Gleitens erforderlich, damit Pilzkinesin-5-Motoren ihre Rolle in der Spindelbaugruppe 1,13 erfüllen können.
Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Methode besteht darin, hochreines GFP-markiertes Kinesin-5-Cin8 mit hohem Pilz zu erhalten und Einzelmolekül-Motilitätsassays durchzuführen (Abbildung 1), während die Motilität einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 separat analysiert wird. Die Trennung zwischen einzelnen Molekülen und Clustern ist wichtig, da einer der Faktoren, die nachweislich die Richtungsabhängigkeit von Cin8 beeinflussen, seine Akkumulation in Clustern auf den MTs10,12 ist. Alternative Motilitätsassays, wie die MT-Oberflächengleit- und MT-Gleitassays, liefern keine Informationen über die Aktivität einzelner motorischer Proteine17,18. Die hier beschriebenen robusten Einzelmolekül-Motilitätsassay- und Analysemethoden wurden erfolgreich angewendet, um verschiedene Aspekte der Kinesin-5-Motoren, Cin8 und Kip1 10,11,12,14,19,20, zu charakterisieren.
Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Cin8-Überexpression und -Reinigung, die Polymerisation von MTs und den Einzelmolekül-Motilitätsassay vorgestellt. Darüber hinaus werden auch die Analysen zur Unterscheidung zwischen einzelnen Molekülen und Clustern von Cin8 und zur Bestimmung der Einzelmotor- und Clustergeschwindigkeiten durch mittlere Verschiebung (MD) und mittlere quadratische Verschiebung (MSD) beschrieben. Dieses Protokoll soll Forschern helfen, alle Schritte der Verfahren zu visualisieren und bei der Fehlerbehebung dieser Art von Assays zu helfen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Einzelmolekül-Motilitätsassays. Biotinylierte fluoreszierende MTs sind an der Glasoberfläche befestigt, die mit Avidin beschichtet ist, das mit dem an der Oberfläche befestigten biotinylierten BSA interagiert. Der grüne Pfeil stellt die Bewegungsrichtung einzelner Cin8-Moleküle unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke dar. +/- stellen die Polarität des MT dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

Die mitotischen bipolaren Kinesin-5-Motoren erfüllen wesentliche Funktionen in der Spindeldynamik. Diese Motoren weisen eine homotetramere Struktur mit zwei Paaren katalytischer motorischer Domänen auf, die sich an gegenüberliegenden Enden des aktiven Komplexes befinden. Diese einzigartige Architektur ermöglicht es Kinesin-5-Motoren, antiparallele Spindelmikrotubuli (MTs) zu vernetzen und auseinander zu schieben und so die nach außen gerichtete Kraft bereitzustellen, die die Spindelpole voneinander trennt. Früher wurde angenommen, dass Kinesin-5-Motoren ausschließlich Plus-End-gesteuert sind. Neuere Studien zeigten jedoch, dass mehrere pilzliche Kinesin-5-Motoren am Minus-Ende auf die Einzelmolekülebene gerichtet sind und die Direktionalität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen umschalten können. Das Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 ist ein Beispiel für ein solches bidirektionales Motorprotein: Unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke bewegen sich einzelne Moleküle von Cin8 in Minus-End-Richtung der MTs. Es wurde auch gezeigt, dass Cin8 bewegliche Cluster bildet, hauptsächlich am Minus-Ende der MTs, und ein solches Clustering ermöglicht es Cin8, die Direktionalität zu wechseln und eine langsame, plus gerichtete Motilität zu durchlaufen. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für alle Schritte der Arbeit mit GFP-getaggtem Kinesin-5 Cin8, von der Proteinüberexpression in S. cerevisiae-Zellen über ihre Aufreinigung bis hin zum In-vitro-Einzelmolekül-Motilitätsassay . Eine hier beschriebene neu entwickelte Methode hilft, einzelne Moleküle und Cluster von Cin8 anhand ihrer Fluoreszenzintensität zu unterscheiden. Diese Methode ermöglicht eine separate Analyse der Motilität einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 und liefert so die Charakterisierung der Abhängigkeit der Cin8-Motilität von ihrer Clustergröße.

Das Experiment zielt darauf ab, die Motilitätseigenschaften des bidirektionalen Motorproteins Cin8 verschiedener Clustergrößen auf einzelnen MTs zu untersuchen. Die repräsentative Motilität von Cin8-GFP ist auch aus den Kymographen in Abbildung 5A ersichtlich, wo die räumliche Position des Motors im Laufe der Zeit gezeigt wird.
Für die Analyse der beweglichen Eigenschaften von Cin8-GFP wird zunächst jedem MT-gebundenen beweglichen Cin8-GFP-Partikel die Clu...

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Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Das bidirektionale mitotische Kinesin-5 Cin8 sammelt sich in Clustern an, die sich während ihrer Motilität teilen und verschmelzen. Die Akkumulation in Clustern verändert auch die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Cin8. Hier wird ein Protokoll für Motilitätsassays mit gereinigtem Cin8-GFP und die Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 beschrieben.

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Das Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 ist ein bidirektionales Motorprotein. Cin8 bewegt sich in der Minus-End-Richtung der Mikrotubuli als einzelnes Molekül und ändert die Direktionalität unter einer Reihe verschiedener experimenteller Bedingungen. Das übergeordnete Ziel unserer Forschung ist es, den Mechanismus der bidirektionalen Motilität zu verstehen, indem Faktoren und Strukturelemente untersucht werden, die die bidirektionale Motilität von Cin8 regulieren.Dieses Protokoll erklärt umfassend die Reinigung von GFP-Typ-Cin8 in voller Länge, die in Hefezellen überexprimiert wird, den Einzelmolekül-Motilitätsassay und die anschließende Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8. Diese Trennung ist wichtig, da die Direktionalität von Cin8 durch seine Akkumulation in Clustern auf dem Mikrotubuli beeinflusst wird. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Kernproteine aus der Hefe zu reinigen.Darüber hinaus kann es auf alle fluoreszierenden Partikel angewendet werden, die basierend auf ihrer Fluoreszenzintensität in Größengruppen unterteilt werden müssen. Das Verfahren wird von Dr. Mary Popov, unserer Laborleiterin, Dr. Alina Goldstein-Levitin und Dr. Nurit Siegler, Postdoktoranden, demonstriert; Tatiana Zvagelsky, Mayan Sadan, und Shira Hershfinkel, Doktoranden; und Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham und Meital Haberman, Studenten aus unserem Labor. Züchten Sie zunächst Saccharomyces cerevisiae-Zellen, die das Plasmid zur Überexpression von Cin8-GFP-6His enthalten, bis zur exponentiellen Wachstumsphase in einem Liter hefeselektivem Medium, ergänzt mit 2% Raffinose bei 28 Grad Celsius.Induzieren Sie dann Cin8-GFP-6Seine Überexpression durch Zugabe von 2% Galaktose und überwachen Sie das Wachstum der Hefekultur, indem Sie die Absorption bei 600 Nanometern messen. Fünf Stunden nach der Galaktosezugabe die Zellen durch Zentrifugation ernten. Suspendieren Sie die Zellen im Lysepuffer und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein.Als nächstes mahlen Sie die gefrorenen Zellen mit einem gekühlten Mörser und einem Stößel in flüssigem Stickstoff. Fügen Sie während des Mahlens flüssigen Stickstoff hinzu, damit die Extrakte gefroren bleiben. Überwachen Sie die Zelllyse unter einem Phasen- oder Differentialinterferenzkontrastmikroskop.Dann tauen Sie die gemahlenen Zellen auf und zentrifugieren Sie sie. Laden Sie den Überstand auf eine Schwerkraftsäule, die mit zwei Millilitern Nickel-NTA gefüllt ist, und gleichen Sie ihn mit Lysepuffer aus. Lassen Sie den Überstand durch die Säule fließen.Waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina Lysepuffer, gefolgt von fünf Säulenvolumina Lysepuffer, ergänzt durch 25-millimoläres Imidazol. Dann den Cin8-GFP-6His mit Elutionspuffer eluieren. Analysieren Sie die eluierten Proben durch SDS-PAGE-Fraktionierung, gefolgt von Coomassie-Blaufärbung und Western-Blot-Analyse, die mit Anti-GFP-Antikörpern untersucht wurde.Nachdem Sie die Fraktionen, die Cin8-GFP-6His enthalten, gepoolt haben, reinigen Sie sie durch Größenausschlusschromatographie bei einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute und einer Säulendruckgrenze von 1,5 Megapascal. Überwachen Sie gleichzeitig die Absorption bei 280 Nanometern. Sammeln Sie die Fraktionen, die dem Cin8-GFP-Tetramer entsprechen, und analysieren Sie sie mittels SDS-PAGE und Western Blotting.Dann aliquot die ausgewählten Fraktionen, Snap-Freeze und bis zum Gebrauch bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um die mit Biotin und Rhodamin markierten Mikrotubuli zu polymerisieren und zu stabilisieren, mischen Sie die Reaktionskomponenten in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Dann fügen Sie 80 Mikroliter warmen allgemeinen Tubulinpuffer hinzu, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie.Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie mit 50 Mikrolitern warmem allgemeinen Tubulinpuffer auf und ab pipettieren. Dann lagern Sie die Aufhängung bei 28 oder 37 Grad Celsius. Untersuchen Sie die Mikrotubuli mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des 647-Nanometer-Rhodaminkanals.Entfernen Sie als Nächstes das Schutzpapier von den Bandstreifen und legen Sie ein silanisiertes Deckglas auf die Streifen, um drei 10-Mikroliter-Volumenstromkammern zu schaffen. Führen Sie dann die Avidin-Beschichtung des Deckglases durch sequentielle Zugabe der angegebenen Reagenzien durch. Inkubieren Sie das Deckglas für drei bis fünf Minuten, bevor Sie es mit 80 Mikrolitern allgemeinem Tubulinpuffer waschen.Als nächstes befestigen Sie die biotinylierten Mikrotubuli an den b-BSA / avidinbeschichteten Deckgläsern, indem Sie 20 Mikroliter Mikrotubuli in die Durchflusskammer einführen. Inkubieren Sie die Dias mit dem Deckglas nach unten in einer dunklen Feuchtigkeitskammer für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Objektträger mit 200 Mikrolitern allgemeinem Tubulinpuffer.Als nächstes tragen Sie 30 Mikroliter Motilitätsreaktionsmischung auf, gefolgt von Cin8-GFP-Motoren, die in 20 Mikrolitern der Motilitätsreaktionsmischung verdünnt sind, in die Durchflusskammer und fahren Sie sofort fort, die Bewegung der Motoren entlang der Mikrotubuli abzubilden. Für die Bildgebung der motorischen Motilität legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Mikroskopobjektiv und platzieren Sie dann die Durchflusskammer auf der fluoreszierenden Mikroskopstufe, wobei das Deckglas dem Objektiv zugewandt ist. Schalten Sie den Rhodaminkanal ein, um sich auf die Mikrotubuli zu konzentrieren, die an der Deckglasoberfläche befestigt sind.Erfassen Sie dann mit der ImageJ Micro-Manager-Software das Bild mit einer Belichtung von 20 Millisekunden. Schalten Sie als Nächstes den GFP-Kanal ein und erfassen Sie 90 Zeitrafferbilder mit einem Ein-Sekunden-Intervall und einer Belichtung von 800 Millisekunden. Öffnen Sie in der ImageJ Fiji-Software den Zeitrafferfilm und das entsprechende Mikrotubuli-Feldbild.Synchronisieren Sie diese beiden Fenster, indem Sie Analysieren und anschließend Extras und Fenster synchronisieren auswählen. Um einen Kymographen zu erhalten, markieren Sie einen Mikrotubuli mit der Option Segmentierte Linie. Wählen Sie dann unter Analysieren die Registerkarte Multi Kymograph aus.Um die Clustergröße der Cin8-GFP-Moleküle zu bestimmen, führen Sie die Hintergrundsubtraktion und Korrektur für ungleichmäßige Beleuchtung durch, indem Sie auf Verarbeiten klicken, gefolgt von Hintergrund subtrahieren. Stellen Sie den Radius der rollenden Kugel auf 100 Pixel ein und aktivieren Sie die Option Schiebeparaboloid. Verfolgen Sie dann einen bestimmten, nicht beweglichen Cin8-GFP-Motor mit dem TrackMate-Plugin der ImageJ Fiji-Software.Wählen Sie Plugins, gefolgt von Tracking, TrackMate, LoG-Detektor und Simple LAP-Tracker, um die mittlere Fluoreszenzintensität des Cin8-GFP-Motors als Funktion der Zeit innerhalb eines Kreises von vier Pixeln Radius zu verfolgen. Nachdem Sie das Verfahren für verschiedene Cin8-GFP-Motoren wiederholt haben, zeichnen Sie die Fluoreszenzintensitäten als Funktion der Zeit auf. Um die Motilität der Cin8-GFP-Moleküle entlang der Mikrotubuli-Spuren zu verfolgen, schneiden Sie die Mikrotubuli zu, die in der Zeitraffersequenz der aufgezeichneten Frames analysiert werden sollen, indem Sie sie mit dem Rechteckwerkzeug markieren und auf Bild klicken, gefolgt von Zuschneiden.Wählen Sie für die Analyse ein fluoreszierendes Cin8-GFP-Partikel. Zeichnen Sie die Partikelkoordinaten in jedem Frame der Zeitraffersequenz mit dem Punktwerkzeug und den Optionen "Messen" auf. In ähnlicher Weise zeichnen Sie Koordinaten für andere fluoreszierende Partikel in der Zeitraffersequenz auf.Weisen Sie dann allen untersuchten Cin8-GFP-Partikeln im ersten Rahmen ihres Auftretens die Clustergröße zu, wie bereits gezeigt. Als nächstes berechnen Sie unter Verwendung der angegebenen Formel und der ermittelten Cin8-GFP-Bewegungskoordinaten die Verschiebungen von Cin8-GFP zu jedem Zeitpunkt in Bezug auf die Anfangskoordinaten. Berechnen Sie aus diesen Verschiebungswerten die Verschiebung für alle möglichen Zeitintervalle für ein spezifiziertes Cin8-GFP-Partikel.Wiederholen Sie den Vorgang für alle untersuchten Cin8-GFP-Partikel. Zeichnen Sie schließlich die mittlere Verschiebung aller untersuchten Cin8-GFP-Partikel im Vergleich zum Zeitintervall auf und unterziehen Sie sie einer linearen Anpassung. Die Steigung dieser Anpassung stellt die mittlere Geschwindigkeit von beweglichen Cin8-GFP-Partikeln dar.Die Motilitätseigenschaften des bidirektionalen Motorproteins Cin8 unterschiedlicher Clustergrößen auf einzelnen Mikrotubuli sind hier dargestellt. Für jede Clustergrößenkategorie wurden mehr als 40 Trajektorien einzelner Cin8-GFP aus den Aufnahmen extrahiert. Die Darstellung der mittleren Verschiebungen einzelner Moleküle und Cluster von Cin8-Motoren als Funktion des Zeitintervalls zeigte, dass sich einzelne Cin8-GFP-Moleküle in einer unidirektionalen Minus-End-gerichteten Weise mit hoher Geschwindigkeit bewegen.Im Gegensatz dazu weisen Cin8-Cluster eine geringere Geschwindigkeit und eine höhere bidirektionale Motilität auf. Während der Durchführung dieses Verfahrens muss hochreines Motorprotein verwendet werden, um Kontaminationen zu vermeiden, die das motorische Clustering beeinträchtigen können. Bei der Analyse der motorischen Fluoreszenzintensität ist es wichtig, die Motoren im ersten Bild, in dem sie erscheinen, zu untersuchen, um den Effekt der Photobleiche zu vermeiden.Bei der Untersuchung der Motilität bidirektionaler Motoren ist es äußerst wichtig, einzelne Moleküle und Cluster getrennt zu analysieren, da das motorische Clustering einer der Schlüsselfaktoren ist, die die motorische Richtungalität beeinflussen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Spektrophotometrisches Screening auf potenzielle Inhibitoren von zytosolischen Glutathion-S-Transferasen

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...