Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק הקרן הישראלית למדע (ISF-386/18) ומענק הקרן הלאומית למדע (BSF-2019008), שהוענק ל- L.G.

1. הכנת מאגרים וריאגנטים
<ol><li>מאגרי<ol>
<li>-תערובת נשירה של Leu aa: מערבבים 2 גרם כל אחד של אדנין, אורצ'יל, טריפטופן, היסטידין, ליזין ומתיונין ומאחסנים בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מדיום סלקטיבי של שמרים עם ראפינוז (1 ליטר): מערבבים 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים (עם אמוניום גופרתי), 2 גרם של תערובת נשירה...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

בעבודה זו מוצג פרוטוקול לבדיקת תנועתיות של מולקולה בודדת עם קינזין-5 Cin8 דו-כיווני וניתוח תנועתיות. ה-Cin818 באורך מלא, כולל אות הלוקליזציה הגרעינית המקומי (NLS) במסוף C טוהר מהמארח המקומי S. cerevisiae. מכיוון שה-Cin8 הוא חלבון מוטורי גרעיני, שחיקה של תאי S. cerevisiae תחת חנקן נוזלי נמצא...

מספר רב של אירועי תנועתיות בתוך תאים אאוקריוטים מתווכים על ידי תפקודם של חלבונים מוטוריים מולקולריים. מנועים אלה נעים לאורך חוטי השלד הציטוסקטליים, חוטי האקטין והמיקרוטובולים (MTs), וממירים את האנרגיה הכימית של הידרוליזה של ATP לכוחות קינטיים ומכניים הנדרשים להנעת תנועתיות ביולוגית בתוך התאים. S. cerevisiae Cin8 מבוסס MT הוא חלבון מוטורי דו-קוטבי, הומו-טרמרי קינזין-5, אשר מצליב ומחליק MTs צירים זה מזה1. Cin8 מבצע פונקציות חיוניות במהלך מיטוזה, בהרכבת ציר 2,3,4 והתארכות ציר במהלךאנפאזה 5,6,7. בעבר הוכח כי Cin8 הוא מנוע דו-כיווני, המחליף כיווניות בתנאי ניסוי שונים. לדוגמה, בתנאי חוזק יוני גבוה, מנועי Cin8 בודדים נעים לעבר הקצה התחתון של ה- MTs, בעוד שבאשכולות, במבחני גלישה MT מרובי מנועים, ובין MTs אנטי-פאראליים, מנועי Cin8 נעים בעיקר לעבר הקצוות החיוביים של MTs 8,9,10,11,12 . ממצאים אלה היו מאוד לא צפויים בגלל כמה סיבות. ראשית, Cin8 נושא את התחום המוטורי הקטליטי שלו בתחום האמינו-טרמינוס, ובעבר האמינו שמנועים כאלה מכוונים אך ורק ל-plus-end, בעוד ש-Cin8 הוכח כמינוס-קצה המכוון ברמת המולקולה הבודדת. שנית, מנועי קינסין נחשבו לחד-כיווניים, או מינוס-קצה או פלוס-סוף מכוון, בעוד ש-Cin8 הוכח כדו-כיווני, בהתאם לתנאי הניסוי. לבסוף, בגלל כיוון ה-MT בציר המיטוטי, התפקיד הקלאסי של מנועי קינסין-5 בהפרדת מוטות ציר במהלך מכלול הציר ואנאפאזה B יכול להיות מוסבר רק על ידי תנועתיות מכוונת פלוס-קצה שלהם על ה-MTs שהם מצליבים 1,13. בעקבות הדיווחים הראשונים על הדו-כיווניות של Cin8, כמה מנועי קינסין אחרים הודגמו כדו-כיווניים 14,15,16, מה שמצביע על כך שהתנועתיות הדו-כיוונית של מנועי קינסין עשויה להיות נפוצה יותר ממה שסברו קודם לכן.
בעבר דווח כי בתאים, Cin8 נע גם באופן דו-כיווני8, מה שתומך ברעיון שהתנועתיות הדו-כיוונית של חלק ממנועי קינסין-5 חשובה לתפקודים התוך-תאיים שלהם. בנוסף, מכיוון ששלושת מנועי הקינזין-5 שדווחו כדו-כיווניים הם מתאים פטרייתיים, הוצע לאחרונה תפקיד אפשרי לדו-כיווניות של מנועי קינסין-5 בתאים כאלה10. על פי מודל זה, במיטוזה סגורה של תאים פטרייתיים, שבה המעטפת הגרעינית אינה מתפרקת במהלך מיטוזה, מנועי קינסין-5 מספקים את הכוח הראשוני המפריד בין קטבי הציר לפני הרכבת הציר. כדי לבצע משימה זו, לפני הפרדת מוטות הציר, מנועי קינזין-5 מתמקמים ליד מוטות הציר, על ידי תנועתיות מכוונת מינוס-קצה שלהם על MTs גרעיניים בודדים. ברגע שהם נמצאים במיקום זה, מנועי kinesin-5 מקבצים, מחליפים כיווניות, לוכדים ומקשרים MTs צולבים מעמודי ציר שכנים. לאחר מכן, מנועי kinesin-5 מספקים את ההפרדה הראשונית של הקטבים על ידי תנועתיות מכוונת פלוס-קצה על ה-MTs שהם מצליבים. על פי דגם זה, הן תנועתיות מכוונת מינוס-קצה על MTs בודדים והן תנועתיות מכוונת פלוס-קצה על MTs מקושרים צולבים במהלך החלקה אנטי-פראלית נדרשים למנועי קינסין-5 פטרייתיים כדי לבצע את תפקידם בהרכבת ציר 1,13.
המטרה הכוללת של השיטה המתוארת היא להשיג קינסין-5 Cin8 פטרייתי בעל טוהר גבוה, ולבצע מבחני תנועתיות של מולקולה בודדת (איור 1) תוך ניתוח נפרד של התנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8. ההפרדה בין מולקולות בודדות לאשכולות חשובה מכיוון שאחד הגורמים שהוכחו כמשפיעים על הכיווניות של Cin8 הוא הצטברותו באשכולות על MTs10,12. מבחני תנועתיות חלופיים, כגון מבחני החלקה על פני השטח של MT ומבחני הזזת MT אינם מספקים מידע לגבי פעילותם של חלבונים חד-מנועיים17,18. שיטות הבדיקה והניתוח החזקות של תנועתיות מולקולה בודדת המתוארות כאן יושמו בהצלחה כדי לאפיין היבטים שונים של מנועי קינסין-5, Cin8 ו- Kip1 10,11,12,14,19,20.
כאן מוצג פרוטוקול מפורט לביטוי יתר וטיהור של Cin8, פילמור של MTs ובדיקת תנועתיות של מולקולה אחת. יתר על כן, מתוארים גם הניתוחים להבחנה בין מולקולות בודדות לאשכולות של Cin8, ולקביעת מהירויות מנוע בודדות ואשכולות על ידי ניתוח תזוזה ממוצעת (MD) וניתוח תזוזה ריבועית ממוצעת (MSD). פרוטוקול זה נועד לסייע לחוקרים לדמיין את כל שלבי ההליכים ולסייע בפתרון בעיות מסוג זה של בדיקות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של מבחן תנועתיות המולקולה הבודדת. MTs פלואורסצנטיים ביוטינילטיביים מחוברים לפני השטח של הזכוכית, מצופה באבידין המקיים אינטראקציה עם הביוטינילציה-BSA המחוברת לפני השטח. החץ הירוק מייצג את כיוון התנועה של מולקולות Cin8 בודדות בתנאי חוזק יוני גבוהים. +/- מייצגים את הקוטביות של MT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

מנועי הקינזין-5 הדו-קוטביים המיטוטיים מבצעים פונקציות חיוניות בדינמיקת הציר. מנועים אלה מציגים מבנה הומו-טטרמרי עם שני זוגות של תחומים מוטוריים קטליטיים, הממוקמים בקצוות מנוגדים של המתחם הפעיל. ארכיטקטורה ייחודית זו מאפשרת למנועי kinesin-5 להצליב ולהחליק זה מזה מיקרוטובולים של צירים אנטי-פאראליים (MTs), ובכך לספק את הכוח המכוון כלפי חוץ המפריד בין מוטות הציר. בעבר, מנועי kinesin-5 האמינו להיות באופן בלעדי פלוס-סוף מכוון. עם זאת, מחקרים אחרונים גילו כי מספר מנועי קינזין-5 פטרייתיים מכוונים מינוס-קצה ברמת המולקולה הבודדת ויכולים לשנות כיוון בתנאי ניסוי שונים. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 הוא דוגמה לחלבון מוטורי דו-כיווני כזה: בתנאי חוזק יוני גבוהים מולקולות בודדות של Cin8 נעות בכיוון המינוס-קצה של ה-MTs. כמו כן, הודגם כי Cin8 יוצר אשכולות תנועתיים, בעיקר בקצה המינוס של ה-MTs, ואשכולות כאלה מאפשרים ל-Cin8 לשנות כיוון ולעבור תנועתיות מכוונת איטית, בתוספת קצה. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לכל שלבי העבודה עם kinesin-5 Cin8 המתויג על-ידי GFP, החל מביטוי יתר של חלבונים בתאי S. cerevisiae וטיהורו ועד לבדיקת תנועתיות של מולקולה אחת במבחנה . שיטה חדשה שפותחה כאן מסייעת להבדיל בין מולקולות בודדות לאשכולות של Cin8, בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנציה שלהם. שיטה זו מאפשרת ניתוח נפרד של תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8, ובכך מספקת את אפיון התלות של תנועתיות Cin8 בגודל האשכול שלו.

מטרת הניסוי היא לחקור את מאפייני התנועתיות של החלבון המוטורי הדו-כיווני Cin8 בגדלים שונים של צבירים ב-MTs בודדים. תנועתיות מייצגת של Cin8-GFP ניכרת גם מהקימוגרפים באיור 5A, שם מוצג המיקום המרחבי של המנוע לאורך זמן.
לצורך ניתוח תכונות תנועתיות של Cin8-GFP, ראשית, גודל הצב?...

Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

קינסין-5 Cin8 המיטוטי הדו-כיווני מצטבר באשכולות המתפצלים ומתמזגים במהלך תנועתיותם. הצטברות באשכולות משנה גם את המהירות והכיווניות של Cin8. כאן מתואר פרוטוקול לבדיקות תנועתיות עם Cin8-GFP מטוהר וניתוח תכונות תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8.

תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של קינסין-5 Cin8 דו-כיווני מטוהרים מתאי S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 הוא חלבון מוטורי דו-כיווני. Cin8 נע בכיוון המינוס-קצה של המיקרו-טובולים כמולקולה בודדת, ומשנה את כיווניותו במספר תנאי ניסוי שונים. המטרה הכוללת של המחקר שלנו היא להבין את המנגנון של תנועתיות דו-כיוונית על ידי חקירת גורמים ואלמנטים מבניים המווסתים את תנועתיות הדו-כיוונית של Cin8.פרוטוקול זה מסביר באופן מקיף את הטיהור של Cin8 באורך מלא מסוג GFP המבוטא יתר בתאי שמרים, את בדיקת התנועתיות של מולקולה אחת, ואת הניתוח שלאחר מכן של תכונות תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8. הפרדה זו חשובה, שכן הכיווניות של Cin8 מושפעת מהצטברותו באשכולות על המיקרוטובול. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לטהר חלבונים גרעיניים אחרים מן השמרים.בנוסף, ניתן ליישם אותו על כל חלקיק פלואורסצנטי שיש להפריד לקבוצות גודל על סמך עוצמת הפלואורסצנציה שלהם. מי שידגימו את ההליך יהיו ד"ר מרי פופוב, מנהלת המעבדה שלנו, ד"ר אלינה גולדשטיין-לויטין, וד"ר נורית זיגלר, פוסט-דוקטורנטית; טטיאנה זבגלסקי, מאיה סדן ושירה הרשפינקל, סטודנטיות לתואר שני, ונתא יניר, יהל אברהם, רועי אברהם ומיטל הברמן, סטודנטיות לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, לגדל Saccharomyces cerevisiae תאים המכילים את הפלסמיד לביטוי יתר של Cin8-GFP-6His לשלב הצמיחה האקספוננציאלית בליטר אחד של מדיום סלקטיבי שמרים, בתוספת 2%רפינוז ב 28 מעלות צלזיוס.לאחר מכן לגרום ל-Cin8-GFP-6הבעת יתר על ידי הוספת 2% גלקטוז, ולנטר את צמיחת תרביות השמרים על ידי מדידת ספיגה ב-600 ננומטר. חמש שעות לאחר הוספת גלקטוז, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את התאים במאגר ליזיס, ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי.לאחר מכן, באמצעות טיט מקורר ומזיק, לטחון את התאים הקפואים בחנקן נוזלי. המשיכו להוסיף חנקן נוזלי במהלך הטחינה, כך שהתמציות יישארו קפואות. עקוב אחר התזה של התא תחת מיקרוסקופ ניגודיות של הפרעה פאזה או דיפרנציאלית.לאחר מכן להפשיר את תאי הקרקע, ולצנטריפוגות שלהם. טען את הסופרנאטל על עמוד זרימת כבידה מלא בשני מיליליטרים של ניקל-NTA, והשווה אותו מראש עם חיץ ליזיס. תנו לסופר-נאטאנט לזרום החוצה דרך העמודה.שטפו את העמודה בחמישה כרכים של עמודה של מאגר ליזיס, ואחריהם חמישה כרכים של עמודים של מאגר ליזיס בתוספת אימידזול 25 מילימולרי. לאחר מכן אלחבר את ה- Cin8-GFP-6His עם חיץ אלוטיון. נתחו את הדגימות המבוקרות על ידי פיצול SDS-PAGE, ולאחר מכן את הכתם הכחול של Coomassie וניתוח כתמים מערביים שנבדקו עם נוגדנים נגד GFP.לאחר איגום השברים המכילים Cin8-GFP-6His, טהרו אותם על ידי כרומטוגרפיית הרחקת גודל בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה, ומגבלת לחץ עמודה של 1.5 מגה-פסקל. עקוב בו זמנית אחר הספיגה ב-280 ננומטר. אסוף את השברים המתאימים לטטרמר Cin8-GFP ונתח אותם לפי SDS-PAGE וכתם מערבי.לאחר מכן, בצעו את השברים שנבחרו, הקפאו את ההצמדה ואחסנו עד לשימוש במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לפלפל ולייצב את המיקרוטובולים המסומנים ביוטין ורודמין, ערבבו את רכיבי התגובה בצינור של 1.5 מיליליטר, ודגירו את התערובת למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו 80 מיקרוליטרים של חיץ טובולין כללי חם, ערבבו בזהירות וצנטריפוגה.השליכו את חומר העל, והשעו מחדש את הכדור בזהירות על ידי צנרת למעלה ולמטה עם 50 מיקרוליטרים של חיץ טובולין כללי חם. לאחר מכן אחסן את המתלים ב 28 או 37 מעלות צלזיוס. בחנו את המיקרו-טובולים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות תעלת הרודמין בת 647 הננומטר.לאחר מכן, הסר את נייר המגן מרצועות הקלטת והנח כיסוי סילאני על הרצועות כדי ליצור שלושה תאי זרימה בנפח של 10 מיקרוליטר. לאחר מכן לבצע את ציפוי האבידין של הכיסוי על ידי תוספת רציפה של הריאגנטים המצוינים. דגירו את הכיסוי במשך שלוש עד חמש דקות לפני שאתם שוטפים אותו ב-80 מיקרוליטרים של חיץ צינורולין כללי.לאחר מכן, חברו את המיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה לכיסויים המצופים b-BSA/avidin על ידי החדרת 20 מיקרוליטרים של מיקרוטובולים לתא הזרימה. דגירו את המגלשות כאשר הכיסוי פונה כלפי מטה בתא לחות חשוך למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף את השקופיות עם 200 microliters של חיץ טובולין כללי.לאחר מכן, יש למרוח 30 מיקרוליטרים של תערובת תגובות תנועתיות ואחריהם מנועי Cin8-GFP המדוללים ב-20 מיקרוליטרים של תערובת תגובת התנועתיות לתוך תא הזרימה, ומיד להמשיך לדמות את תנועת המנועים לאורך המיקרוטובולים. להדמיית תנועתיות מוטורית, הניחו טיפת שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ, ולאחר מכן הניחו את תא הזרימה על שלב המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, כאשר הכיסוי פונה למטרה. הפעילו את תעלת הרודמין כדי להתמקד במיקרוטובולים המחוברים למשטח הכיסוי.לאחר מכן, באמצעות תוכנת ImageJ Micro-Manager, לרכוש את התמונה עם חשיפה של 20 אלפיות השנייה. לאחר מכן, הפעל את ערוץ GFP ורכוש 90 תמונות בהילוך מהיר עם מרווח של שנייה אחת וחשיפה של 800 אלפיות השנייה. בתוכנת ImageJ Fiji, פתח את הסרט בהילוך מהיר ואת תמונת השדה המיקרוטובול המתאימה.סנכרן שני חלונות אלה על-ידי בחירה באפשרות 'נתח', ואחריו 'כלים' ו'סנכרן את Windows'. כדי לקבל קימוגרף, סמן מיקרוטובול אחד באמצעות האפשרות 'קו מפולח'. לאחר מכן, מתוך ניתוח, בחר בכרטיסייה Multi Kymograph.כדי לקבוע את גודל האשכול של מולקולות Cin8-GFP, בצע את החיסור והתיקון ברקע להארה לא אחידה על-ידי לחיצה על תהליך, ולאחר מכן על חיסור רקע. הגדר את רדיוס הכדור המתגלגל ל- 100 פיקסלים, ובדוק את האפשרות פרבולואיד הזזה. לאחר מכן עקוב אחר מנוע Cin8-GFP ספציפי שאינו תנועתי באמצעות תוסף TrackMate של תוכנת ImageJ Fiji.בחר תוספים, ולאחר מכן מעקב, TrackMate, גלאי LoG וגשש LAP פשוט כדי לעקוב אחר עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של מנוע Cin8-GFP כפונקציה של זמן בתוך מעגל של רדיוס של ארבעה פיקסלים. לאחר חזרה על ההליך עבור מנועי Cin8-GFP שונים, להתוות את עוצמות הפלואורסצנציה כפונקציה של הזמן. לאחר מכן, כדי לעקוב אחר התנועתיות של מולקולות Cin8-GFP לאורך מסלולי המיקרוטובולים, חתוך את המיקרוטובולים לניתוח ברצף קיטועי הזמן של מסגרות מוקלטות על ידי הדגשתו באמצעות כלי המלבן ולחיצה על תמונה, ואחריה חיתוך.בחר חלקיק Cin8-GFP פלואורסצנטי לניתוח. רשום את קואורדינטות החלקיקים בכל מסגרת של רצף קיטועי הזמן באמצעות כלי הנקודה ואפשרויות המדידה. באופן דומה, רושמים קואורדינטות עבור חלקיקים פלואורסצנטיים אחרים ברצף קיטועי הזמן.לאחר מכן הקצה את גודל האשכול לכל חלקיקי Cin8-GFP שנבדקו במסגרת הראשונה של הופעתם, כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, באמצעות הנוסחה שצוינה וקואורדינטות התנועה הנקבעות של Cin8-GFP, חישבו את התזוזות של Cin8-GFP בכל נקודת זמן ביחס לקואורדינטות הראשוניות. מתוך ערכי תזוזה אלה, חשב את התזוזה עבור כל מרווחי הזמן האפשריים עבור חלקיק Cin8-GFP שצוין.חזור על ההליך עבור כל חלקיקי Cin8-GFP שנבדקו. לבסוף, התווה את התזוזה הממוצעת של כל חלקיקי Cin8-GFP שנבדקו לעומת מרווח זמן, והעמיד אותה להתאמה ליניארית. השיפוע של התאמה זו מייצג את המהירות הממוצעת של חלקיקי Cin8-GFP תנועתיים.מאפייני התנועתיות של החלבון המוטורי הדו-כיווני Cin8 בגדלים שונים של צבירים על מיקרוטובולים בודדים מוצגים כאן. עבור כל קטגוריית גודל אשכול, יותר מ-40 מסלולים של Cin8-GFP בודדים הוצאו מההקלטות. התוויית התזוזות הממוצעות של מולקולות בודדות ואשכולות של מנועי Cin8 כפונקציה של מרווח הזמן הראתה כי מולקולות Cin8-GFP בודדות נעות באופן חד-כיווני מינוס-קצה מכוון במהירות גבוהה.לעומת זאת, אשכולות Cin8 מפגינים מהירות נמוכה יותר ותנועתיות דו-כיוונית גבוהה יותר. בעת ביצוע הליך זה, יש להשתמש בחלבון מוטורי בטוהר גבוה כדי למנוע זיהומים שיכולים להשפיע על אשכולות מוטוריים. בניתוח עוצמת הפלואורסצנציה המוטורית, חשוב לבחון את המנועים במסגרת הראשונה שהם מופיעים, כדי למנוע את ההשפעה של הלבנת תמונות.כאשר חוקרים את תנועתיות המנועים הדו-כיווניים, חשוב מאוד לנתח בנפרד מולקולות ואשכולות בודדים, שכן אשכולות מוטוריים הם אחד הגורמים המרכזיים המשפיעים על כיווניות המנוע.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

הקרנה ספקטרופוטומטרית עבור מעכבים פוטנציאליים של גלוטתיון ציטוסולי S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...