Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

この研究は、L.G.に授与されたイスラエル科学財団助成金(ISF-386/18)とイスラエル二国間科学財団助成金(BSF-2019008)によって部分的に支援されました。

1. 緩衝液および試薬の調製
<ol><li>バッファー<ol>
<li>-Leu aaドロップアウトミックス:アデニン、ウラシル、トリプトファン、ヒスチジン、リジン、メチオニンの各2gを混合し、室温で保存する。</li>
		<li>酵母選択培地とラフィノース(1L):酵母窒素ベース6.7g(硫酸アンモニウムを含む)、2gの-Leu aaドロップアウトミックス、および20gのラフィノースを二重蒸留水に混合し、完全に溶解す...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

この研究では、双方向キネシン-5 Cin8を用いた単一分子運動性アッセイおよび運動性分析のためのプロトコルが提示される。C末端における天然核局在化シグナル(NLS)を含む全長Cin8 18 は、天然宿主 S. cerevisiaeから精製されている。Cin8は核モータータンパク質であるため、液体窒素下で セレビシエ 菌細胞を粉砕することが、細胞溶解のための最も効率的な方法で?...

真核細胞内の多数の運動性事象は、分子運動タンパク質の機能によって媒介される。これらのモーターは、細胞骨格フィラメント、アクチンフィラメント、および微小管(MT)に沿って移動し、ATP加水分解の化学エネルギーを細胞内の生物学的運動性を駆動するために必要な運動学的および機械的力に変換する。MTベースのS. cerevisiae Cin8は、双極性のホモ四量体キネシン-5モータータンパク質であり、スピンドルMTを架橋してスライドさせる1。Cin8は、有糸分裂中、紡錘体アセンブリ2,3,4および分裂後期5,6,7中の紡錘体伸長において、本質的な機能を果たす。これまで、Cin8は双方向モータであり、異なる実験条件下で方向性を切り替えることが実証されていました。例えば、高いイオン強度条件下では、単一のCin8モータはMTのマイナス端に向かって移動するが、クラスタでは、マルチモータMTグライダーアッセイでは、および反並列MT間では、Cin8モータは主にMTのプラス端に向かって移動する8,9,10,11,12 .これらの発見は、いくつかの理由により非常に予想外であった。第一に、Cin8はアミノ末端に触媒モータードメインを持ち、そのようなモーターは以前はもっぱらプラスエンド指向性であると考えられていたが、Cin8は単一分子レベルでのマイナス末端指向性であることが示された。第二に、キネシンモーターはマイナス端またはプラス端のいずれかの単方向であると考えられていたが、Cin8は実験条件に応じて双方向であることが示された。最後に、有糸分裂スピンドルにおけるMT配向のために、スピンドルアセンブリ中のスピンドル極と分裂後期Bの分離におけるキネシン-5モータの古典的な役割は、それらが架橋するMT上のプラスエンド指向性によってのみ説明できた1,13。Cin8の双方向性に関する最初の報告に続いて、他のいくつかのキネシンモーターが双方向であることが実証された14,15,16、キネシンモーターの双方向運動性は、以前に信じられていたよりも一般的である可能性があることを示している。
細胞内では、Cin8も双方向で移動することが以前に報告されており8、いくつかのキネシン5モーターの双方向運動性が細胞内機能にとって重要であるという考えを支持している。また、双方向であることが報告された3つのキネシン-5モーターは真菌細胞由来であることから、このような細胞10においてキネシン-5モーターの双方向性に対する役割の可能性が最近提案されている。このモデルによると、有糸分裂中に核エンベロープが破壊されない真菌細胞の閉鎖有糸分裂では、キネシン-5モーターは、紡錘体組み立ての前に紡錘極を分離する初期力を提供する。このタスクを実行するために、主軸極分離の前に、キネシン-5モータは、単一の核MT上のマイナス端指向運動性によって、主軸極の近くに局在する。この位置に着くと、キネシン-5モーターはクラスタリングし、方向を切り替え、キャプチャし、隣接するスピンドルポールからMTをクロスリンクします。続いて、キネシン-5モータは、それらが架橋するMT上のプラスエンド指向性運動性によって極の初期分離を提供する。このモデルでは、真菌キネシン-5モータがスピンドルアセンブリでその役割を果たすために、単一MT上のマイナス端指向性運動性と、逆平行摺動中の架橋MT上のプラスエンド指向性運動性の両方が必要である1,13。
記載された方法の全体的な目標は、高純度の真菌GFPタグ付きキネシン-5 Cin8を取得し、単一分子およびCin8のクラスターの運動性を別々に分析しながら、単一分子運動性アッセイ(図1)を行うことである。単一分子とクラスターの間の分離は、Cin8の方向性に影響を与えることが実証された要因の1つがMTs10,12上のクラスターへの蓄積であるため、重要である。MT表面滑空およびMT摺動アッセイなどの代替運動性アッセイは、単一モータータンパク質の活性に関する情報を提供しない17、18。ここで説明する堅牢な単一分子運動性アッセイおよび分析方法は、キネシン-5モーター、Cin8およびKip1 10、11、12、14、19、20のさまざまな側面を特徴付けるために首尾よく適用されています。
ここでは、Cin8の過剰発現および精製、MTの重合、および単一分子運動性アッセイについて、詳細なプロトコールを提示する。さらに、Cin8の単一分子とクラスターを区別し、平均変位(MD)および平均二乗変位(MSD)分析によって単一モーター速度およびクラスター速度を決定するための分析も記載されている。このプロトコルは、研究者が手順のすべてのステップを視覚化し、このタイプのアッセイのトラブルシューティングを支援することを目的としています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> 図1:一分子運動性アッセイの概略図。 ビオチン化蛍光MTはガラス表面に付着し、表面結合ビオチン化BSAと相互作用するアビジンでコーティングされている。緑色の矢印は、高イオン強度条件下での単一のCin8分子の移動方向を表す。+/- MTの極性を表します <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

有糸分裂バイポーラキネシン-5モーターは、スピンドルダイナミクスにおいて重要な機能を果たします。これらのモーターは、活性複合体の両端に位置する2対の触媒モータードメインを有するホモ四量体構造を示す。このユニークなアーキテクチャにより、キネシン-5モータは、逆平行スピンドル微小管(MT)を架橋してスライドさせることができ、スピンドルポールを分離する外向きの力を提供します。以前は、キネシン-5モーターはもっぱらプラスエンド指向であると考えられていました。しかし、最近の研究では、いくつかの真菌キネシン-5モーターがマイナス末端が単一分子レベルに向けられており、さまざまな実験条件下で方向性を切り替えることができることが明らかになりました。 サッカロミセス・セレビシエ・ キネシン−5 Cin8は、そのような双方向モータータンパク質の一例である:高イオン強度条件下では、Cin8の単一分子はMTのマイナス末端方向に移動する。また、Cin8は主にMTのマイナス端で運動性クラスターを形成し、そのようなクラスタリングはCin8が方向性を切り替え、ゆっくりとしたプラスエンド指向性を経験することを可能にすることも示された。この記事では、 S. cerevisiae 細胞におけるタンパク質過剰発現およびその精製から in vitro 単一分子運動性アッセイまで、GFPタグ付きキネシン-5 Cin8を使用するすべてのステップについて詳細なプロトコルを提供します。ここで説明する新しく開発された方法は、蛍光強度に基づいてCin8の単一分子とクラスターを区別するのに役立ちます。この方法は、Cin8の単一分子およびクラスターの運動性の別々の分析を可能にし、したがって、Cin8の運動性のクラスターサイズに対する依存性の特性評価を提供する。

この実験は、単一MT上の異なるクラスターサイズの双方向モータータンパク質Cin8の運動性特性を調べることを目的としています。Cin8-GFPの代表的な運動性は、経時的なモーターの空間的位置が示されている 図5Aのキモグラフからも明らかです。
Cin8-GFPの運動特性の分析のために、まず、クラスターサイズを各MT付着運動性Cin8-GFP粒子に割り当て(ステ?...

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Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

双方向有糸分裂キネシン-5 Cin8は、運動性の間に分裂して融合するクラスターに蓄積する。クラスターへの蓄積は、Cin8の速度と方向性も変化させます。ここでは、精製Cin8−GFPを用いた運動性アッセイおよびCin8の単一分子およびクラスターの運動性特性の分析のためのプロトコルが記載されている。

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

サッカロミセス・セレビシエ・キネシン-5 Cin8は双方向モータータンパク質である。Cin8は、単一の分子として微小管のマイナス端方向に移動し、多くの異なる実験条件下で方向性を変化させる。私たちの研究の全体的な目標は、Cin8の双方向運動性を調節する要因と構造要素を研究することによって、双方向運動性のメカニズムを理解することです。このプロトコルは、酵母細胞で過剰発現されたGFP型完全長Cin8の精製、単一分子運動性アッセイ、およびCin8の単一分子およびクラスターの運動特性のその後の分析を包括的に説明しています。Cin8の方向性は微小管上のクラスターへの蓄積によって影響を受けるため、この分離は重要です。この技術は、酵母から他の核タンパク質を精製するために容易に適合させることができる。さらに、蛍光強度に基づいてサイズグループに分離する必要がある任意の蛍光粒子に適用することができます。この手順を実証するのは、メアリー・ポポフ博士、私たちの研究室長、アリナ・ゴールドスタイン・レヴィティン博士、およびポスドク研究員のヌリット・シーグラー博士です。大学院生のタチアナ・ズヴァゲルスキー、マヤ・サダン、シラ・ハーシュフィンケル、当研究室の学部生ネタ・ヤニール、ヤヘル・アブラハム、ロイ・アブラハム、メイタル・ハーバーマン。開始するには、Cin8-GFP-6Hisの過剰発現のためのプラスミドを含むサッカロミセス・セレビシエ細胞を、摂氏28度で2%ラフィノースを添加した1リットルの酵母選択培地中で指数関数的増殖期に増殖させる。次いで、2%ガラクトースを添加してCin8−GFP-6His過剰発現を誘導し、600ナノメートルでの吸光度を測定することによって酵母培養増殖をモニターした。ガラクトース添加の5時間後、遠心分離により菌体を回収する。細胞を溶解バッファーに再懸濁し、液体窒素で凍結する。次に、チルド乳鉢及び乳棒を用いて、凍結菌体を液体窒素中で粉砕する。粉砕中に液体窒素を加え続け、抽出物が凍結したままになるようにする。位相または微分干渉コントラスト顕微鏡下で細胞溶解を監視します。その後、粉砕した細胞を解凍し、遠心分離機で遠心分離する。上清を2ミリリットルのニッケル-NTAで満たされた重力流カラムにロードし、溶解バッファーで事前に平衡化します。上清をカラムから流出させます。5 カラム容量の溶解バッファーでカラムを洗浄し、続いて 5 カラム容量の溶解バッファーに 25 ミリモルのイミダゾールを加えます。次いで、Cin8-GFP-6Hisを溶出緩衝液で溶出する。溶出したサンプルをSDS−PAGE分画によって分析し、続いてクマシーブルー染色およびウェスタンブロット分析を抗GFP抗体でプローブした。Cin8-GFP-6Hisを含む画分をプールした後、毎分0.5ミリリットルの流速で、および1.5メガパスカルのカラム圧力限界でサイズ排除クロマトグラフィーによってそれらを精製する。同時に280ナノメートルでの吸光度を監視する。Cin8-GFP四量体に相当する画分を採取し、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにより分析する。次に、選択した画分をアリコートし、スナップフリーズし、マイナス80°Cで使用するまで保存します。ビオチンおよびローダミン標識微小管を重合および安定化させるには、反応成分を1.5ミリリットルのチューブで混合し、混合物を摂氏37度で1時間インキュベートする。その後、80マイクロリットルの温かい一般チューブリン緩衝液を加え、慎重に混合し、遠心分離機で遠心分離する。上清を捨て、50マイクロリットルの温かい一般チューブリン緩衝液で上下にピしてペレットを注意深く再懸濁した。その後、サスペンションを摂氏28度または37度で保管します。647ナノメートルのローダミンチャネルを使用して、蛍光顕微鏡で微小管を調べます。次に、テープストリップから保護紙を取り出し、ストリップ上にシラン処理されたカバースリップを配置して、3つの10マイクロリットルの体積流量チャンバを作成します。次いで、示された試薬を順次添加することによってカバースリップのアビジンコーティングを行う。カバースリップを3〜5分間インキュベートしてから、80マイクロリットルの一般的なチューブリン緩衝液で洗浄する。次に、20マイクロリットルの微小管をフローチャンバに挿入することによって、ビオチン化微小管をb-BSA/アビジンコーティングカバースリップに取り付けます。スライドを、カバースリップを下向きにして、暗湿度チャンバー内で室温で5分間インキュベートする。その後、スライドを200マイクロリットルの一般的なチューブリンバッファーで洗浄します。次に、30マイクロリットルの運動性反応混合物に続いて、20マイクロリットルの運動性反応混合物で希釈したCin8-GFPモーターをフローチャンバに塗布し、直ちに微小管に沿ったモーターの動きを画像化する。運動性イメージングでは、顕微鏡の対物レンズに液浸オイルを一滴置き、フローチャンバーを蛍光顕微鏡ステージに置き、カバースリップを対物レンズに向けます。ローダミンチャネルをオンにして、カバースリップ表面に取り付けられた微小管に焦点を合わせます。次に、ImageJマイクロマネージャーソフトウェアを使用して、20ミリ秒の露光で画像を取得します。次に、GFPチャンネルをオンにして、1秒間隔と800ミリ秒の露出で90枚のタイムラプス画像を取得します。ImageJ フィジー ソフトウェアで、タイムラプス ムービーと対応する微小管フィールド画像を開きます。これら 2 つのウィンドウを同期するには、[分析] を選択し、[ツール] と [ウィンドウの同期] を選択します。キモグラフを取得するには、[セグメント化された線] オプションを使用して 1 つの微小管を強調表示します。次に、[分析] から [マルチキモグラフ] タブを選択します。Cin8-GFP分子のクラスターサイズを決定するには、プロセスをクリックして背景の減算と不均一な照明の補正を実行し、続いて背景の減算を行います。[ローリングボールの半径] を 100 ピクセルに設定し、[放物面をスライドさせる] オプションをオンにします。次に、ImageJフィジーソフトウェアのTrackMateプラグインを使用して、特定の非運動性Cin8-GFPモーターを追跡します。プラグインを選択し、その後にトラッキング、トラックメイト、LoG検出器、およびシンプルLAPトラッカーを選択して、Cin8-GFPモーターの平均蛍光強度を半径4ピクセルの円内の時間の関数として追跡します。異なるCin8-GFPモーターについてこの手順を繰り返した後、蛍光強度を時間の関数としてプロットします。次に、微小管トラックに沿ってCin8-GFP分子の運動性を追跡するために、長方形ツールで強調表示して画像をクリックし、続いて[切り抜き]をクリックして、記録されたフレームのタイムラプスシーケンスで分析する微小管をトリミングします。分析のために蛍光Cin8-GFP粒子を選択してください。タイムラプスシーケンスの各フレームのパーティクル座標を、ポイントツールと「測定」(Measure) オプションを使用して記録します。同様に、他の蛍光粒子の座標をタイムラプス配列に記録する。次に、前述のように、外観の最初のフレームで検査されたすべてのCin8-GFP粒子にクラスターサイズを割り当てます。次に、指示された式と決定されたCin8-GFP移動座標とを用いて、初期座標に対する各時点におけるCin8-GFPの変位を算出する。これらの変位値から、指定された Cin8-GFP 粒子について可能なすべての時間間隔の変位を計算します。検査したすべてのCin8-GFP粒子についてこの手順を繰り返します。最後に、調べたすべてのCin8-GFP粒子の平均変位を時間間隔に対してプロットし、線形適合に供します。この適合の傾きは、運動性Cin8-GFP粒子の平均速度を表す。単一の微小管上の異なるクラスターサイズの双方向モータータンパク質Cin8の運動性特性をここに示す。クラスターサイズカテゴリごとに、個々のCin8-GFPの40以上の軌道が記録から抽出されました。単一分子およびCin8モーターのクラスターの平均変位を時間間隔の関数としてプロットすると、単一のCin8-GFP分子が一方向マイナス末端指向的に高速で移動することが実証された。対照的に、Cin8クラスターは、より低い速度およびより高い双方向運動性を示す。この手順を実行している間、高純度のモータータンパク質を使用して、モータークラスタリングに影響を与える可能性のある汚染を回避する必要があります。モーターの蛍光強度を分析する際には、フォトブリーチングの影響を避けるために、表示される最初のフレームのモーターを調べることが重要です。双方向モータの運動性を研究する際には、モータクラスタリングがモータの方向性に影響を与える重要な要素の1つであるため、単一分子とクラスタを別々に解析することが非常に重要です。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

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