Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

이 연구는 L.G.에 수여 된 이스라엘 과학 재단 보조금 (ISF-386/18)과 이스라엘 이중 국가 과학 재단 보조금 (BSF-2019008)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. 완충제 및 시약의 제조
<ol><li>버퍼<ol>
<li>-Leu aa 드롭아웃 믹스: 아데닌, 우라실, 트립토판, 히스티딘, 라이신, 메티오닌 각각 2g을 섞어 실온에서 보관한다.</li>
		<li>효모 선택 배지와 라피노스 (1 L): 완전히 용해될 때까지 교반하여(가열 없이) 이중 증류수에 효모 질소 염기 6.7 g(황산암모늄 포함), 2 g의 -Leu aa 드롭아웃 믹스 및 20 g의 라피노오스를 혼합한다. 0.22 μm 필터를 사용하여, ?...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

이 연구에서는 양방향 키네신-5 Cin8을 사용한 단일 분자 운동성 분석 및 운동성 분석을 위한 프로토콜이 제시된다. C 말단에서 천연 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 전장Cin8(18 )은 천연 숙주 S. 세레비시아로부터 정제되었다. Cin8은 핵 운동 단백질이기 때문에 액체 질소 하에서 S. cerevisiae 세포를 분쇄하는 것이 세포 용해를위한 가장 효율적인 방법임이 밝혀졌습니다. ?...

진핵 세포 내의 많은 운동성 사건은 분자 운동 단백질의 기능에 의해 매개된다. 이 모터는 세포 골격 필라멘트, 액틴 필라멘트 및 미세 소관 (MTs)을 따라 움직이며 ATP 가수분해의 화학 에너지를 세포 내에서 생물학적 운동성을 유도하는 데 필요한 운동 및 기계적 힘으로 변환합니다. MT 기반 S. cerevisiae Cin8은 양극성, 호모테트라머 키네신-5 모터 단백질로, 스핀들 MT를 교차 연결하고슬라이드합니다 1. Cin8은 유사분열 동안, 스핀들 어셈블리 2,3,4 및 아나페이즈 5,6,7 동안 스핀들 신장에서 필수 기능을 수행합니다. 이전에는 Cin8이 다양한 실험 조건에서 방향성을 전환하는 양방향 모터라는 것이 입증되었습니다. 예를 들어, 높은 이온 강도 조건에서 단일 Cin8 모터는 MT의 마이너스 끝쪽으로 이동하지만 클러스터, 다중 모터 MT 글라이딩 분석 및 병렬 MT 사이에서 Cin8 모터는 주로 MT 8,9,10,11,12의 플러스 엔드쪽으로 이동합니다. . 이러한 발견은 여러 가지 이유로 인해 매우 예상치 못한 결과였습니다. 첫째, Cin8은 아미노 말단에서 촉매 모터 도메인을 운반하며 그러한 모터는 이전에 독점적으로 플러스 엔드 지향으로 여겨졌지만 Cin8은 단일 분자 수준에서 마이너스 말단으로 향하는 것으로 나타났습니다. 둘째, 키네신 모터는 마이너스 엔드 또는 플러스 엔드 지향 단방향인 단방향인 것으로 여겨졌지만, Cin8은 실험 조건에 따라 양방향인 것으로 나타났다. 마지막으로, 유사 분열 스핀들에서의 MT 방향 때문에, 스핀들 조립 및 아나 페이즈 B 동안 스핀들 폴의 분리에서 kinesin-5 모터의 고전적인 역할은1,13을 교차 연결하는 MT에 대한 플러스 엔드 지향 운동성으로 만 설명 될 수 있습니다. Cin8의 양방향성에 대한 첫 번째 보고에 따라, 몇 가지 다른 키네신 모터가 양방향 14,15,16인 것으로 입증되었으며, 이는 키네신 모터의 양방향 운동성이 이전에 생각했던 것보다 더 일반적일 수 있음을 나타냅니다.
세포에서 Cin8은 또한 양방향 방식으로 움직인다8, 일부 kinesin-5 모터의 양방향 운동성이 세포 내 기능에 중요하다는 개념을 뒷받침하는 것으로 이전에 보고되었다. 또한, 양방향성으로 보고되었던 세 개의 키네신-5 모터가 진균 세포로부터 왔기 때문에, 키네신-5 모터의 양방향성에 대한 가능한 역할이 최근 이러한 세포(10)에서 제안되고 있다. 이 모델에 따르면, 유사분열 중에 핵 외피가 분해되지 않는 곰팡이 세포의 폐쇄 된 유사분열에서 kinesin-5 모터는 스핀들 조립 전에 스핀들 극을 분리하는 초기 힘을 제공합니다. 이 작업을 수행하기 위해 스핀들 폴 분리 전에 kinesin-5 모터는 단일 핵 MT에서 마이너스 엔드 지향 운동성에 의해 스핀들 폴 근처에 국한됩니다. 이 위치에 도착하면 kinesin-5 모터가 클러스터링되고, 방향성을 전환하고, 캡처하고, 인접 스핀들 폴에서 MT를 교차 연결합니다. 그 후, kinesin-5 모터는 가교 연결된 MT에서 플러스 엔드 지향 운동성으로 극의 초기 분리를 제공합니다. 이 모델에 따르면, 단일 MT의 마이너스 엔드 지향 운동성과 반평행 슬라이딩 중 가교 MT의 플러스 엔드 지향 운동성은 곰팡이 키네신-5 모터가 스핀들 어셈블리1,13에서 역할을 수행하는 데 필요합니다.
기술된 방법의 전반적인 목표는 고순도 진균성 GFP-태깅된 키네신-5 Cin8을 수득하고 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 운동성을 개별적으로 분석하면서 단일 분자 운동성 분석(도 1)을 수행하는 것이다. 단일 분자와 클러스터 사이의 분리는 Cin8의 방향성에 영향을 미치는 것으로 입증된 인자 중 하나가 MT10,12 상의 클러스터에 축적되기 때문에 중요하다. MT 표면 글라이딩 및 MT 슬라이딩 분석과 같은 대안적인 운동성 분석은 단일 운동 단백질17,18의 활성에 관한 정보를 제공하지 않는다. 여기에 설명된 강력한 단일 분자 운동성 분석 및 분석 방법은 키네신-5 모터, Cin8 및 Kip1 10,11,12,14,19,20의 다양한 측면을 특성화하기 위해 성공적으로 적용되었습니다.
여기에서, Cin8 과발현 및 정제, MTs의 중합, 및 단일 분자 운동성 검정을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 또한, Cin8의 단일 분자와 클러스터를 구별하고, 평균 변위 (MD) 및 평균 제곱 변위 (MSD) 분석에 의해 단일 모터 및 클러스터 속도를 결정하는 분석도 설명된다. 이 프로토콜은 연구자가 절차의 모든 단계를 시각화하고 이러한 유형의 분석 문제를 해결하는 데 도움을주는 것을 목표로합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> 도 1: 단일 분자 운동성 분석의 개략적 표현. 비오티닐화 형광 MTs는 유리 표면에 부착되고, 표면 부착된 비오티닐화-BSA와 상호작용하는 아비딘으로 코팅된다. 녹색 화살표는 높은 이온 강도 조건 하에서 단일 Cin8 분자의 이동 방향을 나타낸다. +/- MT의 극성을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

유사분열성 양극성 키네신-5 모터는 스핀들 역학에서 필수적인 기능을 수행합니다. 이 모터는 활성 복합체의 반대쪽 끝에 위치한 두 쌍의 촉매 모터 도메인을 가진 호모 사량체 구조를 나타냅니다. 이 독특한 아키텍처는 kinesin-5 모터가 반평행 스핀들 미세소관(MT)을 가교 및 분리할 수 있게 해줌으로써 스핀들 극을 분리하는 외향 지향적인 힘을 제공합니다. 이전에는 kinesin-5 모터가 독점적으로 플러스 엔드 지향으로 여겨졌습니다. 그러나 최근 연구에 따르면 여러 곰팡이 키네신 -5 모터는 단일 분자 수준에서 향하는 마이너스 엔드이며 다양한 실험 조건에서 방향성을 전환 할 수 있습니다. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8은 이러한 양방향 운동 단백질의 예입니다 : 높은 이온 강도 조건에서 Cin8의 단일 분자가 MT의 마이너스 - 끝 방향으로 움직입니다. 또한 Cin8은 주로 MT의 마이너스 말단에 모타일 클러스터를 형성하며, 이러한 클러스터링을 통해 Cin8은 방향성을 전환하고 느리고 플러스 엔드 지향 운동성을 겪을 수 있습니다. 이 기사는 S. cerevisiae 세포에서의 단백질 과발현 및 그의 정제에서부터 시험관내 단일 분자 운동성 분석에 이르기까지 GFP 태깅된 키네신-5 Cin8로 작업하는 모든 단계에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 여기에 설명 된 새로 개발 된 방법은 형광 강도에 따라 Cin8의 단일 분자와 클러스터를 구별하는 데 도움이됩니다. 이 방법은 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 운동성에 대한 별도의 분석을 가능하게하여 클러스터 크기에 대한 Cin8 운동성의 의존성의 특성을 제공합니다.

이 실험은 단일 MT에서 서로 다른 클러스터 크기의 양방향 모터 단백질 Cin8의 운동성 특성을 조사하는 것을 목표로합니다. Cin8-GFP의 대표적인 운동성은 시간에 따른 모터의 공간 위치가 표시된 그림 5A의 키모 그래프에서도 분명합니다.
Cin8-GFP의 모타일 특성의 분석을 위해, 먼저, 클러스터 크기가 각각의 MT 부착 모타일 Cin8-GFP 입자에 할당되고(단계 4.3), ?...

Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8은 양방향 운동 단백질입니다. Cin8은 단일 분자로서 미세소관의 마이너스 말단 방향으로 이동하고, 다수의 상이한 실험 조건 하에서 방향성을 변화시킨다. 우리 연구의 전반적인 목표는 Cin8의 양방향 운동성을 조절하는 요인과 구조적 요소를 연구하여 양방향 운동성의 메커니즘을 이해하는 것입니다.이 프로토콜은 효모 세포에서 과발현된 GFP형 전장 Cin8의 정제, 단일 분자 운동성 분석, 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 운동성 특성의 후속 분석을 종합적으로 설명한다. 이 분리는 Cin8의 방향성이 미세 소관 상의 클러스터에서의 축적에 의해 영향을 받기 때문에 중요합니다. 이 기술은 효모에서 다른 핵 단백질을 정제하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다.추가적으로, 이들의 형광 강도에 기초하여 크기 그룹으로 분리될 필요가 있는 임의의 형광 입자에 적용될 수 있다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실 관리자 인 Mary Popov 박사, Alina Goldstein-Levitin 박사와 박사후 연구원 인 Nurit Siegler 박사가 될 것입니다. Tatiana Zvagelsky, Mayan Sadan, Shira Hershfinkel, 대학원생; Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham, Meital Haberman, 우리 실험실의 학부생. 시작하려면, Cin8-GFP-6His의 과발현을 위한 플라스미드를 함유하는 사카로마이세스 세레비시아 세포를 섭씨 28도에서 2%라피노오스로 보충된 효모 선택 배지 한 리터에서 지수 성장 단계로 성장시킨다.그 후 2%갈락토오스를 첨가하여 Cin8-GFP-6His 과발현을 유도하고, 600나노미터에서 흡광도를 측정하여 효모 배양 성장을 모니터링하였다. 갈락토오스 첨가 다섯 시간 후, 원심분리에 의해 세포를 수확한다. 세포를 용해 완충액에 재현탁시키고 액체 질소에서 동결시킨다.다음으로, 냉각된 모르타르 및 유모차를 사용하여, 동결된 세포를 액체 질소에서 분쇄한다. 분쇄하는 동안 액체 질소를 계속 첨가하여 추출물이 동결 된 상태로 유지하십시오. 위상 또는 차등 간섭 대조 현미경으로 세포 용해를 모니터링하십시오.그런 다음 분쇄 된 세포를 해동하고 원심 분리하십시오. 상층액을 두 밀리리터의 니켈-NTA로 채워진 중력 흐름 컬럼에 적재하고 용해 버퍼로 사전 평형을 이룹니다. 상청액이 기둥을 통해 흘러 나오게하십시오.컬럼을 5 컬럼 부피의 용해 완충액으로 세척한 다음, 25-밀리몰 이미다졸로 보충된 용해 완충액의 5 컬럼 부피를 가한다. 그런 다음 용출 완충액으로 Cin8-GFP-6His를 용출시킨다. 용출된 샘플을 SDS-PAGE 분획화에 의해 분석하고, 이어서 쿠마시 블루 염색 및 항-GFP 항체로 프로브된 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.Cin8-GFP-6His를 함유하는 분획을 풀링한 후, 분당 0.5 밀리리터의 유속 및 1.5 메가파스칼의 컬럼 압력 한계에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 이들을 정제한다. 동시에 280 나노 미터에서 흡광도를 모니터링합니다. Cin8-GFP 사량체에 상응하는 분획을 수집하고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 분석한다.그런 다음 선택한 분수를 분취하고, 스냅 동결하고, 영하 80도에서 사용할 때까지 보관하십시오. 비오틴 및 로다민으로 표지된 미세소관을 중합 및 안정화시키기 위해, 반응 성분을 1.5-밀리리터 튜브에 혼합하고, 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 80 마이크로 리터의 따뜻한 일반 튜불린 버퍼를 넣고 조심스럽게 섞은 다음 원심 분리하십시오.상청액을 버리고, 50 마이크로리터의 따뜻한 일반 튜불린 완충액으로 위아래로 피펫팅하여 펠렛을 조심스럽게 재현탁한다. 그런 다음 서스펜션을 섭씨 28도 또는 37도에 보관하십시오. 647 나노 미터 로다민 채널을 사용하여 형광 현미경으로 미세 소관을 검사하십시오.그런 다음 테이프 스트립에서 보호 용지를 제거하고 스트립에 실란 화 된 커버 슬립을 배치하여 세 개의 10 마이크로 리터 부피 흐름 챔버를 만듭니다. 그런 다음 지시된 시약을 순차적으로 첨가하여 커버슬립의 아비딘 코팅을 수행한다. 커버슬립을 80 마이크로리터의 일반 튜불린 완충액으로 세척하기 전에 삼 내지 다섯 분 동안 인큐베이션한다.다음으로, 20 마이크로리터의 미세소관을 유동 챔버에 삽입하여 비오티닐화된 미세소관을 b-BSA/아비딘 코팅 커버슬립에 부착한다. 커버슬립이 아래를 향하도록 슬라이드를 어두운 습도 챔버에서 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션합니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 일반 튜불린 버퍼로 슬라이드를 씻으십시오.다음으로, 30 마이크로리터의 운동성 반응 믹스를 적용한 다음, 운동성 반응 믹스의 20 마이크로리터에 희석된 Cin8-GFP 모터를 유동 챔버 내로 적용하고, 즉시 미세소관을 따라 모터의 움직임을 이미지화하기 위해 진행한다. 모터 운동성 이미징의 경우, 현미경 목표에 침지 오일 한 방울을 놓은 다음 커버슬립이 목표를 향하도록 형광 현미경 스테이지에 유동 챔버를 놓습니다. 로다민 채널을 켜서 커버슬립 표면에 부착된 미세소관에 초점을 맞춥니다.그런 다음 ImageJ Micro-Manager 소프트웨어를 사용하여 20밀리초 노출로 이미지를 획득합니다. 그런 다음 GFP 채널을 켜고 1초 간격과 800밀리초 노출로 90개의 타임랩스 이미지를 획득합니다. ImageJ 피지 소프트웨어에서 타임랩스 동영상과 해당 미세소관 필드 이미지를 엽니다.분석을 선택한 다음 도구 및 Windows 동기화를 선택하여 이 두 창을 동기화합니다. 키모그래프를 얻으려면 세그먼트 라인 옵션을 사용하여 하나의 미세소관을 강조 표시합니다. 그런 다음 분석에서 다중 키모그래프 탭을 선택합니다.Cin8-GFP 분자의 클러스터 크기를 결정하려면 프로세스를 클릭하여 고르지 않은 조명에 대한 배경 뺄셈 및 보정을 수행 한 다음 배경 빼기를 수행하십시오. 롤링 볼 반경을 100픽셀로 설정하고 슬라이딩 포물선 옵션을 확인합니다. 그런 다음 ImageJ 피지 소프트웨어의 TrackMate 플러그인을 사용하여 특정 비운동성 Cin8-GFP 모터를 추적하십시오.플러그인을 선택한 다음 추적, TrackMate, LoG 검출기 및 단순 LAP 추적기를 선택하여 네 픽셀 반경의 원 내에서 시간의 함수로 Cin8-GFP 모터의 평균 형광 강도를 추적합니다. 다른 Cin8-GFP 모터에 대한 절차를 반복한 후 형광 강도를 시간 함수로 플로팅합니다. 다음으로, 미세소관 트랙을 따라 Cin8-GFP 분자의 운동성을 추적하기 위해, 기록된 프레임의 타임랩스 시퀀스에서 분석될 미세소관을 사각형 도구로 강조 표시하고 이미지를 클릭한 다음, 자르기를 행한다.분석을 위해 형광 Cin8-GFP 입자를 선택하십시오. 점 도구 및 측정(Measure) 옵션을 사용하여 타임랩스 시퀀스의 각 프레임에 파티클 좌표를 기록합니다. 유사하게, 타임랩스 서열에서 다른 형광 입자에 대한 좌표를 기록한다.그런 다음 앞에서 설명한 것처럼 외관의 첫 번째 프레임에서 검사된 모든 Cin8-GFP 입자에 클러스터 크기를 할당합니다. 다음으로, 지시된 공식과 결정된 Cin8-GFP 이동 좌표를 사용하여, 초기 좌표에 대하여 각 시점에서의 Cin8-GFP의 변위를 계산한다. 이러한 변위 값으로부터 지정된 Cin8-GFP 입자에 대해 가능한 모든 시간 간격에 대한 변위를 계산합니다.조사된 모든 Cin8-GFP 입자에 대해 이 과정을 반복한다. 마지막으로, 조사된 모든 Cin8-GFP 입자의 평균 변위 대 시간 간격을 플롯하고, 이를 선형 적합으로 적용한다. 이 적합의 기울기는 운동성 Cin8-GFP 입자의 평균 속도를 나타냅니다.단일 미세소관 상의 상이한 클러스터 크기의 양방향 모터 단백질 Cin8의 운동성 특성이 여기에 도시되어 있다. 각 군집 크기 범주에 대해, 개별 Cin8-GFP의 40개 이상의 궤적이 기록으로부터 추출되었다. 시간 간격의 함수로 Cin8 모터의 단일 분자 및 클러스터의 평균 변위를 플롯팅한 결과, 단일 Cin8-GFP 분자가 단방향 마이너스 엔드 지향 방식으로 고속으로 이동한다는 것을 입증했습니다.대조적으로, Cin8 클러스터는 더 낮은 속도와 더 높은 양방향 운동성을 나타낸다. 이 절차를 수행하는 동안 모터 클러스터링에 영향을 줄 수 있는 오염을 피하기 위해 고순도 모터 단백질을 사용해야 합니다. 모터 형광 강도를 분석 할 때 광 표백의 효과를 피하기 위해 모터가 나타나는 첫 번째 프레임에서 모터를 검사하는 것이 중요합니다.양방향 모터의 운동성을 연구 할 때 모터 클러스터링은 모터 방향성에 영향을 미치는 핵심 요소 중 하나이기 때문에 단일 분자와 클러스터를 별도로 분석하는 것이 매우 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

양 사체 (Transcriptome) 분석에있는 사용을위한 씨앗에서 매우 정제 된 RNA의 분리를위한 효율적인 방법

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

연구

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

간단 하 고 강력한, 높은 처리량 단일 분자 DNA에 따라 분자의 수송을 공부에 대 한 스트레칭 분석 결과 구현 흐름

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

세포성 글루타티온 S-트랜스퍼라제의 잠재적 억제제에 대한 분광측정 검사

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

작은 분자의 미세 결정 전자 회절

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...