Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Это исследование было частично поддержано грантом Израильского научного фонда (ISF-386/18) и грантом Израильского двустороннего научного фонда (BSF-2019008), присужденным L.G.

1. Подготовка буферов и реагентов
<ol><li>Буферов<ol>
<li>-Leu aa dropout mix: смешайте по 2 г аденина, урацила, триптофана, гистидина, лизина и метионина и храните при комнатной температуре.</li>
		<li>Дрожжевая селективная среда с рафинозой (1 л): Смешайте 6,7 г дрожжевой азотистой основы (с сульфато?...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

В данной работе представлен протокол анализа подвижности одной молекулы с двунаправленным кинезином-5 Cin8 и анализа подвижности. Полноразмерный Cin818 , включая сигнал собственной ядерной локализации (NLS) на С-терминале, был очищен от собственного хозяина S. cerevisiae. Посколь?...

Большое количество событий подвижности в эукариотических клетках опосредовано функцией молекулярных моторных белков. Эти двигатели движутся вдоль цитоскелетных нитей, актиновых нитей и микротрубочек (МТ) и преобразуют химическую энергию гидролиза АТФ в кинетические и механические силы, необходимые для управления биологической подвижностью внутри клеток. S. cerevisiae Cin8 на основе MT представляет собой биполярный гомотетрамерный моторный белок кинезин-5, который сшивает и скользит веретено MTs друг отдруга 1. Cin8 выполняет важнейшие функции при митозе, в веретенообразном сборе 2,3,4 и удлинении шпинделя при анафазе 5,6,7. Ранее было продемонстрировано, что Cin8 является двунаправленным двигателем, который переключает направленность в разных экспериментальных условиях. Например, в условиях высокой ионной прочности одиночные двигатели Cin8 движутся к минусовому концу MT, в то время как в кластерах, в многомоторных скользящих анализах MT и между противопараллельными MT двигатели Cin8 движутся в основном к плюсовым концам MTs 8,9,10,11,12 . Эти результаты были весьма неожиданными по нескольким причинам. Во-первых, Cin8 несет свой каталитический двигательный домен на амино-конце, и ранее считалось, что такие двигатели направлены исключительно плюс-конец, тогда как Cin8 был показан как минус-конец, направленный на уровень одной молекулы. Во-вторых, кинезиновые двигатели считались однонаправленными, либо минусовыми, либо плюс-концевыми, тогда как Cin8 был показан двунаправленным, в зависимости от условий эксперимента. Наконец, из-за ориентации МТ на митотическом шпинделе классическая роль двигателей кинезин-5 в разделении полюсов шпинделя при сборке шпинделя и анафазы B может быть объяснена только их направленной подвижностью на МТ, которые они сшивают 1,13. После первых сообщений о двунаправленности Cin8 было продемонстрировано, что несколько других кинезиновых двигателей являются двунаправленными 14,15,16, что указывает на то, что двунаправленная подвижность кинезиновых двигателей может быть более распространенной, чем считалось ранее.
Ранее сообщалось, что в клетках Cin8 также движется двунаправленным образом8, поддерживая представление о том, что двунаправленная подвижность некоторых двигателей кинезина-5 важна для их внутриклеточных функций. Кроме того, поскольку три двигателя кинезин-5, которые, как сообщалось, являются двунаправленными, получены из грибковых клеток, в таких клетках10 недавно была предложена возможная роль двунаправленности двигателей кинезин-5. Согласно этой модели, при закрытом митозе грибковых клеток, где ядерная оболочка не разрушается во время митоза, двигатели кинезина-5 обеспечивают начальную силу, которая разделяет полюса шпинделя друг от друга до сборки шпинделя. Для выполнения этой задачи до разделения полюсов шпинделя двигатели кинезин-5 локализуются вблизи полюсов шпинделя своей направленной подвижностью на одиночных ядерных МТ. Оказавшись в этом положении, двигатели кинезин-5 группируются, переключают направленность, захватывают и сшивают МТ с соседних полюсов шпинделя. Впоследствии двигатели кинезин-5 обеспечивают начальное разделение полюсов за счет плюсовой направленной подвижности на МТ, которые они сшивают. В соответствии с этой моделью как направленная подвижность на одиночных МТ, так и направленная подвижность на сшитых МТ во время антипараллельного скольжения необходимы для выполнения грибковых двигателей кинезин-5 для выполнения своих ролей в сборке шпинделя 1,13.
Общей целью описанного способа является получение высокочистого грибка GFP-меченого кинезина-5 Cin8 и выполнение анализа подвижности одной молекулы (рисунок 1) при отдельном анализе подвижности отдельных молекул и кластеров Cin8. Разделение между отдельными молекулами и кластерами важно, поскольку одним из факторов, которые, как было продемонстрировано, влияют на направленность Cin8, является его накопление в кластерах на MTs10,12. Альтернативные анализы подвижности, такие как поверхностное скольжение MT и скользящие анализы MT, не дают информации об активности одиночных моторных белков17,18. Надежные одномолекулярные методы анализа подвижности и анализа, описанные здесь, были успешно применены для характеристики различных аспектов двигателей кинезин-5, Cin8 и Kip1 10,11,12,14,19,20.
Здесь представлен подробный протокол для сверхэкспрессии и очистки Cin8, полимеризации МТ и анализа подвижности одной молекулы. Кроме того, описаны анализы для дифференциации отдельных молекул и кластеров Cin8, а также для определения одиночных моторных и кластерных скоростей с помощью анализа среднего смещения (MD) и среднего квадратного смещения (MSD). Этот протокол призван помочь исследователям визуализировать все этапы процедур и помочь в устранении неполадок этого типа анализов.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление анализа подвижности одной молекулы. Биотинилированные флуоресцентные МТ прикреплены к поверхности стекла, покрытой авидином, который взаимодействует с поверхностно присоединенным биотинилированным BSA. Зеленая стрелка представляет направление движения отдельных молекул Cin8 в условиях высокой ионной прочности. +/- представляют полярность MT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

Митотические биполярные двигатели кинезин-5 выполняют важные функции в динамике шпинделя. Эти двигатели демонстрируют гомотетрамерную структуру с двумя парами каталитических моторных доменов, расположенных на противоположных концах активного комплекса. Эта уникальная архитектура позволяет двигателям кинезина-5 сшивать и раздвигать антипараллельные шпиндельные микротрубочки (МТ), обеспечивая тем самым направленную наружу силу, которая разделяет полюса шпинделя друг от друга. Ранее считалось, что двигатели кинезин-5 направлены исключительно с плюс-концом. Однако недавние исследования показали, что несколько грибковых двигателей кинезин-5 направлены на уровень одной молекулы и могут переключать направленность в различных экспериментальных условиях. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 является примером такого двунаправленного моторного белка: в условиях высокой ионной прочности отдельные молекулы Cin8 движутся в направлении минус-конца MTs. Также было показано, что Cin8 образует подвижные кластеры, преимущественно на минусовом конце МТ, и такая кластеризация позволяет Cin8 переключать направленность и подвергаться медленной, плюс-конечной направленной подвижности. В этой статье представлен подробный протокол для всех этапов работы с GFP-меченым кинезином-5 Cin8, от гиперэкспрессии белка в клетках S. cerevisiae и его очистки до анализа подвижности одной молекулы in vitro . Недавно разработанный метод, описанный здесь, помогает дифференцировать отдельные молекулы и кластеры Cin8 на основе их интенсивности флуоресценции. Этот метод позволяет проводить раздельный анализ подвижности отдельных молекул и кластеров Cin8, обеспечивая тем самым характеристику зависимости подвижности Cin8 от размера кластера.

Эксперимент направлен на исследование характеристик подвижности двунаправленного моторного белка Cin8 различных размеров кластера на одиночных МТ. Репрезентативная подвижность Cin8-GFP также очевидна из кимографов на рисунке 5А, где показано пространственное положение д?...

Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Двунаправленный митотический кинезин-5 Cin8 накапливается в кластерах, которые расщепляются и сливаются во время их подвижности. Накопление в кластерах также изменяет скорость и направленность Cin8. Здесь описан протокол анализа подвижности с очищенным Cin8-GFP и анализа подвижных свойств отдельных молекул и кластеров Cin8.

Подвижность одиночных молекул и кластеров двунаправленного кинезина-5 Cin8, очищенного из клеток S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 является двунаправленным моторным белком. Cin8 движется в направлении минусового конца микротрубочек как единая молекула и изменяет направленность в ряде различных экспериментальных условий. Общая цель нашего исследования состоит в том, чтобы понять механизм двунаправленной подвижности путем изучения факторов и структурных элементов, которые регулируют двунаправленную подвижность Cin8.Этот протокол всесторонне объясняет очистку полноразмерного Cin8 типа GFP, перевозимого в дрожжевых клетках, анализ подвижности одной молекулы и последующий анализ подвижных свойств отдельных молекул и кластеров Cin8. Это разделение важно, так как на направленность Cin8 влияет его накопление в кластерах на микротрубочках. Этот метод может быть легко адаптирован для очистки других ядерных белков от дрожжей.Кроме того, он может быть применен к любым флуоресцентным частицам, которые необходимо разделить на группы размеров в зависимости от их интенсивности флуоресценции. Демонстрировать процедуру будут д-р Мария Попова, наш заведующий лабораторией, д-р Алина Гольдштейн-Левитин и д-р Нурит Зиглер, постдокторанты; Татьяна Звагельски, Майян Садан и Шира Хершфинкель, аспиранты; и Нета Янир, Яхель Абрахам, Рой Авраам и Мейтал Хаберман, студенты нашей лаборатории. Для начала вырастите клетки Saccharomyces cerevisiae, содержащие плазмиду для сверхэкспрессии Cin8-GFP-6His в фазу экспоненциального роста в одном литре дрожжеселективной среды, дополненной 2%-рафинозой при 28 градусах Цельсия.Затем индуцируйте сверхэкспрессию Cin8-GFP-6His, добавляя 2% галактозы, и контролируйте рост культуры дрожжей, измеряя поглощение на 600 нанометрах. Через пять часов после добавления галактозы собирают клетки методом центрифугирования. Повторно приостановите клетки в буфере лизиса и заморозьте их в жидком азоте.Далее, используя охлажденный раствор и пестик, измельчаем замороженные клетки в жидком азоте. Продолжайте добавлять жидкий азот во время измельчения, чтобы экстракты оставались замороженными. Контролируйте лизис клеток под фазовым или дифференциальным интерференционным контрастным микроскопом.Затем разморозьте наземные ячейки и центрифугируйте их. Загрузите супернатант на гравитационный столб, заполненный двумя миллилитрами никеля-НТА, и предварительно уравновешивайте его буфером лизиса. Пусть супернатант вытекает через колонну.Промыть колонну с пятью колонными объемами лизисного буфера, за которыми следуют пять колонных объемов лизисного буфера, дополненного 25-миллимолярным имидазолом. Затем элюируют Cin8-GFP-6His с помощью буфера элюирования. Анализ элюированных образцов методом фракционирования SDS-PAGE с последующим синим окрашиванием Coomassie и анализом вестерн-блот, исследуемым антителами против GFP.После объединения фракций, содержащих Cin8-GFP-6His, очищают их с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии со скоростью потока 0,5 миллилитра в минуту и пределом давления колонки 1,5 мегапаскалей. Одновременно контролируйте поглощение на 280 нанометров. Соберите фракции, соответствующие тетрамеру Cin8-GFP, и проанализируйте их с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.Затем аликвотируйте выбранные фракции, замораживайте и храните до использования при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы полимеризовать и стабилизировать микротрубочки, меченые биотином и родамином, смешайте компоненты реакции в 1,5-миллилитровой пробирке и инкубируйте смесь в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. Затем добавьте 80 микролитров теплого общего тубулинового буфера, тщательно перемешайте и центрифугируйте.Выбросьте супернатант и осторожно приостановите гранулу, пипеткой вверх и вниз 50 микролитров теплого общего буфера тубулина. Затем храните суспензию при 28 или 37 градусах Цельсия. Исследуйте микротрубочки с помощью флуоресцентного микроскопа, используя 647-нанометровый родаминовый канал.Затем снимите защитную бумагу с ленточных полосок и поместите силанизированный покровный лист на полосы, чтобы создать три 10-микролитрные объемные проточные камеры. Затем выполняют авидиновое покрытие крышки путем последовательного добавления указанных реагентов. Инкубируйте крышку в течение трех-пяти минут, прежде чем промыть ее 80 микролитрами общего тубулинового буфера.Затем присоедините биотинилированные микротрубочки к покрытым b-BSA/авидином покровам, вставив 20 микролитров микротрубочек в проточную камеру. Высиживайте горки с помощью крышки, обращенной вниз в темной камере влажности в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем промыть горки 200 микролитрами общего тубулинового буфера.Затем нанесите 30 микролитров реакционной смеси подвижности, затем двигатели Cin8-GFP, разбавленные в 20 микролитрах реакционной смеси подвижности, в проточную камеру, и сразу же приступайте к изображению движения двигателей вдоль микротрубочек. Для визуализации подвижности двигателя поместите каплю погружного масла на объектив микроскопа, затем поместите проточную камеру на ступень флуоресцентного микроскопа, причем крышка обращена к объективу. Включите родаминовый канал, чтобы сфокусироваться на микротрубочках, прикрепленных к поверхности крышки.Затем, используя программное обеспечение ImageJ Micro-Manager, получите изображение с 20-миллисекундной экспозицией. Затем включите канал GFP и получите 90 покадровых изображений с интервалом в одну секунду и экспозицией 800 миллисекунд. В программном обеспечении ImageJ Fiji откройте покадровый ролик и соответствующее изображение поля микротрубочки.Синхронизируйте эти два окна, выбрав Анализ, а затем Сервис и Синхронизировать Окна. Чтобы получить кимограф, выделите одну микротрубочку с помощью опции Сегментированная линия. Затем в разделе Анализ выберите вкладку Мульти Кимограф.Чтобы определить размер кластера молекул Cin8-GFP, выполните вычитание фона и коррекцию неравномерного освещения, щелкнув Процесс, а затем Вычтите фон. Установите радиус шарика в 100 пикселей и установите флажок Скользящий параболоид. Затем отслеживайте конкретный неподвижный двигатель Cin8-GFP с помощью плагина TrackMate программного обеспечения ImageJ Fiji.Выберите плагины, за которыми следуют Tracking, TrackMate, Детектор LoG и Simple LAP tracker, чтобы следовать средней интенсивности флуоресценции двигателя Cin8-GFP в зависимости от времени в радиусе круга в четыре пикселя. После повторения процедуры для различных двигателей Cin8-GFP постройте график интенсивности флуоресценции как функцию времени. Затем, чтобы отслеживать подвижность молекул Cin8-GFP вдоль дорожек микротрубочек, обрежьте микротрубочки, подлежащие анализу, в покадровой последовательности записанных кадров, выделив ее с помощью инструмента «Прямоугольник» и щелкнув «Изображение», а затем «Обрезка».Выберите флуоресцентную частицу Cin8-GFP для анализа. Записывайте координаты частиц в каждом кадре покадровой последовательности с помощью инструмента «Точка» и параметров «Измерение». Аналогично записывайте координаты для других флуоресцентных частиц в покадровой последовательности.Затем назначьте размер кластера всем исследованным частицам Cin8-GFP в первом кадре их появления, как было продемонстрировано ранее. Далее, используя указанную формулу и заданные координаты движения Cin8-GFP, вычисляют смещения Cin8-GFP в каждой точке времени относительно исходных координат. Исходя из этих значений смещения, вычислите смещение для всех возможных временных интервалов для заданной частицы Cin8-GFP.Повторите процедуру для всех исследованных частиц Cin8-GFP. Наконец, постройте график среднего смещения всех исследованных частиц Cin8-GFP по отношению к временному интервалу и подвергните его линейному соответствию. Наклон этого прилегания представляет собой среднюю скорость подвижных частиц Cin8-GFP.Здесь показаны характеристики подвижности двунаправленного моторного белка Cin8 различных размеров кластера на одиночных микротрубочках. Для каждой категории размеров кластера из записей было извлечено более 40 траекторий отдельных Cin8-GFP. Построение средних смещений отдельных молекул и кластеров двигателей Cin8 в зависимости от временного интервала показало, что отдельные молекулы Cin8-GFP движутся однонаправленным образом с высокой скоростью.Напротив, кластеры Cin8 демонстрируют более низкую скорость и более высокую двунаправленную подвижность. При выполнении этой процедуры необходимо использовать моторный белок высокой чистоты, чтобы избежать любых загрязнений, которые могут повлиять на моторную кластеризацию. При анализе интенсивности флуоресценции двигателя важно рассмотреть двигатели в первом кадре, чтобы они появились, чтобы избежать эффекта фотоотбеливания.При изучении подвижности двунаправленных двигателей крайне важно отдельно анализировать отдельные молекулы и кластеры, так как моторная кластеризация является одним из ключевых факторов, влияющих на направленность движения.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Простая, прочная и высокая пропускная способность одной молекулы потока растяжения Assay осуществления для изучения транспорт молекул вдоль ДНК

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Сочетая рентгеноструктурного анализа с малоуглового рентгеновского рассеяния для моделирования неструктурированных регионов Nsa1 от S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Спектрофотометрический скрининг на потенциальные ингибиторы цитозоловых глутатиона S-transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Микрокристаллическая дифракция электронов малых молекул

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Оценка локализации субпохондриального белка в почковых дрожжах Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...