Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada en parte por la subvención de la Fundación de Ciencias de Israel (ISF-386/18) y la subvención de la Fundación Binacional de Ciencias de Israel (BSF-2019008), otorgada a L.G.

1. Preparación de tampones y reactivos
<ol><li>Búferes<ol>
<li>-Mezcla de gotas de Leu aa: Mezclar 2 g cada uno de Adenina, Uracilo, Triptófano, Histidina, Lisina y Metionina y almacenar a temperatura ambiente.</li>
		<li>Medio selectivo de levadura con rafinosa (1 L): Mezcle 6,7 g de base de nitrógeno de levadura (con sulfato de amonio), 2 g de mezcla de gota de -Leu aa y 20 g de rafinosa en agua de doble destilación revolviendo (sin calentar) hasta que se disuelva por completo. Con un filtro de ...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

En este trabajo se presenta un protocolo para el ensayo de motilidad monomolécula con la kinesina-5 Cin8 bidireccional y el análisis de motilidad. El Cin818 de longitud completa, incluida la señal de localización nuclear nativa (NLS) en el terminal C, se ha purificado del huésped nativo S. cerevisiae. Como el Cin8 es una proteína motora nuclear, la molienda de las células de S. cerevisiae bajo nitrógeno líquido se encuentra como el método más eficiente para la lisis ce...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63425">Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells</a>. The Authors section was updated.
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Roy Abraham
to:
Roy Avraham

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63425">Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Un gran número de eventos de motilidad dentro de las células eucariotas están mediados por la función de las proteínas motoras moleculares. Estos motores se mueven a lo largo de los filamentos citoesqueléticos, filamentos de actina y microtúbulos (TM), y convierten la energía química de la hidrólisis de ATP en fuerzas cinéticas y mecánicas necesarias para impulsar la motilidad biológica dentro de las células. La S. cerevisiae Cin8 basada en MT es una proteína motora bipolar homotetramérica de quinesina-5 que se entrelaza y desliza las MT del huso1. Cin8 realiza funciones esenciales durante la mitosis, en el ensamblaje del huso 2,3,4 y el alargamiento del huso durante la anafase 5,6,7. Anteriormente, se había demostrado que Cin8 es un motor bidireccional, que cambia la direccionalidad bajo diferentes condiciones experimentales. Por ejemplo, en condiciones de alta resistencia iónica, los motores Cin8 individuales se mueven hacia el extremo inferior de los MT, mientras que en los grupos, en los ensayos de deslizamiento MT multimotor y entre los MT antiparalelos, los motores Cin8 se mueven principalmente hacia los extremos superiores de los MT 8,9,10,11,12 . Estos hallazgos fueron altamente inesperados debido a varias razones. En primer lugar, Cin8 lleva su dominio motor catalítico en el extremo amino y anteriormente se creía que tales motores estaban dirigidos exclusivamente al extremo más, mientras que se demostró que el Cin8 estaba dirigido al extremo inferior dirigido al nivel de una sola molécula. En segundo lugar, se creía que los motores de kinesina eran unidireccionales, ya sea de extremo inferior o de extremo más, mientras que se demostró que Cin8 era bidireccional, dependiendo de las condiciones experimentales. Finalmente, debido a la orientación MT en el huso mitótico, el papel clásico de los motores de kinesina-5 en la separación de los polos del husillo durante el ensamblaje del husillo y la anafase B solo podría explicarse por su motilidad dirigida de extremo superior en los MT que se entrecruzan 1,13. Después de los primeros informes sobre la bidireccionalidad de Cin8, se demostró que algunos otros motores de kinesina son bidireccionales 14,15,16, lo que indica que la motilidad bidireccional de los motores de quinesina puede ser más común de lo que se creía anteriormente.
Se ha informado previamente que en las células, Cin8 también se mueve de manera bidireccional8, apoyando la noción de que la motilidad bidireccional de algunos motores de quinesina-5 es importante para sus funciones intracelulares. Además, dado que los tres motores de quinesina-5 que se informó que eran bidireccionales son de células fúngicas, recientemente se ha propuesto un posible papel para la bidireccionalidad de los motores de quinesina-5 en tales células10. Según este modelo, en la mitosis cerrada de las células fúngicas, donde la envoltura nuclear no se descompone durante la mitosis, los motores de kinesina-5 proporcionan la fuerza inicial que separa los polos del huso antes del ensamblaje del huso. Para realizar esta tarea, antes de la separación de los polos del husillo, los motores de kinesina-5 se localizan cerca de los polos del husillo, por su motilidad dirigida de extremo negativo en MT nucleares individuales. Una vez en esta posición, los motores de kinesina-5 se agrupan, cambian la direccionalidad, capturan y entrecruzan los MT de los polos del husillo vecinos. Posteriormente, los motores de kinesina-5 proporcionan la separación inicial de los polos por motilidad dirigida de extremo más en los MT que se entrecruzan. Según este modelo, tanto la motilidad dirigida de extremo inferior en MT individuales como la motilidad dirigida de extremo más en MT reticuladas durante el deslizamiento antiparalelo son necesarias para que los motores de kinesina-5 fúngica desempeñen sus funciones en el ensamblaje del husillo 1,13.
El objetivo general del método descrito es obtener cin8 fúngico de alta pureza marcado con GFP Cin8 y realizar ensayos de motilidad de molécula única (Figura 1) mientras se analiza por separado la motilidad de moléculas individuales y grupos de Cin8. La separación entre moléculas individuales y clusters es importante ya que uno de los factores que se ha demostrado que afectan a la direccionalidad de Cin8 es su acumulación en clusters en los MTs10,12. Los ensayos de motilidad alternativos, como los ensayos de deslizamiento de superficie MT y deslizamiento MT no proporcionan información sobre la actividad de proteínas motoras individuales17,18. Los robustos métodos de ensayo y análisis de motilidad de una sola molécula descritos aquí se han aplicado con éxito para caracterizar diferentes aspectos de los motores de kinesina-5, Cin8 y Kip1 10,11,12,14,19,20.
Aquí, se presenta un protocolo detallado para la sobreexpresión y purificación de Cin8, la polimerización de MT y el ensayo de motilidad de molécula única. Además, también se describen los análisis para diferenciar entre moléculas individuales y grupos de Cin8, y para determinar las velocidades de un solo motor y de clúster mediante el análisis de desplazamiento medio (DM) y desplazamiento cuadrado medio (MSD). Este protocolo tiene como objetivo ayudar a los investigadores a visualizar todos los pasos de los procedimientos y ayudar con la solución de problemas de este tipo de ensayos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del ensayo de motilidad de una sola molécula. Los MT fluorescentes biotinilados se unen a la superficie del vidrio, recubiertos con Avidin que interactúa con el BSA biotinilado a la superficie. La flecha verde representa la dirección de movimiento de moléculas individuales de Cin8 en condiciones de alta resistencia iónica. +/- representa la polaridad de la MT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

Los motores mitotic bipolares kinesina-5 realizan funciones esenciales en la dinámica del huso. Estos motores exhiben una estructura homo-tetramérica con dos pares de dominios motores catalíticos, ubicados en extremos opuestos del complejo activo. Esta arquitectura única permite que los motores de kinesina-5 se entrecrucen y deslicen los microtúbulos (TM) del husillo antiparalelo, proporcionando así la fuerza dirigida hacia afuera que separa los polos del husillo. Anteriormente, se creía que los motores de kinesina-5 estaban dirigidos exclusivamente al extremo superior. Sin embargo, estudios recientes revelaron que varios motores fúngicos de quinesina-5 son de extremo negativo dirigidos al nivel de una sola molécula y pueden cambiar de direccionalidad bajo diversas condiciones experimentales. La quinasina-5 Cin8 de Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo de dicha proteína motora bidireccional: en condiciones de alta fuerza iónica, las moléculas individuales de Cin8 se mueven en la dirección del extremo inferior de los MT. También se demostró que Cin8 forma cúmulos móviles, predominantemente en el extremo inferior de los MT, y dicho agrupamiento permite que Cin8 cambie de direccionalidad y experimente una motilidad dirigida lenta y más al final. Este artículo proporciona un protocolo detallado para todos los pasos de trabajo con kinesina-5 Cin8 marcada con GFP, desde la sobreexpresión de proteínas en células de S. cerevisiae y su purificación hasta el ensayo de motilidad de molécula única in vitro . Un método recientemente desarrollado que se describe aquí ayuda a diferenciar entre moléculas individuales y grupos de Cin8, en función de su intensidad de fluorescencia. Este método permite un análisis separado de la motilidad de moléculas individuales y grupos de Cin8, proporcionando así la caracterización de la dependencia de la motilidad de Cin8 en su tamaño de racimo.

El experimento tiene como objetivo investigar las características de motilidad de la proteína motora bidireccional Cin8 de diferentes tamaños de grupo en TM individuales. La motilidad representativa de Cin8-GFP también es evidente en los kymographs de la Figura 5A, donde se muestra la posición espacial del motor a lo largo del tiempo.
Para el análisis de las propiedades móviles de Cin8-GFP, primero, se asigna el tamaño del clúster (paso 4.3) a cada partí...

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Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

La kinesina-5 Cin8 mitótica bidireccional se acumula en grupos que se dividen y fusionan durante su motilidad. La acumulación en grupos también cambia la velocidad y direccionalidad de Cin8. Aquí, se describe un protocolo para ensayos de motilidad con Cin8-GFP purificado y análisis de propiedades móviles de moléculas individuales y grupos de Cin8.

Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

La Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 es una proteína motora bidireccional. Cin8 se mueve en la dirección del extremo inferior de los microtúbulos como una sola molécula, y cambia la direccionalidad bajo una serie de condiciones experimentales diferentes. El objetivo general de nuestra investigación es comprender el mecanismo de la motilidad bidireccional mediante el estudio de factores y elementos estructurales que regulan la motilidad bidireccional de Cin8.Este protocolo explica exhaustivamente la purificación de Cin8 de longitud completa tipo GFP sobreexpresado en células de levadura, el ensayo de motilidad de molécula única y el posterior análisis de las propiedades móviles de moléculas individuales y grupos de Cin8. Esta separación es importante, ya que la direccionalidad de Cin8 se ve afectada por su acumulación en grupos en el microtúbulo. Esta técnica se puede adaptar fácilmente para purificar otras proteínas nucleares de la levadura.Además, se puede aplicar a cualquier partícula fluorescente que deba separarse en grupos de tamaño en función de su intensidad de fluorescencia. Mary Popov, nuestra gerente de laboratorio, la Dra. Alina Goldstein-Levitin, y la Dra. Nurit Siegler, becarias postdoctorales; Tatiana Zvagelsky, Maya Sadan, y Shira Hershfinkel, estudiantes de posgrado; y Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham y Meital Haberman, estudiantes de pregrado de nuestro laboratorio. Para comenzar, cultive células de Saccharomyces cerevisiae que contengan el plásmido para la sobreexpresión de Cin8-GFP-6Sí a la fase de crecimiento exponencial en un litro de medio selectivo de levadura, complementado con 2% rafinosa a 28 grados centígrados.Luego induzca la sobreexpresión de Cin8-GFP-6His agregando 2% de galactosa, y monitoree el crecimiento del cultivo de levadura midiendo la absorbancia a 600 nanómetros. Cinco horas después de la adición de galactosa, cosechar las células por centrifugación. Vuelva a suspender las células en tampón de lisis y congélelas en nitrógeno líquido.A continuación, utilizando un mortero refrigerado y un mortero, moler las células congeladas en nitrógeno líquido. Siga agregando nitrógeno líquido durante la molienda, de modo que los extractos permanezcan congelados. Monitoree la lisis celular bajo un microscopio de contraste de fase o interferencia diferencial.Luego descongele las celdas de tierra y centrífuguelas. Cargue el sobrenadante en una columna de flujo por gravedad llena de dos mililitros de níquel-NTA y equilibre previamente con un tampón de lisis. Deje que el sobrenadante fluya a través de la columna.Lave la columna con cinco volúmenes de columna de tampón de lisis, seguido de cinco volúmenes de columna de tampón de lisis complementados con imidazol de 25 milimolares. A continuación, eluya el Cin8-GFP-6His con tampón de elución. Analizar las muestras eluidas por fraccionamiento SDS-PAGE, seguido de tinción azul de Coomassie y análisis de Western blot sondeado con anticuerpos anti-GFP.Después de agrupar las fracciones que contienen Cin8-GFP-6His, purificarlas mediante cromatografía de exclusión de tamaño a un caudal de 0,5 mililitros por minuto y un límite de presión de columna de 1,5 megapascales. Monitoree simultáneamente la absorbancia a 280 nanómetros. Recoger las fracciones correspondientes al tetrámero Cin8-GFP y analizarlas mediante SDS-PAGE y Western blotting.Luego alícuota las fracciones seleccionadas, congele y almacene hasta su uso a menos 80 grados centígrados. Para polimerizar y estabilizar los microtúbulos marcados con biotina y rodamina, mezcle los componentes de la reacción en un tubo de 1,5 mililitros e incube la mezcla durante una hora a 37 grados centígrados. Luego agregue 80 microlitros de tampón de tubulina general caliente, mezcle con cuidado y centrífuga.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con cuidado mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo con 50 microlitros de tampón de tubulina general caliente. Luego guarde la suspensión a 28 o 37 grados centígrados. Examine los microtúbulos con un microscopio de fluorescencia, utilizando el canal de rodamina de 647 nanómetros.A continuación, retire el papel protector de las tiras de cinta y coloque una cubierta silanizada en las tiras para crear tres cámaras de flujo de volumen de 10 microlitros. A continuación, realice el recubrimiento de avidina de la cubierta mediante la adición secuencial de los reactivos indicados. Incubar el cubrehojas durante tres a cinco minutos antes de lavarlo con 80 microlitros de tampón de tubulina general.A continuación, conecte los microtúbulos biotinilados a los cobertores recubiertos de b-BSA / avidina insertando 20 microlitros de microtúbulos en la cámara de flujo. Incubar los portaobjetos con la cubierta hacia abajo en una cámara de humedad oscura durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego lave las diapositivas con 200 microlitros de tampón de tubulina general.A continuación, aplique 30 microlitros de mezcla de reacción de motilidad seguidos de motores Cin8-GFP diluidos en 20 microlitros de la mezcla de reacción de motilidad en la cámara de flujo, e inmediatamente proceda a obtener imágenes del movimiento de los motores a lo largo de los microtúbulos. Para las imágenes de motilidad motora, coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo del microscopio, luego coloque la cámara de flujo en la etapa del microscopio fluorescente, con la cubierta orientada hacia el objetivo. Encienda el canal de rodamina para enfocar los microtúbulos unidos a la superficie de la cubierta.Luego, utilizando el software ImageJ Micro-Manager, adquiera la imagen con una exposición de 20 milisegundos. A continuación, encienda el canal GFP y adquiera 90 imágenes de lapso de tiempo con un intervalo de un segundo y una exposición de 800 milisegundos. En el software ImageJ Fiji, abra la película de lapso de tiempo y la imagen de campo de microtúbulos correspondiente.Sincronice estas dos ventanas eligiendo Analizar, seguido de Herramientas y Sincronizar ventanas. Para obtener un kymograph, resalte un microtúbulo usando la opción Línea segmentada. A continuación, en Analizar, seleccione la pestaña Multi Kymograph.Para determinar el tamaño del clúster de las moléculas Cin8-GFP, realice la sustracción y corrección de fondo para una iluminación desigual haciendo clic en Procesar, seguido de Restar fondo. Establezca el radio de la bola rodante en 100 píxeles y marque la opción Paraboloide deslizante. A continuación, realice un seguimiento de un motor Cin8-GFP no móvil específico utilizando el complemento TrackMate del software ImageJ Fiji.Elija Plugins, seguido de Tracking, TrackMate, LoG detector y Simple LAP tracker para seguir la intensidad media de fluorescencia del motor Cin8-GFP en función del tiempo dentro de un círculo de cuatro píxeles de radio. Después de repetir el procedimiento para diferentes motores Cin8-GFP, trace las intensidades de fluorescencia en función del tiempo. A continuación, para rastrear la motilidad de las moléculas Cin8-GFP a lo largo de las pistas de microtúbulos, recorte los microtúbulos que se analizarán en la secuencia de lapso de tiempo de los fotogramas grabados resaltándolo con la herramienta de rectángulo y haciendo clic en Imagen, seguido de Recortar.Elija una partícula fluorescente Cin8-GFP para el análisis. Registre las coordenadas de partícula en cada fotograma de la secuencia de lapso de tiempo utilizando la herramienta de punto y las opciones Medir. Del mismo modo, registre las coordenadas de otras partículas fluorescentes en la secuencia de lapso de tiempo.A continuación, asigne el tamaño del clúster a todas las partículas Cin8-GFP examinadas en el primer fotograma de su aparición, como se demostró anteriormente. A continuación, utilizando la fórmula indicada y las coordenadas de movimiento Cin8-GFP determinadas, calcule los desplazamientos de Cin8-GFP en cada punto de tiempo con respecto a las coordenadas iniciales. A partir de estos valores de desplazamiento, calcule el desplazamiento para todos los intervalos de tiempo posibles para una partícula Cin8-GFP especificada.Repita el procedimiento para todas las partículas Cin8-GFP examinadas. Finalmente, grafique el desplazamiento medio de todas las partículas Cin8-GFP examinadas frente al intervalo de tiempo, y sometalo a un ajuste lineal. La pendiente de este ajuste representa la velocidad media de las partículas móviles de Cin8-GFP.Las características de motilidad de la proteína motora bidireccional Cin8 de diferentes tamaños de racimo en microtúbulos individuales se muestran aquí. Para cada categoría de tamaño de clúster, se extrajeron más de 40 trayectorias de Cin8-GFP individuales de las grabaciones. El trazado de los desplazamientos medios de moléculas individuales y grupos de motores Cin8 en función del intervalo de tiempo demostró que las moléculas individuales de Cin8-GFP se mueven de una manera unidireccional menos dirigida al extremo con alta velocidad.En contraste, los cúmulos Cin8 exhiben una menor velocidad y una mayor motilidad bidireccional. Al realizar este procedimiento, se debe usar proteína motora de alta pureza para evitar cualquier contaminación que pueda afectar la agrupación motora. Al analizar la intensidad de la fluorescencia motora, es importante examinar los motores en el primer marco en que aparecen, para evitar el efecto del fotoblanqueo.Al estudiar la motilidad de los motores bidireccionales, es extremadamente importante analizar por separado moléculas individuales y grupos, ya que la agrupación motora es uno de los factores clave que afectan la direccionalidad motora.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Un método eficiente para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas para uso en el Análisis Cuantitativo de transcriptoma

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Investigación

Bioquímica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Examen espectrofotométrico para posibles inhibidores de la citosola glutatión S-transferasas

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Difracción de electrones de microcristales de moléculas pequeñas

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...