Name: motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Bu araştırma kısmen İsrail Bilim Vakfı hibesi (ISF-386/18) ve L.G.'ye verilen İsrail İki Uluslu Bilim Vakfı hibesi (BSF-2019008) tarafından desteklenmiştir.

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Arabellek<ol>
<li>-Leu aa bırakma karışımı: Adenin, Uracil, Triptofan, Histidin, Lizin ve Metiyonin'in her birini 2 g karıştırın ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>Rafinozlu maya seçici ortam (1 L): 6.7 g maya azot baz (amonyum sülfat ile), 2 g -Leu aa bırakma karışımı ve 20 g rafinozu çift damıtılmış suda tamamen çözünene kadar karıştırarak (ısıtmadan) karıştırın. 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak, çö...

<ol>
	<li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins:+structural+determinants,+cumulative+functions+and+physiological+roles.">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations.">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li><li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle.">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li><li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly.">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein.">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li><li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation.">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li><li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells.">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li><li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8,+ionic+strength+and+microtubule+geometry.">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling.">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li><li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis.">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li><li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking.">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036 (2021).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis.">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).</li><li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions.">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).</li><li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo.">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li><li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5,+Cut7.">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li><li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch.">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999 (2017).</li><li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding.">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131 (2020).</li><li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li><li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8.">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li><li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain.">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism.">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1.">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li><li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots.">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KymoBulter,+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis.">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288 (2019).</li></ol>

Bu çalışmada, çift yönlü kinezin-5 Cin8 ile tek moleküllü motilite testi için bir protokol ve motilitenin analizi sunulmuştur. C-terminalindeki doğal nükleer lokalizasyon sinyalini (NLS) içeren tam uzunluktakiCin8 18 , yerli konakçı S. cerevisiae'den arındırılmıştır. Cin8 bir nükleer motor proteini olduğundan, S. cerevisiae hücrelerinin sıvı azot altında öğütülmesi, hücre lizisi için en etkili yöntem olarak bulunmuştur. Lizisten sonra, metal afi...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63425">Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells</a>. The Authors section was updated.
One of the author names was updated from:
Roy Abraham
to:
Roy Avraham

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63425">Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Ökaryotik hücrelerdeki çok sayıda hareketlilik olayı, moleküler motor proteinlerin işlevi tarafından aracılık edilir. Bu motorlar sitoiskelet filamentleri, aktin filamentleri ve mikrotübüller (MTs) boyunca hareket eder ve ATP hidrolizinin kimyasal enerjisini, hücreler içindeki biyolojik hareketliliği yönlendirmek için gereken kinetik ve mekanik kuvvetlere dönüştürür. MT bazlı S. cerevisiae Cin8, iş mili MT'lerini çapraz bağlayan ve kaydıran bipolar, homotetramerik kinesin-5 motor proteinidir1. Cin8, mitoz sırasında, iş mili montajı 2,3,4'te ve anafaz 5,6,7 sırasında iş mili uzamasında temel işlevleri yerine getirir. Daha önce, Cin8'in farklı deneysel koşullar altında yönselliği değiştiren çift yönlü bir motor olduğu gösterilmişti. Örneğin, yüksek iyonik mukavemet koşulları altında, tek Cin8 motorları MT'lerin eksi ucuna doğru hareket ederken, kümelerde, çok motorlu MT kayma testlerinde ve antiparalel MT'ler arasında, Cin8 motorları esas olarak MTs 8,9,10,11,12'nin artı uçlarına doğru hareket eder. . Bu bulgular birkaç nedenden dolayı oldukça beklenmedikti. İlk olarak, Cin8 katalitik motor alanını amino terminusta taşır ve bu tür motorların daha önce sadece artı uçlu yönlendirildiğine inanılıyordu, oysa Cin8'in eksi uçlu tek molekül seviyesinde yönlendirildiği gösterildi. İkincisi, kinesin motorlarının eksi uçlu veya artı uçlu tek yönlü olduğuna inanılıyordu, oysa Cin8'in deneysel koşullara bağlı olarak çift yönlü olduğu gösterildi. Son olarak, mitotik mildeki MT oryantasyonu nedeniyle, kinezin-5 motorlarının iş mili montajı ve anafaz B sırasında iş mili direklerinin ayrılmasındaki klasik rolü, yalnızca 1,13'ü çapraz bağladıkları MT'ler üzerindeki artı uçlu yönlendirilmiş hareketlilikleri ile açıklanabilir. Cin8'in çift yönlülüğü hakkındaki ilk raporları takiben, diğer birkaç kinesin motorunun çift yönlü 14,15,16 olduğu gösterildi, bu da kinesin motorlarının çift yönlü hareketliliğinin daha önce inanıldığından daha yaygın olabileceğini gösteriyor.
Daha önce hücrelerde, Cin8'in çift yönlü bir şekilde hareket ettiğibildirilmiştir 8, bazı kinezin-5 motorlarının çift yönlü hareketliliğinin hücre içi fonksiyonları için önemli olduğu fikrini desteklemektedir. Ek olarak, çift yönlü olduğu bildirilen üç kinesin-5 motoru mantar hücrelerinden olduğundan, bu tür hücrelerde yakın zamanda kinesin-5 motorlarının çift yönlülüğü için olası bir rol önerilmiştir10. Bu modele göre, nükleer zarfın mitoz sırasında parçalanmadığı mantar hücrelerinin kapalı mitozunda, kinesin-5 motorları, iş mili montajından önce iş mili kutuplarını ayıran ilk kuvveti sağlar. Bu görevi yerine getirmek için, iş mili kutup ayrımından önce, kinesin-5 motorları, tek nükleer MT'ler üzerindeki eksi uçlu yönlendirilmiş hareketlilikleriyle iş mili kutuplarının yakınında lokalize olur. Bu konuma geldiğinde, kinesin-5 motorları kümelenir, yönselliği değiştirir, komşu mil direklerinden MT'leri yakalar ve çapraz bağlar. Daha sonra, kinesin-5 motorları, kutupların çapraz bağladıkları MT'lerde artı uçlu yönlendirilmiş hareketlilik ile ilk ayrımını sağlar. Bu modele göre, mantar kinezin-5 motorlarının iş mili düzeneği 1,13'teki rollerini yerine getirmesi için hem tek MT'lerde eksi uçlu yönlendirilmiş hareketlilik hem de çapraz bağlı MT'lerde artı uçlu yönlendirilmiş hareketlilik gereklidir.
Tarif edilen yöntemin genel amacı, yüksek saflıkta fungal GFP etiketli kinesin-5 Cin8 elde etmek ve tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin motilitesini ayrı ayrı analiz ederken tek moleküllü motilitesi testleri (Şekil 1) yapmaktır. Tek moleküller ve kümeler arasındaki ayrım önemlidir, çünkü Cin8'in yönlülüğünü etkilediği gösterilen faktörlerden biri, MTs10,12 üzerindeki kümelerde birikmesidir. MT yüzey kayma ve MT kayma testleri gibi alternatif hareketlilik testleri, tek motor proteinlerinin aktivitesi hakkında bilgi sağlamaz17,18. Burada açıklanan sağlam tek moleküllü hareketlilik testi ve analiz yöntemleri, kinezin-5 motorlarının, Cin8 ve Kip1 10,11,12,14,19,20'nin farklı yönlerini karakterize etmek için başarıyla uygulanmıştır.
Burada, Cin8 aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması, MTs'lerin polimerizasyonu ve tek moleküllü motilitesi testi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, tek moleküller ve Cin8 kümeleri arasında ayrım yapmak ve ortalama yer değiştirme (MD) ve ortalama kare yer değiştirme (MSD) analizi ile tek motor ve küme hızlarını belirlemek için yapılan analizler de açıklanmaktadır. Bu protokol, araştırmacıların prosedürlerin tüm adımlarını görselleştirmelerine ve bu tür tahlillerde sorun gidermeye yardımcı olmalarına yardımcı olmayı amaçlamaktadır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg"> Şekil 1: Tek moleküllü motilitesi testinin şematik gösterimi. Biyotinile floresan MTs, yüzeye bağlı biyotinillenmiş BSA ile etkileşime giren Avidin ile kaplanmış cam yüzeye tutturulur. Yeşil ok, yüksek iyonik mukavemet koşulları altında tek Cin8 moleküllerinin hareket yönünü temsil eder. +/- MT'nin polaritesini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (C40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine-Kinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for GFP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set for Rhodamine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004: ET-CY3/TRITC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>GAL02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycylGlycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G0674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jana Bioscience</td>
			<td>Nu-405L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTB</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BST01-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>H0710.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-FIJI software</td>
			<td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td>
			<td>version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>100x/1.4 oil DIC objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>DOC0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0715.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutraAvidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127 (poloxamer)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Tivan Biotech</td>
			<td>RAF01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size Exclusion chromatography instument</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose-6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roshe</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>T0720.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, biotinylated</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, TRITC Rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL530M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>FORMEDIUM</td>
			<td>CYN0401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

motility of single molecules and clusters of bi-directional kinesin-5 cin8 purified from s. cerevisiae cells

Mitotik bipolar kinezin-5 motorlar, iş mili dinamiklerinde temel işlevleri yerine getirir. Bu motorlar, aktif kompleksin zıt uçlarında bulunan iki çift katalitik motor alanına sahip homo-tetramerik bir yapı sergiler. Bu benzersiz mimari, kinesin-5 motorlarının antiparalel mil mikrotübüllerini (MTs) çapraz bağlamasını ve kaydırmasını sağlar, böylece iş mili kutuplarını birbirinden ayıran dışa doğru yönlendirilmiş kuvveti sağlar. Daha önce, kinesin-5 motorlarının yalnızca artı uçlu yönlendirildiğine inanılıyordu. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, birkaç mantar kinezin-5 motorunun eksi uçlu tek molekül seviyesine yönlendirildiğini ve çeşitli deneysel koşullar altında yönselliği değiştirebileceğini ortaya koymuştur. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8, bu tür çift yönlü motor proteinin bir örneğidir: yüksek iyonik mukavemet koşullarında, Cin8'in tek molekülleri, MT'lerin eksi uç yönünde hareket eder. Ayrıca, Cin8'in ağırlıklı olarak MT'lerin eksi ucunda hareketli kümeler oluşturduğu ve bu kümelenmenin Cin8'in yön değiştirmesine ve yavaş, artı uçlu yönlendirilmiş hareketliliğe maruz kalmasına izin verdiği gösterilmiştir. Bu makale, GFP etiketli kinesin-5 Cin8 ile çalışmanın tüm adımları için, S. cerevisiae hücrelerinde protein aşırı ekspresyonundan ve saflaştırılmasından in vitro tek moleküllü motilitesi testine kadar ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Burada açıklanan yeni geliştirilen bir yöntem, floresan yoğunluklarına bağlı olarak tek moleküller ve Cin8 kümeleri arasında ayrım yapmaya yardımcı olur. Bu yöntem, tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketliliğinin ayrı ayrı analizini sağlar, böylece Cin8 hareketliliğinin küme boyutuna bağımlılığının karakterizasyonunu sağlar.

Deney, tek MT'ler üzerinde farklı küme boyutlarındaki çift yönlü motor protein Cin8'in hareketlilik özelliklerini araştırmayı amaçlamaktadır. Cin8-GFP'nin temsili motilitesi, motorun zaman içindeki uzamsal konumunun gösterildiği Şekil 5A'daki kimograflardan da belirgindir.
Cin8-GFP'nin hareketli özelliklerinin analizi için, ilk olarak, MT'ye bağlı her bir hareketli Cin8-GFP parçacığına küme boyutu atanır (adım 4.3) ve daha sonra incelen...

Watch this Scientific Journal Video about Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells at JoVE.com

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Çift yönlü mitotik kinesin-5 Cin8, hareketlilikleri sırasında bölünen ve birleşen kümelerde birikir. Kümelerdeki birikim ayrıca Cin8'in hızını ve yönlülüğünü de değiştirir. Burada, saflaştırılmış Cin8-GFP ile motilitesi tahlilleri ve tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketli özelliklerinin analizi için bir protokol açıklanmaktadır.

Tek Moleküllerin Motilitesi ve S. cerevisiae Hücrelerinden Saflaştırılmış Çift Yönlü Kinesin-5 Cin8 Kümeleri

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8, çift yönlü bir motor proteindir. Cin8, mikrotübüllerin eksi uç yönünde tek bir molekül olarak hareket eder ve bir dizi farklı deneysel koşul altında yönlülüğü değiştirir. Araştırmamızın genel amacı, Cin8'in çift yönlü hareketliliğini düzenleyen faktörleri ve yapısal elemanları inceleyerek çift yönlü hareketlilik mekanizmasını anlamaktır.Bu protokol, maya hücrelerinde aşırı eksprese edilen GFP tipi tam uzunlukta Cin8'in saflaştırılmasını, tek moleküllü motilitesi testini ve ardından tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketli özelliklerinin analizini kapsamlı bir şekilde açıklamaktadır. Bu ayırma önemlidir, çünkü Cin8'in yönlülüğü, mikrotübül üzerindeki kümelerde birikmesinden etkilenir. Bu teknik, mayadan diğer nükleer proteinleri saflaştırmak için kolayca uyarlanabilir.Ek olarak, floresan yoğunluğuna göre boyut gruplarına ayrılması gereken herhangi bir floresan partikülüne uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvar müdürümüz Dr. Alina Goldstein-Levitin ve doktora sonrası bursiyerler Dr. Nurit Siegler olacak Dr. Mary Popov; Tatiana Zvagelsky, Maya Sadan ve Shira Hershfinkel, yüksek lisans öğrencileri; ve Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham ve Meital Haberman, laboratuvarımızdan lisans öğrencileri. Başlamak için, Cin8-GFP-6His aşırı ekspresyonu için plazmid içeren Saccharomyces cerevisiae hücrelerini, 28 santigrat derecede %2 rafinoz ile desteklenmiş, bir litre maya seçici ortamdaki üstel büyüme fazına kadar büyütün.Daha sonra% 2 galaktoz ekleyerek Cin8-GFP-6His aşırı ekspresyonunu indükleyin ve 600 nanometrede absorbansı ölçerek maya kültürünün büyümesini izleyin. Galaktoz ilavesinden beş saat sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Hücreleri lizis tamponunda tekrar askıya alın ve sıvı azotta dondurun.Daha sonra, soğutulmuş bir harç ve havane kullanarak, dondurulmuş hücreleri sıvı azotta öğütün. Öğütme sırasında sıvı azot eklemeye devam edin, böylece ekstraktlar donmuş kalır. Hücre lizisini bir faz veya diferansiyel girişim kontrast mikroskobu altında izleyin.Sonra toprak hücrelerini çözün ve santrifüj edin. Süpernatantı iki mililitre Nikel-NTA ile doldurulmuş bir yerçekimi akış kolonuna yükleyin ve lizis tamponu ile önceden dengeleyin. Süpernatantın sütundan dışarı akmasına izin verin.Kolonu beş sütun hacimli lizis tamponu ile yıkayın, ardından 25 milimolar imidazol ile desteklenmiş beş sütun hacimli lizis tamponu ile yıkayın. Daha sonra Cin8-GFP-6His elüsyon tamponu ile etkisiz hale getirin. Salınan örnekleri SDS-PAGE fraksiyonasyonu ile analiz edin, ardından Coomassie mavi boyama ve anti-GFP antikoru ile incelenen Western leke analizi ile analiz edin.Cin8-GFP-6His içeren fraksiyonları bir araya getirdikten sonra, dakikada 0.5 mililitre akış hızında ve 1.5 megapaskal bir kolon basınç sınırında boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırın. Aynı anda 280 nanometrede absorbansı izleyin. Cin8-GFP tetramerine karşılık gelen fraksiyonları toplayın ve bunları SDS-PAGE ve Western blotting ile analiz edin.Daha sonra seçilen fraksiyonları aliquot, çıtçıtlayın ve eksi 80 santigrat derecede kullanana kadar saklayın. Biyotin ve rodamin etiketli mikrotübülleri polimerize etmek ve stabilize etmek için, reaksiyon bileşenlerini 1.5 mililitrelik bir tüpte karıştırın ve karışımı 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra 80 mikrolitre ılık genel tübülin tamponu ekleyin, dikkatlice karıştırın ve santrifüj yapın.Süper nantantı atın ve 50 mikrolitre sıcak genel tübülin tamponu ile yukarı ve aşağı pipetleyerek, peleti dikkatlice yeniden askıya alın. Ardından süspansiyonu 28 veya 37 santigrat derecede saklayın. 647 nanometre rodamin kanalını kullanarak mikrotübülleri bir floresan mikroskobu ile inceleyin.Ardından, koruyucu kağıdı bant şeritlerinden çıkarın ve üç adet 10 mikrolitrelik hacimsel akış odası oluşturmak için şeritlerin üzerine silanize bir kapak kayması yerleştirin. Daha sonra, belirtilen reaktiflerin sıralı olarak eklenmesiyle kapak kaymasının avidin kaplamasını gerçekleştirin. Kapak kaymasını 80 mikrolitre genel tübülin tamponu ile yıkamadan önce üç ila beş dakika inkübe edin.Daha sonra, akış odasına 20 mikrolitre mikrotübül yerleştirerek biyotinile mikrotübülleri b-BSA / avidin kaplı kapak kapaklarına takın. Kızakları, kapak kayması aşağı bakacak şekilde karanlık bir nem odasında oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları 200 mikrolitre genel tübülin tamponu ile yıkayın.Daha sonra, 30 mikrolitre hareketlilik reaksiyonu karışımı uygulayın, ardından 20 mikrolitre motilite reaksiyon karışımında seyreltilmiş Cin8-GFP motorları akış odasına uygulayın ve hemen motorların mikrotübüller boyunca hareketini görüntülemeye devam edin. Motor hareketlilik görüntüleme için, mikroskop hedefine bir damla daldırma yağı yerleştirin, ardından akış odasını floresan mikroskop aşamasına, kapak kayması hedefe bakacak şekilde yerleştirin. Kapak kayma yüzeyine bağlı mikrotübüllere odaklanmak için rodamin kanalını açın.Ardından, ImageJ Micro-Manager yazılımını kullanarak görüntüyü 20 milisaniyelik pozlama ile elde edin. Ardından, GFP kanalını açın ve bir saniyelik aralıklarla ve 800 milisaniyelik pozlamayla 90 hızlandırılmış görüntü elde edin. ImageJ Fiji yazılımında, hızlandırılmış filmi ve ilgili mikrotübül alan görüntüsünü açın.Bu iki pencereyi Çözümle'yi, ardından Araçlar ve Windows'u Eşitle'yi seçerek eşitleyin. Bir kimografi elde etmek için, Parçalı Çizgi seçeneğini kullanarak bir mikrotübülü vurgulayın. Ardından, Analiz Et'ten Multi Kymograph sekmesini seçin.Cin8-GFP moleküllerinin küme boyutunu belirlemek için, İşlem'e ve ardından Arka Planı Çıkar'a tıklayarak arka plan çıkarma ve eşit olmayan aydınlatma için düzeltme işlemlerini gerçekleştirin. Yuvarlanan top yarıçapını 100 piksele ayarlayın ve Sürgülü paraboloid seçeneğini işaretleyin. Ardından, ImageJ Fiji yazılımının TrackMate eklentisini kullanarak belirli bir hareketli olmayan Cin8-GFP motorunu izleyin.Eklentiler'i, ardından İzleme, TrackMate, LoG dedektörü ve Basit LAP izleyiciyi seçerek Cin8-GFP motorunun ortalama floresan yoğunluğunu dört piksel yarıçaplı bir daire içinde zamanın bir fonksiyonu olarak izleyin. Farklı Cin8-GFP motorları için prosedürü tekrarladıktan sonra, floresan yoğunluklarını zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. Daha sonra, Cin8-GFP moleküllerinin mikrotübül izleri boyunca hareketliliğini izlemek için, kaydedilen karelerin hızlandırılmış dizisinde analiz edilecek mikrotübülleri, dikdörtgen aracıyla vurgulayarak ve Görüntü'yü tıklatarak kırpın, ardından Kırp'ı tıklayın.Analiz için bir floresan Cin8-GFP partikülü seçin. Noktasal aracı ve Ölçüm seçeneklerini kullanarak hızlandırılmış dizinin her karesindeki parçacık koordinatlarını kaydedin. Benzer şekilde, hızlandırılmış dizideki diğer floresan parçacıklar için koordinatları kaydedin.Ardından, daha önce gösterildiği gibi, incelenen tüm Cin8-GFP parçacıklarına görünümlerinin ilk karesinde küme boyutu atayın. Daha sonra, belirtilen formülü ve belirlenen Cin8-GFP hareket koordinatlarını kullanarak, ilk koordinatlara göre her zaman noktasında Cin8-GFP'nin yer değiştirmelerini hesaplayın. Bu yer değiştirme değerlerinden, belirli bir Cin8-GFP parçacığı için olası tüm zaman aralıkları için yer değiştirmeyi hesaplayın.İncelenen tüm Cin8-GFP parçacıkları için prosedürü tekrarlayın. Son olarak, incelenen tüm Cin8-GFP parçacıklarının zaman aralığına karşı ortalama yer değiştirmesini çizin ve doğrusal bir uyuma tabi tutun. Bu uyumun eğimi, hareketli Cin8-GFP parçacıklarının ortalama hızını temsil eder.Tek mikrotübüller üzerinde farklı küme boyutlarındaki çift yönlü motor protein Cin8'in hareketlilik özellikleri burada gösterilmiştir. Her küme boyutu kategorisi için, kayıtlardan bireysel Cin8-GFP'nin 40'tan fazla yörüngesi çıkarıldı. Tek moleküllerin ve Cin8 motorlarının kümelerinin ortalama yer değiştirmelerini zaman aralığının bir fonksiyonu olarak çizmek, tek Cin8-GFP moleküllerinin yüksek hızda tek yönlü eksi uç-yönlendirilmiş bir şekilde hareket ettiğini göstermiştir.Buna karşılık, Cin8 kümeleri daha düşük hız ve daha yüksek çift yönlü hareketlilik sergiler. Bu prosedürü uygularken, motor kümelenmesini etkileyebilecek kontaminasyonları önlemek için yüksek saflıkta motor proteini kullanılmalıdır. Motor floresan yoğunluğunu analiz ederken, fotobeyazlatmanın etkisinden kaçınmak için motorları göründükleri ilk çerçevede incelemek önemlidir.Çift yönlü motorların hareketliliğini incelerken, motor kümelenmesi motor yönlülüğünü etkileyen temel faktörlerden biri olduğundan, tek molekülleri ve kümeleri ayrı ayrı analiz etmek son derece önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Biyokimya

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Sitosolion Glutatyon S-Transferazlarının Potansiyel Inhibitörleri için Spektrofotometrik Tarama

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Küçük Moleküllerin Mikrokristal Elektron Kırınımı

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...