Name: optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging
Uploaded: 2022-01-05T15:00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 til T.H.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B, JP17H03697 til D.K.), Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (JP18K19331 til D.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP20H05358 for D.K.)) og Japan Science and Technology Agency (PRESTO-programmet (JPMJPR15QC til Y.M., JPMJPR18K4 til D.K.)). Forfatterne er taknemmelige for Live Imaging Center ved Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM) ved Nagoya University for at støtte de mikroskopiske undersøgelser og Editage (www.editage.com) til engelsksproget redigering.

1. Forberedelse af clearingopløsninger
<ol><li>Til fremstilling af CS-opløsning opløses 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) natriumdeoxycholat og 25% (w/v) urinstof i destilleret vand på en magnetisk omrører. BEMÆRK: Natriumdeoxycholatpulver skal vejes i et trækkammer, da det let flyder i luften. CS kan opbevares ved stuetemperatur i mørke i mere end 1 år.</li>
	<li>Til fremstilling af CSA-opløsning tilsættes natriumsulfit (50 mM endelig koncentration) til den ovenfor opnåede CS-opløsning. BEMÆRK: Tilsæt natriumsulfit til CS-opløsningen lige før brug, da reduktionsmidlet let deaktiveres.</li>
</ol>2. Fremstilling af den fikserende opløsning
<ol><li>Overfør 40 ml steriliseret vand til et konisk rør og tilsæt 2 g paraformaldehyd. Tilsæt 200 μL 2 N NaOH for at øge opløsningens pH. Efter lukning og forsegling af røret med parafilm inkuberes ved 60 °C med lejlighedsvise inversioner, indtil alt er opløst.</li>
	<li>Efter afkøling af opløsningen til stuetemperatur tilsættes 5 ml 10x fosfatbufret saltvand (PBS) for at justere pH til 7,4. Tilsæt steriliseret vand for at udgøre volumenet til 50 ml. BEMÆRK: En frisklavet fikseringsopløsning foretrækkes. Opløsningen kan også opbevares ved -30 °C i flere måneder.</li>
</ol>3. Fastgørelse af prøver
<ol><li>Planteprøverne nedsænkes i den fikserende opløsning i et mikrorør (figur 1A), og det sikres, at volumenet af den fikserende opløsning er mere end fem gange prøvevolumenet.</li>
	<li>Forsegl mikrorøret med en parafilm og lav huller ved hjælp af en nål. Lad ikke røret stå åbent på grund af risiko for prøvespild under vakuumdekompression.</li>
	<li>Anbring mikrorøret i en ekssikkator, og juster langsomt vakuumgraden (~ 690 mmHg), så bobler vises gradvist fra prøverne (figur 1B-C). Sluk for vakuumpumpen efter evakuering af tørremaskinen. Lad mikrorøret stå uforstyrret i 30 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Udluftningstørreren forsigtigt for at forhindre forstyrrelse af prøverne. Tænd vakuumpumpen igen, og sluk den efter evakuering af tørremaskinen. Lad mikrorøret stå uforstyrret i 30 minutter ved stuetemperatur. BEMÆRK: Der skal sørges for at forhindre beskadigelse af prøverne under udluftning af ekssikkatoren. Den fikserende opløsnings indtrængning i prøverne forstærkes af to vakuumbehandlinger. Yderligere vakuumbehandling hjælper med at trænge ind i den fikserende opløsning i tykkere prøver.</li>
	<li>Åbn tørressikkatoren forsigtigt uden at støde den fikserende opløsning i mikrorøret. Brug en mikropipette til at fjerne den fikserende opløsning og tilsæt 1x PBS. Efter opbevaring i 1 min skal du udskifte den gamle PBS med ny 1x PBS (figur 1D).</li>
</ol>4. Rydning
<ol><li>Når PBS er fjernet, tilsættes fem gange prøvevolumenet af clearingopløsningen.</li>
	<li>Forsegl mikrorøret med parafilm og lav huller ved hjælp af en nål. Anbring prøverne i ekssikkatoren, evakuer som i trin 3.3, og sluk for vakuumpumpen. Lad mikrorøret stå uforstyrret i 60 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Åbn forsigtigt tørremaskinen. Luk mikrorøret med parafilm og opbevar det ved stuetemperatur i mørke for at undgå fotoblegelse af fluorescerende proteiner. Omvendt mikrorøret hver 1-2 dag for at fremskynde clearingprocessen.</li>
	<li>Når clearingopløsningen bliver grøn, skal den udskiftes med nye clearingopløsninger, indtil opløsningen forbliver farveløs (figur 1E-H).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig01.jpg"> Figur 1: Procedure for CS-behandling. (A) Arabidopsisplante i 4% PFA (Paraformaldehyd) opløsning. B) Prøven anbringes i en ekssikkator. (C) Frøplanten er fastgjort under et vakuum. (D) Frøplanten gennemblødes i PFA-opløsningen efter vakuumbehandling. (E) Resulterende 3-dages rydningsopløsningsbehandlet frøplante. Bemærk den grønne farve på clearingopløsningen. F) Clearingopløsningen udskiftes 3 dage efter behandlingen. G) Resulterende 5-dages rydningsopløsningsbehandlet frøplante. H) Rydningsopløsningen udskiftes 5 dage efter behandlingen. Vægtstænger: 1 cm (A,C-H) og 5 cm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
5. Kemisk farvning af farvestof
<ol><li>Til mikrorøret tilsættes Hoechst 33342 (endelig koncentration på 10 μg/ml) til nuklear farvning eller Calcofluor White (endelig koncentration på 1 mg/ml) til farvning af cellevæggen og venter i 1 time. Efter fjernelse af farvestofopløsningen vaskes prøven med en frisk clearingopløsning i 1 time. BEMÆRK: Farvning og vask natten over kan forbedre fluorescerende farvestofindtrængning i væv og reducere baggrundsfluorescens. Forskellige fluorescerende farvestoffer er kompatible med CS-opløsningen, såsom Basic Fuchsin9 (lignin), Auramine O9 (lignin, suberin og cutin), Nile Red9 (suberin), Direct Yellow 969, Direct Red 239 og SR220010,11 (cellevægge).</li>
</ol>6. Observation
<ol><li>Skær silikonegummiplade med et barberblad for at forberede en ramme til afstandsrummet (figur 2A). BEMÆRK: Juster tykkelsen af siliciumgummipladen i henhold til prøvens tykkelse. Da prøver behandlet med rydningsopløsning er bløde, vil de blive beskadiget, hvis de er dækket direkte med dækglasset.</li>
	<li>Anbring silikonerammen på dækglas (f.eks. 25 x 60 mm) (figur 2B). Placer de behandlede prøver inden for rammen, og tilsæt ~ 100 μL clearingopløsning for at fjerne eventuelle bobler i rammen. Dæk med et andet dækglas (18 x 18 mm eller 24 x 24 mm) for at forhindre fordampning af rydningsopløsningen (figur 2C).</li>
	<li>Overhold prøverne under et fluorescerende mikroskop. Efter observation returneres prøverne til clearingopløsningen taget i et mikrorør og opbevares ved stuetemperatur i mørket.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig02.jpg"> Figur 2: Prøveforberedelse til mikroskopisk observation. (A) Skær et 0,2 mm tykt silikoneark i en ramme. (B) Sæt silikonepladerammen på dækglasset. C) Anbringe den prøve, der er behandlet med renseopløsning (markeret med prikket kant), inden for rammen og dække den med et dækglas. Skalabjælker: 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<ol>
	<li>Vogelmann, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+within+the+plant.">Light within the plant.</a> Photomorphogenesis in Plants. , 491-535 (1994).</li><li>Krause, G. H., Weis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence+and+photosynthesis:+The+basics.">Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42 (1), 313-349 (1991).</li><li>Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+oxidation+in+plants:+from+biochemical+properties+to+physiological+functions.">Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions.</a> Trends in Plant Science. 12 (1), 29-36 (2007).</li><li>Lersten, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+annotated+bibliography+of+botanical+clearing+methods.">An annotated bibliography of botanical clearing methods.</a> Iowa State Journal of Science. 41 (4), 481-486 (1967).</li><li>Villani, T. S., Koroch, A. R., Simon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+clearing+and+mounting+solution+to+replace+chloral+hydrate+in+microscopic+applications.">An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications.</a> Applications in Plant Sciences. 1 (5), 1300016 (2013).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS ONE. 7 (3), 33916 (2012).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+a+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSeeAlpha:+advanced+optical+clearing+for+whole-plant+imaging.">ClearSeeAlpha: advanced optical clearing for whole-plant imaging.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).</li><li>Ursache, R., Andersen, T. G., Marhav&#253;, P., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+combining+fluorescent+proteins+with+histological+stains+for+diverse+cell+wall+components.">A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components.</a> The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).</li><li>Tofanelli, R., Vijayan, A., Scholz, S., Schneitz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+rapid+clearing+and+staining+of+fixed+Arabidopsis+ovules+for+improved+imaging+by+confocal+laser+scanning+microscopy.">Protocol for rapid clearing and staining of fixed Arabidopsis ovules for improved imaging by confocal laser scanning microscopy.</a> Plant Methods. 15 (1), 120 (2019).</li><li>Vijayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+3D+reference+atlas+reveals+cellular+growth+patterns+shaping+the+Arabidopsis+ovule.">A digital 3D reference atlas reveals cellular growth patterns shaping the Arabidopsis ovule.</a> eLife. 10, 1-38 (2021).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., George Barisas, B., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 1-20 (2013).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252, 1231-1240 (2015).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).</li><li>Warner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+clearing+technique+for+plant+tissues+allowing+deep+imaging+and+compatible+with+fluorescence+microscopy.">An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy.</a> Plant Physiology. 166 (4), 1684-1687 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+plant+organs+using+a+simple+and+rapid+transparency+technique.">Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique.</a> Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).</li><li>Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+optical+clearing+protocol+for+deep+tissue+imaging+of+fluorescent+proteins+in+Arabidopsis+thaliana.">A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana.</a> PLOS ONE. 11 (8), 0161107 (2016).</li><li>Sakamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+clearing+method+contributes+to+deep+imaging+of+plant+organs.">Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs.</a> Research Square. , (2021).</li><li>Tanaka, E., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-leaf+fluorescence+imaging+to+visualize+in+planta+fungal+structures+of+Victory+onion+leaf+rust+fungus,+Uromyces+japonicus,+and+its+taxonomic+evaluation.">Whole-leaf fluorescence imaging to visualize in planta fungal structures of Victory onion leaf rust fungus, Uromyces japonicus, and its taxonomic evaluation.</a> Mycoscience. 59 (2), 137-146 (2018).</li><li>Ohtsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+deep+imaging+of+syncytium+induced+by+the+soybean+cyst+nematode+Heterodera+glycines.">Spatiotemporal deep imaging of syncytium induced by the soybean cyst nematode Heterodera glycines.</a> Protoplasma. 254, 2107-2115 (2017).</li><li>Duman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+de-etiolation+increases+the+rooting+of+VC801+Avocado+rootstock.">Short de-etiolation increases the rooting of VC801 Avocado rootstock.</a> Plants. 9 (11), 1481 (2020).</li><li>Ho, W. W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+multi-omics+analyses+of+barley+rootzones+under+salinity+stress+reveal+two+distinctive+salt+tolerance+mechanisms.">Integrative multi-omics analyses of barley rootzones under salinity stress reveal two distinctive salt tolerance mechanisms.</a> Plant Communications. 1 (3), 100031 (2020).</li><li>Arsovski, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrphyB+is+critical+for+rapid+recovery+to+darkness+in+mature+Brassica+rapa+leaves.">BrphyB is critical for rapid recovery to darkness in mature Brassica rapa leaves.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Doll, Y., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+stomatal+development+regulation+in+Callitriche+is+related+to+the+intrageneric+diversity+in+lifestyles.">The diversity of stomatal development regulation in Callitriche is related to the intrageneric diversity in lifestyles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (14), (2021).</li><li>Eliyahu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetative+propagation+of+elite+Eucalyptus+clones+as+food+source+for+honeybees+(Apis+mellifera);+adventitious+roots+versus+callus+formation.">Vegetative propagation of elite Eucalyptus clones as food source for honeybees (Apis mellifera); adventitious roots versus callus formation.</a> Israel Journal of Plant Sciences. 67 (1-2), 83-97 (2020).</li><li>Kelliher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATRILINEAL,+a+sperm-specific+phospholipase,+triggers+maize+haploid+induction.">MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction.</a> Nature. 542, 105-109 (2017).</li><li>Aki, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+signaling+is+essential+for+organ+formation+in+Marchantia+polymorpha.">Cytokinin signaling is essential for organ formation in Marchantia polymorpha.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (8), 1842-1854 (2019).</li><li>Kinoshita, A., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+ANGUSTIFOLIA3+and+SHOOT+MERISTEMLESS,+key+genes+for+meristematic+activity+in+a+one-leaf+plant+Monophyllaea+glabra,+revealed+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Expression profiles of ANGUSTIFOLIA3 and SHOOT MERISTEMLESS, key genes for meristematic activity in a one-leaf plant Monophyllaea glabra, revealed by whole-mount in situ hybridization.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 1-11 (2020).</li><li>Okazawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+planteose+hydrolysis+during+seed+germination+of+Orobanche+minor.">Localization of planteose hydrolysis during seed germination of Orobanche minor.</a> bioRxiv. , 448768 (2021).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAPYRIN+attenuates+defence+by+repressing+PR+gene+induction+and+localized+lignin+accumulation+during+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+of+Petunia+hybrida.">VAPYRIN attenuates defence by repressing PR gene induction and localized lignin accumulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis of Petunia hybrida.</a> New Phytologist. 229 (6), 3481-3496 (2021).</li><li>Chu, T. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+markers+highlight+intracellular+dynamics+of+membrane+proteins+in+response+to+abiotic+treatments+in+rice.">Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice.</a> Rice. 11, 23 (2018).</li><li>Alaguero-Cordovilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin-mediated+regulatory+framework+for+wound-induced+adventitious+root+formation+in+tomato+shoot+explants.">An auxin-mediated regulatory framework for wound-induced adventitious root formation in tomato shoot explants.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 44 (5), 1642-1662 (2021).</li><li>Okuda, A., Matsusaki, M., Masuda, T., Urade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+GmPDIL7,+a+soybean+ER+membrane-bound+protein+disulfide+isomerase+family+protein.">Identification and characterization of GmPDIL7, a soybean ER membrane-bound protein disulfide isomerase family protein.</a> The FEBS Journal. 284 (3), 414-428 (2017).</li><li>Kim, D. -. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutualistic+interaction+between+Streptomyces+bacteria,+strawberry+plants+and+pollinating+bees.">A mutualistic interaction between Streptomyces bacteria, strawberry plants and pollinating bees.</a> Nature Communications. 10 (1), 4802 (2019).</li><li>Wu, J., Mock, H. -. P., Giehl, R. F. H., Pitann, B., M&#252;hling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+decreases+cadmium+concentrations+by+modulating+root+endodermal+suberin+development+in+wheat+plants.">Silicon decreases cadmium concentrations by modulating root endodermal suberin development in wheat plants.</a> Journal of Hazardous Materials. 364, 581-590 (2019).</li><li>Isoda, M., Oyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+duckweed+species,+Wolffiella+hyalina,+for+whole-plant+observation+of+physiological+behavior+at+the+single-cell+level.">Use of a duckweed species, Wolffiella hyalina, for whole-plant observation of physiological behavior at the single-cell level.</a> Plant Biotechnology. 35 (4), 387-391 (2018).</li><li>Ben-Targem, M., Ripper, D., Bayer, M., Ragni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+and+gibberellin+signaling+cross-talk+promotes+hypocotyl+xylem+expansion+and+cambium+homeostasis.">Auxin and gibberellin signaling cross-talk promotes hypocotyl xylem expansion and cambium homeostasis.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (10), 3647-3660 (2021).</li><li>Shwartz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VIL+gene+CRAWLING+ELEPHANT+controls+maturation+and+differentiation+in+tomato+via+polycomb+silencing.">The VIL gene CRAWLING ELEPHANT controls maturation and differentiation in tomato via polycomb silencing.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Levin, K. A., Tucker, M. R., Strock, C. F., Lynch, J. P., Mather, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+reveals+that+positions+of+cyst+nematode+feeding+sites+relative+to+xylem+vessels+differ+between+susceptible+and+resistant+wheat.">Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat.</a> Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).</li><li>Nouri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+suppression+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+involves+gibberellic+acid+signaling.">Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).</li><li>Evangelisti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+enables+the+identification+and+quantification+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi+in+plant+roots.">Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots.</a> bioRxiv. , 434067 (2021).</li></ol>

ClearSee er kommercialiseret (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Japan). Nagoya Universitet har patent (JP6601842) på clearingreagenset ClearSee. D. Kurihara er patentopfinderen. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Denne metode består af fiksering, vask og rengøring. Fiksering er et kritisk trin i denne protokol. Hvis det fluorescerende protein ikke observeres efter PFA-fiksering, vil det ikke blive observeret efter behandling med clearingopløsning. Pfa-opløsningens indtrængning i væv er kritisk, men højvakuumbehandling anbefales ikke, fordi det kan ødelægge cellestrukturen. Vakuumbetingelser og fikseringsperioder bør optimeres for hver type væv og art. Det anbefales at kontrollere fluorescerende proteiner selv efter fiksering. Selvom prøver normalt blev fastgjort i 30-60 minutter ved stuetemperatur, kan de fastsættes til 4 ° C i længere tid (natten over eller mere).
Som vist i figur 6A havde nogle natriumdeoxycholater en lysegul farve, når de blev opløst. Sådanne natriumdeoxycholatopløsninger viste stærk autofluorescens i 400-600 nm-regionen efter excitation ved 380 nm (figur 6B). Denne autofluorescens forhindrer optisk clearing og fluorescensbilleddannelse. Brugere bør kontrollere farven på natriumdeoxycholatopløsning, da reagensets kvalitet kan variere på grund af renhed, parti-til-parti-variation eller andre årsager.
De clearingopløsninger, der anvendes her, har høje koncentrationer af natriumdeoxycholat, som kan ødelægge membranstrukturen. Plasmamembranmarkøren (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) blev observeret selv efter CS-behandling7. Det kan dog være bedre at reducere koncentrationen af natriumdeoxycholat, afhængigt af strukturen og vævet af interesse. Faktisk blev der opnået billeder med forbedret klarhed for Arabidopsis-pistiller med modificeret CS, hvor koncentrationen af natriumdeoxycholat reduceres med halvdelen; Reducerede koncentrationer af natriumdeoxycholat krævede imidlertid forlængede behandlingstider (f.eks. 1 måned for Arabidopsis-pistiller).
CS kan reducere rød autofluorescens (>610 nm) for at fjerne klorofyl i behandlede prøver. Imidlertid forblev 500-600 nm autofluorescens (gul til orange) selv i CS-behandlede prøver7. Denne autofluorescens menes at være afledt af cellevæggen og andre cellulære komponenter, såsom lignin12,13. Derfor er det svært at lave væv, såsom stængler med udviklede sekundære vægge, helt gennemsigtige ved CS-behandling.
Flere rensereagenser ud over dem, der anvendes her, er blevet udviklet til at observere fluorescerende proteiner i planter ved hjælp af fluorescerende mikroskopi14,15,16,17. Sammenlignet med disse metoder fjerner CS og CSA klorofyl og reducerer autofluorescens, hvilket gør plantevævene mere gennemsigtige. For nylig udviklede Sakamoto et al. en forbedret metode, iTOMEI, til fiksering, rensning af vaskemiddel og montering for at justere brydningsindeksets uoverensstemmelse18. I Arabidopsis-frøplanter ryddede iTOMEI vævet inden for 26 timer.
CS gælder for en bred vifte af plantearter, såsom Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, byg22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Eucalyptus25, majs26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, sojabønne33, jordbær34, hvede35 og Wolffiella hyalina36. For tykkere væv kan CS også gøre vibratomsektionerne gennemsigtige37,38. Denne metode tillod undersøgelser af den cellulære struktur og genekspressionsmønstre i planter37,38. Desuden blev nematodeinfektioner20,39, svampeinfektioner og symbiose19,40,41 også observeret dybt inde i det CS-behandlede væv. Således er denne metode nyttig til billeddannelse af hele væv fra mikro- til makroskalaer og kan hjælpe med at opdage nye interaktioner mellem forskellige celler, væv, organer og organismer.

Visualisering af cellulære strukturer og lokalisering af proteiner i levende organismer er vigtig for at afklare deres funktioner in vivo. Men da den levende krop ikke er gennemsigtig, er det udfordrende at observere levende organismers indre struktur uden dissektion. Især i tilfælde af plantevæv, der er flerlags med celler af forskellig form, er indeksmismatchet forårsaget af deres struktur og tilstedeværelsen af lysabsorberende pigmenter problematisk. For eksempel har planteblade en kompleks struktur, der giver dem mulighed for effektivt at udnytte det lys, der kommer ind i deres kroppe til fotosyntese1, mens strukturen også forårsager brydningsindeksmismatch, hvilket gør dem vanskelige at observere. Bladene har imidlertid mange lysabsorberende pigmenter, såsom klorofyl, der udsender stærk rød fluorescens, og brunlige pigmenter produceres ved oxidation2,3. Disse pigmenter hindrer også hele montering fluorescensmikroskopi observationer i planter. Til observation af planternes indre struktur er affarvning og fiksering ved alkohol og rydning ved hjælp af chlorhydrat derfor blevet brugt i lang tid for at eliminere brydningsindeksmismatch og autofluorescens4,5. Disse konventionelle metoder er blevet vedtaget i mange år, men de har den ulempe, at de eliminerer fluorescensen af fluorescerende proteiner på samme tid6,7. Dette er problematisk, da fluorescerende proteiner er blevet uundværlige i den nuværende fluorescerende billeddannelse.
Derfor er ClearSee (CS) og ClearSeeAlpha (CSA) blevet udviklet som optiske clearingreagenser til plantevæv. Begge reagenser reducerer klorofylautfluorescens, samtidig med at stabiliteten af fluorescerende proteiner7,8 opretholdes. CSA er især nyttigt, når brune pigmenter produceres på grund af vævsoxidation. Ved hjælp af disse clearingreagenser er det muligt at observere den cellulære struktur og proteinlokalisering inde i plantekroppen uden fysisk sektionering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcofluor White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearSee</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18&#215;18 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24&#215;24 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C024241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (25&#215;60 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>AS One</td>
			<td>1-5801-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>346-07951</td>
			<td>1 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS One</td>
			<td>6-9085-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>C0316</td>
			<td>Figure 6_1; Lot PSGYK-QB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Kishida Chemical</td>
			<td>260-71412</td>
			<td>Figure 6_2; Lot C05543H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Figure 6_3; Lot SLBS7362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td>Figure 6_4; Lot BCBW0612</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>10712-96</td>
			<td>Figure 6_5; Lot M5R3403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>194-08311</td>
			<td>Figure 6_6; Lot LKL0648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-03411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>211-01213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>BUCHI</td>
			<td>V-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylitol</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>248-00545</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging

Det er udfordrende at observere den indre struktur af flerlagede og uigennemsigtige planteprøver direkte uden dissektion under et mikroskop. Derudover hæmmer autofluorescens, der tilskrives klorofyl, observationen af fluorescerende proteiner i planter. I lang tid er forskellige clearingreagenser blevet brugt til at gøre planter gennemsigtige. Konventionelle clearingreagenser mindsker imidlertid fluorescerende signaler; derfor har det ikke været muligt at observere de cellulære og intracellulære strukturer med fluorescerende proteiner. Reagenser blev udviklet, der kan rydde plantevæv ved at fjerne klorofyl og samtidig opretholde fluorescerende proteinstabilitet. Her findes en detaljeret protokol til optisk clearing af plantevæv ved hjælp af clearingreagenser, ClearSee (CS) eller ClearSeeAlpha (CSA). Forberedelsen af ryddet plantevæv involverer tre trin: fiksering, vask og rydning. Fiksering er et afgørende skridt i opretholdelsen af de cellulære strukturer og intracellulær stabilitet af fluorescerende proteiner. Inkubationstiden for rydning afhænger af vævstype og art. I Arabidopsis thaliana var den tid, der kræves til rydning med CS, 4 dage for blade og rødder, 7 dage for frøplanter og 1 måned for pistiller. CS krævede også en relativt kort tid på 4 dage for at gøre de gametofytiske blade af Physcomitrium patens gennemsigtige . I modsætning hertil producerede pistiller i tobak og toreni brunt pigment på grund af oxidation under CS-behandling. CSA reducerede det brune pigment ved at forhindre oxidation og kunne gøre tobak og torenia pistiller gennemsigtige, selvom det tog relativt lang tid (1 eller 2 måneder). CS og CSA var også kompatible med farvning ved hjælp af kemiske farvestoffer, såsom DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol) og Hoechst 33342 til DNA og Calcofluor White, SR2200 og Direct Red 23 til cellevæggen. Denne metode kan være nyttig til helplantebilleddannelse for at afsløre intakt morfologi, udviklingsprocesser, plante-mikrobe-interaktioner og nematodeinfektioner.

CS kan rydde blade af forskellige arter (figur 3A-H). Det er vanskeligt for CS-opløsningen at trænge ind i et risblad, fordi bladoverfladen er dækket af kutikulær voks i denne plante. Efter ekstraktion af kutikulær voks ved at dyppe i chloroform i 10 s, kunne CS imidlertid rydde risbladene (figur 3H). CS kunne imidlertid ikke trænge ind i Chamaecyparis obtusa-blade, som er mindre gennemtrængelige for CS (figur 3I,J). I krysantemumblade blev brun pigmentering induceret af polyphenoloxidation observeret i de CS-behandlede blade (figur 3K,L). Tilsvarende viste tobaks- og torenipistiller brun pigmentering under CS-behandlingen (figur 3M,O). Da natriumsulfitkomponenten i CSA forhindrer polyphenoloxidation på grund af den reducerende virkning, kunne CSA rydde tobaks- og torenipistiller uden nogen brun pigmentering (figur 3N,P).
Figur 4B viser, at CS-behandling reducerede den lysegrønne farve på Arabidopsis H2B-mClover-bladet (lyst felt) og forbedrede fluorescensintensiteten af H2B-mClover sammenlignet med PBS-inkubation (figur 4A). Ud over blomstrende planter gælder CS også for mosplanter (figur 4C); Efter 4 dages CS-behandling blev fluorescensen af H2B-mRFP tydeligt påvist for hele gametoforen med reduceret klorofylautofluorescens. Figur 4D,E viser 3D-rekonstruktionsbilleder af H2B-mClover-støvlen i Nicotiana benthamiana ryddet ved hjælp af CSA. Prøvedybden var 440 μm. Som det dybdekodede maksimale intensitetsprojektionsbillede viser, giver CSA mulighed for dyb billeddannelse af udfordrende væv, såsom tobakspistiller.
CS og CSA var også kompatible med fluorescerende farvestoffarvning. Figur 5 viser, at CS samtidig kunne anvendes til at observere det fluorescerende protein (H2B-mClover) og organisk fluorescerende farvestoffarvning (Calcofluor White). Efter 3D-rekonstruktion fra z-stack-billederne kunne ethvert afsnit observeres.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig03.jpg"> Figur 3: Optisk rydning af blade og pistiller ved hjælp af clearingopløsninger. (A-L) Faste blade af forskellige arter blev inkuberet i PBS (A,C,E,G,I,K) eller CS (B,D,F,H,J,L) i 8 dage og CS (M,O) eller CSA (N,P) i 2 dage. (A,B,O,P) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) Chrysanthemum morifolium, (M,N) Nicotiana benthamiana. Skalabjælker: 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig04.jpg"> Figur 4: Fluorescensbilleddannelse af væv behandlet med clearingopløsninger. (A,B) UBQ10pro::H2B-mClover blade af Arabidopsis thaliana blev behandlet med PBS (A) eller CS (B) i 3 dage. C) H2B-mRFP-blade gametophorer af Physcomitrium patens blev behandlet med CS i 4 dage. Kernerne blev mærket med H2B-mRFP (grøn). CS-behandlingen reducerede klorofylautofluorescens (magenta). H2B-mRFP-signalet i det apikale område blev tydeligt observeret for både fusionerede billeder af H2B-mRFP og autofluorescens eller lyst felt. (D,E) UBQ10pro::H2B-mClover stigma af Nicotiana benthamiana blev behandlet i CSA i 1 måned. Maksimal intensitetsprojektion (D) og dybdekodet maksimalintensitetsprojektion (E) blev genereret fra 88 z-stack-billeder med 5 μm intervaller. Vægtstænger: 100 μm. Billeder blev taget ved hjælp af vidvinkel (A, B), konfokal (C) og to-foton excitation (D, E) mikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig05.jpg"> Figur 5: Fluorescerende farvestoffarvning er kompatibel med CS. (A) CS-behandlede blade observeret ved to-foton excitationsmikroskopi med 950 nm excitation. Cellevæggen er farvet med Calcofluor White (cyan). Kerner er mærket med UBQ10pro::H2B-mClover (gul). Billederne yz (B) og xz (C) er tværsnit på den position, der er angivet med de hvide stiplede linjer i (A). Skalabjælke: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig06.jpg"> Figur 6: Gennemsigtighed af natriumdeoxycholat. (A) Farver af forskellige 15% natriumdeoxycholater (opført i tabel over materialer). B) Fluorescensspektrum for hvert 15 % natriumdeoxycholat med 380 nm excitation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Her beskrives en metode til at gøre plantevæv gennemsigtigt og samtidig opretholde stabiliteten af fluorescerende proteiner. Denne teknik letter dyb billeddannelse af ryddet plantevæv uden fysisk sektionering.

Optisk rydning af plantevæv til fluorescensbilleddannelse

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Denne metode kan være nyttig i hel-plante billeddannelse for at afsløre intakt morfologi, udviklingsprocesser og plante-mikrobe interaktioner. Den største fordel ved denne teknik er, at vi direkte kan observere indersiden af en plantekrop uden at påføre den skade. Da denne metode gælder for en lang række plantearter og væv, kan den være med til at fremskynde opdagelsen af nye fænomener inden for plantebiologisk forskning.Fiksering er et kritisk trin i denne procedure. Før clearingtrinnet skal man kontrollere intensiteten af fluorescerende protein efter fiksering. For at begynde at nedsænke planteprøver i den fikserende opløsning i et mikrorør og sikre, at volumenet af den fikserende opløsning er mere end fem gange prøvevolumenet.Forsegl mikrorøret med en parafilm og lav huller ved hjælp af en nål. Anbring mikrorøret i en ekssikkator og juster langsomt vakuumgraden til omkring 690 millimeter kviksølv, så der gradvist kommer bobler ud af prøverne. Sluk for vakuumpumpen efter evakuering af tørremaskinen.Udluftning af udsnittet forsigtigt uden at forstyrre prøverne. Tænd vakuumpumpen igen, og sluk den efter evakuering af tørremaskinen. Åbn tørressikkatoren forsigtigt uden at støde den fikserende opløsning i mikrorøret.Fjern den fikserende opløsning, og tilsæt 1x PBS med en mikropipette. Efter opbevaring i et minut skal du udskifte den gamle PBS med ny 1x PBS. Efter fjernelse af PBS ved fem gange prøvevolumenet af clearingopløsningen forsegles mikrorøret med parafilm og laves huller med en nål.Anbring prøverne i ekssikkatoren. Evakuer og sluk for vakuumpumpen. Åbn forsigtigt tørremaskinen, og luk derefter mikrorøret.Omvendt mikrorøret hver anden til anden dag for at fremskynde clearingprocessen. Til afstandsrammen skal du skære et silikonegummiark med et barberblad, der justerer silikonegummipladens tykkelse i henhold til prøvetykkelsen. Placer silikonerammen på et dækglas, læg derefter de behandlede prøver inden for rammen og tilsæt ca. 100 mikroliter clearingopløsning for at fjerne eventuelle bobler.Dæk med et andet dækglas for at forhindre fordampning af rydningsopløsningen. Overhold prøverne under et fluorescerende mikroskop. Efter observation returneres prøverne til clearingopløsning i et mikrorør.Faste blade af forskellige arter blev inkuberet i PBS eller ClearSee i otte dage, i ClearSee eller ClearSeeAlpha i to dage. ClearSee kan rydde blade af forskellige arter. Efter ekstraktion af kutikulær kunne ClearSee rydde risblade.Da natriumsulfitkomponenten i ClearSeeAlpha forhindrer polyphenoloxidation på grund af den reducerende virkning, kan ClearSeeAlpha rydde tobaks- og tiraniapistiller uden brun pigmentering. Ubiquitin-10 promotor H2B-mClover blade af arabidopsis thaliana blev behandlet med PBS eller ClearSee i tre dage. ClearSee-behandlingen reducerede den lysegrønne farve på arabidopsis H2B-mClover-bladet og forbedrede fluorescensintensiteten af H2B-mClover sammenlignet med PBS-inkubation.ClearSee-behandlede blade blev observeret ved to-foton-excitationsmikroskopi med 950 nanometer excitation. Cellevæggen er farvet med calcaflour-hvid. Kerner er mærket med ubiquitin-10 promotor, H2B-mClover.Y Z- og X Z-billederne er tværsnit i den position, der er angivet med de hvide stiplede linjer. Fremstilling af den fikserende opløsning er vigtig for at fastgøre prøverne. Der skal dog sørges for at forhindre beskadigelse af prøverne under vakuum.Mikroskopisk billeddannelse kan udføres for at studere flere genekspressionsmønstre og intracellulær kommunikation under planteudvikling og infektion efter denne procedure.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Plant Cell Structure and Organization

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Højtryks-Frysning og Quick Freeze Substitution af plantevævene for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisere Stromule Frekvens med Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...