Name: optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging
Uploaded: 2022-01-05T15:00:00
Duration: 4 min 55 s
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Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 to T.H.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B, JP17H03697 to D.K.), Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (JP18K19331 to D.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP20H05358 for D.K.)) und der Japan Science and Technology Agency (PRESTO program (JPMJPR15QC to Y.M., JPMJPR18K4 bis D.K.)). Die Autoren danken dem Live Imaging Center am Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM) der Nagoya University für die Unterstützung der mikroskopischen Studien und Editage (www.editage.com) für die Bearbeitung der englischen Sprache.

1. Erstellung von Clearinglösungen
<ol><li>Zur Herstellung einer CS-Lösung lösen Sie 10% (w/v) Xylitol, 15% (w/v) Natriumdesoxycholat und 25% (w/v) Harnstoff in destilliertem Wasser auf einem Magnetrührer auf. HINWEIS: Natriumdesoxycholatpulver sollte in einer Zugkammer gewogen werden, da es leicht in der Luft schwimmt. CS kann bei Raumtemperatur bei Dunkelheit länger als 1 Jahr gelagert werden.</li>
	<li>Um CSA-Lösung herzustellen, fügen Sie Natriumsulfit (50 mM Endkonzentration) zu der oben erhaltenen CS-Lösung hinzu. HINWEIS: Fügen Sie der CS-Lösung direkt vor der Verwendung Natriumsulfit hinzu, da das Reduktionsmittel leicht deaktiviert wird.</li>
</ol>2. Vorbereitung der fixativen Lösung
<ol><li>Geben Sie 40 ml sterilisiertes Wasser in ein konisches Röhrchen und fügen Sie 2 g Paraformaldehyd hinzu. Fügen Sie 200 μL 2 N NaOH hinzu, um den pH-Wert der Lösung zu erhöhen. Nach dem Schließen und Versiegeln des Tubus mit Parafilm bei 60 °C mit gelegentlichen Inversionen inkubieren, bis sich alles aufgelöst hat.</li>
	<li>Nachdem Sie die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt haben, fügen Sie 5 ml 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Fügen Sie sterilisiertes Wasser hinzu, um das Volumen auf 50 ml zu erhöhen. HINWEIS: Eine frisch zubereitete Fixierlösung wird bevorzugt. Die Lösung kann auch mehrere Monate bei -30 °C gelagert werden.</li>
</ol>3. Fixierung der Proben
<ol><li>Tauchen Sie Pflanzenproben in die fixierende Lösung in einem Mikroröhrchen ein (Abbildung 1A), und stellen Sie sicher, dass das Volumen der fixierenden Lösung mehr als das Fünffache des Probenvolumens beträgt.</li>
	<li>Verschließen Sie das Mikroröhrchen mit einem Parafilm und machen Sie Löcher mit einer Nadel. Lassen Sie das Rohr nicht offen, da die Gefahr besteht, dass die Probe während der Vakuumdekompression verschüttet wird.</li>
	<li>Legen Sie das Mikroröhrchen in einen Exsikkator und stellen Sie den Vakuumgrad (~690 mmHg) langsam so ein, dass allmählich Blasen aus den Proben auftreten (Abbildung 1B-C). Schalten Sie die Vakuumpumpe aus, nachdem Sie den Exsikkator evakuiert haben. Lassen Sie das Mikroröhrchen 30 min bei Raumtemperatur ungestört.</li>
	<li>Entlüften Sie den Exsikkator vorsichtig, um eine Störung der Proben zu vermeiden. Schalten Sie die Vakuumpumpe wieder ein und schalten Sie sie nach der Evakuierung des Exsikkators aus. Lassen Sie das Mikroröhrchen 30 min bei Raumtemperatur ungestört. HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass die Proben beim Entlüften des Exsikkators beschädigt werden. Das Eindringen der fixierenden Lösung in die Proben wird durch zwei Vakuumbehandlungen verstärkt. Eine weitere Vakuumbehandlung hilft, die fixierende Lösung in dickere Proben einzudringen.</li>
	<li>Öffnen Sie den Exsikkator vorsichtig, ohne die Fixierlösung im Mikroröhrchen zu stoßen. Entfernen Sie mit einer Mikropipette die Fixierlösung und fügen Sie 1x PBS hinzu. Ersetzen Sie nach der Lagerung für 1 min den alten PBS durch den neuen 1x PBS (Abbildung 1D).</li>
</ol>4. Clearing
<ol><li>Nachdem Sie PBS entfernt haben, fügen Sie das Fünffache des Probenvolumens der Clearinglösung hinzu.</li>
	<li>Verschließen Sie das Mikroröhrchen mit Parafilm und machen Sie Löcher mit einer Nadel. Legen Sie die Proben in den Exsikkator, evakuieren Sie wie in Schritt 3.3 und schalten Sie die Vakuumpumpe aus. Lassen Sie das Mikroröhrchen 60 min bei Raumtemperatur ungestört.</li>
	<li>Öffnen Sie den Exsikkator vorsichtig. Schließen Sie das Mikroröhrchen mit Parafilm und lagern Sie es bei Raumtemperatur im Dunkeln, um ein Photobleichen von fluoreszierenden Proteinen zu vermeiden. Invertieren Sie das Mikroröhrchen alle 1-2 Tage, um den Clearing-Prozess zu beschleunigen.</li>
	<li>Wenn die Clearinglösung grün wird, ersetzen Sie sie durch neue Clearinglösungen, bis die Lösung farblos bleibt (Abbildung 1E-H).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig01.jpg"> Abbildung 1: Verfahren zur CS-Behandlung. (A) Arabidopsis-Keimling in 4%iger PFA-Lösung (Paraformaldehyd). (B) Die Probe wird in ein Exsikkator gegeben. (C) Der Sämling wird unter einem Vakuum fixiert. (D) Der Sämling wird nach der Vakuumbehandlung in der PFA-Lösung eingeweicht. (E) Daraus resultierender 3-tägiger mit Lösung behandelter Sämling. Beachten Sie die grüne Farbe der Clearinglösung. (F) Die Clearinglösung wird 3 Tage nach der Behandlung ersetzt. (G) Daraus resultierender 5-tägiger lösungsbehandelter Sämling. (H) Die Clearinglösung wird 5 Tage nach der Behandlung ersetzt. Maßstabsleisten: 1 cm (A,C-H) und 5 cm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
5. Chemische Farbstofffärbung
<ol><li>In das Mikroröhrchen geben Sie Hoechst 33342 (Endkonzentration von 10 μg/ml) für die Kernfärbung oder Calcofluor White (Endkonzentration von 1 mg/ml) für die Zellwandfärbung und warten Sie 1 h. Nachdem Sie die Farbstofflösung entfernt haben, waschen Sie die Probe mit einer frischen Klärlösung für 1 h. HINWEIS: Flecken und Waschen über Nacht können das Eindringen von fluoreszierenden Farbstoffen in das Gewebe verbessern und die Hintergrundfluoreszenz reduzieren. Verschiedene fluoreszierende Farbstoffe sind mit der CS-Lösung kompatibel, wie Basic Fuchsin9 (Lignin), Auramine O9 (Lignin, Suberin und Cutin), Nile Red9 (Suberin), Direct Yellow 969, Direct Red 239 und SR220010,11 (Zellwände).</li>
</ol>6. Beobachtung
<ol><li>Schneiden Sie eine Silikongummifolie mit einer Rasierklinge, um einen Rahmen für den Abstandshalter vorzubereiten (Abbildung 2A). HINWEIS: Stellen Sie die Dicke der Silikonkautschukplatte entsprechend der Dicke der Probe ein. Da Proben, die mit Clearinglösung behandelt wurden, weich sind, werden sie beschädigt, wenn sie direkt mit dem Deckglas bedeckt werden.</li>
	<li>Setzen Sie den Silikonrahmen auf Deckglas (z. B. 25 x 60 mm) (Abbildung 2B). Legen Sie die behandelten Proben in den Rahmen und fügen Sie ~ 100 μL Klärlösung hinzu, um alle Blasen im Rahmen zu entfernen. Mit einem weiteren Deckglas (18 x 18 mm oder 24 x 24 mm) abdecken, um ein Verdampfen der Räumlösung zu verhindern (Abbildung 2C).</li>
	<li>Beobachten Sie die Proben unter einem fluoreszierenden Mikroskop. Nach der Beobachtung werden die Proben in einem Mikroröhrchen in die Klärlösung zurückgeführt und bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig02.jpg"> Abbildung 2: Probenvorbereitung für die mikroskopische Beobachtung. (A) Schneiden Sie eine 0,2 mm dicke Silikonfolie in einen Rahmen. (B) Setzen Sie den Silikonplattenrahmen auf das Deckglas auf. (C) Legen Sie die mit Klärlösung behandelte Probe (gekennzeichnet durch gepunkteten Rand) in den Rahmen und bedecken Sie sie mit einem Deckglas. Maßstabsstäbe: 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+reveals+that+positions+of+cyst+nematode+feeding+sites+relative+to+xylem+vessels+differ+between+susceptible+and+resistant+wheat.">Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat.</a> Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).</li><li>Nouri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+suppression+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+involves+gibberellic+acid+signaling.">Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).</li><li>Evangelisti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+enables+the+identification+and+quantification+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi+in+plant+roots.">Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots.</a> bioRxiv. , 434067 (2021).</li></ol>

ClearSee wird kommerzialisiert (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Japan). Die Universität Nagoya hält ein Patent (JP6601842) auf das Clearing-Reagenz ClearSee. D. Kurihara ist der Patenterfinder. Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Diese Methode besteht aus Fixieren, Waschen und Reinigen. Die Fixierung ist ein kritischer Schritt in diesem Protokoll. Wenn das fluoreszierende Protein nach der PFA-Fixierung nicht beobachtet wird, wird es nach der Behandlung mit Clearinglösung nicht beobachtet. Das Eindringen von PFA-Lösung in Gewebe ist kritisch, aber eine Hochvakuumbehandlung wird nicht empfohlen, da sie die Zellstruktur zerstören kann. Vakuumbedingungen und Fixationszeiten sollten für jede Art von Gewebe und Spezies optimiert werden. Es wird empfohlen, fluoreszierende Proteine auch nach der Fixierung zu überprüfen. Obwohl die Proben in der Regel für 30-60 min bei Raumtemperatur fixiert wurden, können sie über einen längeren Zeitraum (über Nacht oder mehr) bei 4 °C fixiert werden.
Wie in Abbildung 6A gezeigt, hatten einige Natriumdesoxycholate eine blassgelbe Farbe, wenn sie aufgelöst wurden. Solche Natriumdesoxycholat-Lösungen zeigten eine starke Autofluoreszenz im 400-600-nm-Bereich nach Anregung bei 380 nm (Abbildung 6B). Diese Autofluoreszenz verhindert optisches Clearing und Fluoreszenzbildgebung. Benutzer sollten die Farbe der Natriumdesoxycholatlösung überprüfen, da die Qualität des Reagenzes aufgrund von Reinheit, Chargenschwankungen oder anderen Gründen abweichen kann.
Die hier verwendeten Clearinglösungen weisen hohe Konzentrationen an Natriumdesoxycholat auf, die die Membranstruktur zerstören könnten. Der Plasmamembranmarker (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) wurde auch nach der CS-Behandlung beobachtet7. Es könnte jedoch besser sein, die Konzentration von Natriumdesoxycholat zu reduzieren, abhängig von der Struktur und dem interessierenden Gewebe. Tatsächlich wurden Bilder mit verbesserter Klarheit für Arabidopsis-Stempel mit modifiziertem CS erhalten, bei denen die Konzentration von Natriumdesoxycholat um die Hälfte reduziert wird; Reduzierte Konzentrationen von Natriumdesoxycholat erforderten jedoch längere Behandlungszeiten (z. B. 1 Monat für Arabidopsis-Stempel ).
CS kann die rote Autofluoreszenz (>610 nm) reduzieren, um Chlorophyll in behandelten Proben zu entfernen. Die Autofluoreszenz im Bereich von 500 bis 600 nm (gelb bis orange) blieb jedoch auch in CS-behandelten Proben bestehen7. Es wird angenommen, dass diese Autofluoreszenz von der Zellwand und anderen zellulären Komponenten wie Lignin12,13 abgeleitet wird. Daher ist es schwierig, Gewebe, wie Stängel mit entwickelten Sekundärwänden, durch CS-Behandlung vollständig transparent zu machen.
Mehrere Clearing-Reagenzien neben den hier verwendeten wurden entwickelt, um fluoreszierende Proteine in Pflanzen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten14,15,16,17. Im Vergleich zu diesen Methoden entfernen CS und CSA Chlorophyll und reduzieren die Autofluoreszenz, wodurch das Pflanzengewebe transparenter wird. Vor kurzem haben Sakamoto et al. eine verbesserte Methode, iTOMEI, für die Fixierung, das Reinigungsmittel-Clearing und die Montage entwickelt, um die Brechungsindex-Fehlanpassung anzupassen18. In Arabidopsis-Sämlingen klärte iTOMEI das Gewebe innerhalb von 26 h.
CS ist auf eine Vielzahl von Pflanzenarten anwendbar, wie Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, barley22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Eucalyptus25, Mais26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, soybean33, strawberry34, wheat35 und Wolffiella hyalina36. Für dickeres Gewebe kann CS auch die Vibratomabschnitte transparent machen37,38. Diese Methode ermöglichte Studien der zellulären Struktur und der Genexpressionsmuster in Pflanzen37,38. Darüber hinaus wurden Nematodeninfektionen20,39, Pilzinfektionen und Symbiose19,40,41 auch tief im Inneren des CS-behandelten Gewebes beobachtet. Somit ist diese Methode nützlich für die Bildgebung ganzer Gewebe von der Mikro- bis zur Makroskala und könnte helfen, neuartige Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zellen, Geweben, Organen und Organismen zu entdecken.

Die Visualisierung zellulärer Strukturen und die Lokalisation von Proteinen in lebenden Organismen ist wichtig, um ihre Funktionen in vivo zu klären. Da der lebende Körper jedoch nicht transparent ist, ist es eine Herausforderung, die innere Struktur lebender Organismen ohne Sezierung zu beobachten. Insbesondere bei Pflanzengeweben, die mit Zellen unterschiedlicher Form vielschichtig sind, ist die Indexabweichung, die durch ihre Struktur und das Vorhandensein von lichtabsorbierenden Pigmenten verursacht wird, problematisch. Zum Beispiel haben Pflanzenblätter eine komplexe Struktur, die es ihnen ermöglicht, das Licht, das in ihren Körper gelangt, effizient für die Photosynthese zu nutzen1, während die Struktur auch eine Fehlanpassung des Brechungsindex verursacht, was ihre Beobachtung erschwert. Blätter haben jedoch viele lichtabsorbierende Pigmente, wie Chlorophyll, die starke rote Fluoreszenz emittieren und bräunliche Pigmente durch Oxidation entstehen2,3. Diese Pigmente behindern auch ganzmontierbare Fluoreszenzmikroskopie-Beobachtungen in Pflanzen. Daher werden zur Beobachtung der inneren Struktur von Pflanzen seit langem Entfärbung und Fixierung durch Alkohol und Clearing mit Chloralhydrat verwendet, um die Brechungsindex-Mismatch und Autofluoreszenz zu beseitigen4,5. Diese konventionellen Methoden werden seit vielen Jahren übernommen, haben aber den Nachteil, dass sie gleichzeitig die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine eliminieren6,7. Dies ist problematisch, da fluoreszierende Proteine aus der aktuellen fluoreszierenden Bildgebung nicht mehr wegzudenken sind.
Daher wurden ClearSee (CS) und ClearSeeAlpha (CSA) als optische Clearing-Reagenzien für Pflanzengewebe entwickelt. Beide Reagenzien reduzieren die Chlorophyll-Autofluoreszenz und erhalten gleichzeitig die Stabilität fluoreszierender Proteine7,8. CSA ist besonders nützlich, wenn braune Pigmente aufgrund von Gewebeoxidation produziert werden. Mit diesen Clearing-Reagenzien ist es möglich, die Zellstruktur und Proteinlokalisation im Pflanzenkörper ohne physikalische Schnitte zu beobachten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcofluor White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearSee</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18&#215;18 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24&#215;24 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C024241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (25&#215;60 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>AS One</td>
			<td>1-5801-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>346-07951</td>
			<td>1 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS One</td>
			<td>6-9085-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>C0316</td>
			<td>Figure 6_1; Lot PSGYK-QB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Kishida Chemical</td>
			<td>260-71412</td>
			<td>Figure 6_2; Lot C05543H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Figure 6_3; Lot SLBS7362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td>Figure 6_4; Lot BCBW0612</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>10712-96</td>
			<td>Figure 6_5; Lot M5R3403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>194-08311</td>
			<td>Figure 6_6; Lot LKL0648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-03411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>211-01213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>BUCHI</td>
			<td>V-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylitol</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>248-00545</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging

Es ist eine Herausforderung, die innere Struktur von mehrschichtigen und undurchsichtigen Pflanzenproben ohne Dissektion direkt unter dem Mikroskop zu beobachten. Darüber hinaus behindert die Autofluoreszenz, die dem Chlorophyll zugeschrieben wird, die Beobachtung von fluoreszierenden Proteinen in Pflanzen. Lange Zeit werden verschiedene Clearing-Reagenzien eingesetzt, um Pflanzen transparent zu machen. Herkömmliche Clearing-Reagenzien verringern jedoch Fluoreszenzsignale; Daher war es nicht möglich, die zellulären und intrazellulären Strukturen mit fluoreszierenden Proteinen zu beobachten. Es wurden Reagenzien entwickelt, die Pflanzengewebe durch Entfernung von Chlorophyll reinigen und gleichzeitig die Stabilität fluoreszierender Proteine aufrechterhalten können. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die optische Clearung von Pflanzengeweben mit Clearing-Reagenzien, ClearSee (CS) oder ClearSeeAlpha (CSA) bereitgestellt. Die Herstellung von gereinigtem Pflanzengewebe umfasst drei Schritte: Fixierung, Waschen und Reinigen. Die Fixierung ist ein entscheidender Schritt zur Aufrechterhaltung der zellulären Strukturen und der intrazellulären Stabilität fluoreszierender Proteine. Die Inkubationszeit für das Clearing hängt vom Gewebetyp und der Spezies ab. Bei Arabidopsis thaliana betrug die für die Reinigung mit CS erforderliche Zeit 4 Tage für Blätter und Wurzeln, 7 Tage für Sämlinge und 1 Monat für Stempel. CS benötigte auch eine relativ kurze Zeit von 4 Tagen, um die gametophytischen Blätter von Physcomitrium patens transparent zu machen. Im Gegensatz dazu produzierten Stempel in Tabak und Torenia braunes Pigment aufgrund von Oxidation während der CS-Behandlung. CSA reduzierte das braune Pigment, indem es die Oxidation verhinderte und Tabak- und Torenia-Stempel transparent machen konnte, obwohl es relativ lange dauerte (1 oder 2 Monate). CS und CSA waren auch mit der Färbung mit chemischen Farbstoffen kompatibel, wie DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) und Hoechst 33342 für DNA und Calcofluor White, SR2200 und Direct Red 23 für die Zellwand. Diese Methode kann für die Bildgebung ganzer Pflanzen nützlich sein, um intakte Morphologie, Entwicklungsprozesse, Pflanzen-Mikroben-Interaktionen und Nematodeninfektionen aufzudecken.

CS kann Blätter verschiedener Arten reinigen (Abbildung 3A-H). Es ist schwierig für die CS-Lösung, ein Reisblatt zu durchdringen, da die Blattoberfläche in dieser Pflanze mit Kutikularwachs bedeckt ist. Nach der Extraktion des kutikulären Wachses durch Eintauchen in Chloroform für 10 s konnte CS jedoch die Reisblätter entfernen (Abbildung 3H). CS konnte jedoch nicht in Chamaecyparis obtusa-Blätter eindringen, die für CS weniger durchlässig sind (Abbildung 3I, J). In Chrysanthemenblättern wurde in den CS-behandelten Blättern eine durch Polyphenoloxidation induzierte braune Pigmentierung beobachtet (Abbildung 3K, L). In ähnlicher Weise zeigten Tabak- und Torenia-Stempel während der CS-Behandlung eine braune Pigmentierung (Abbildung 3M,O). Da die Natriumsulfitkomponente in CSA aufgrund der reduzierenden Wirkung die Oxidation von Polyphenolen verhindert, könnte CSA Tabak- und Torenia-Stempel ohne braune Pigmentierung beseitigen (Abbildung 3N, P).
Abbildungen 4B zeigen, dass die CS-Behandlung die blassgrüne Farbe des Arabidopsis H2B-mClover-Blattes (helles Feld) reduzierte und die Fluoreszenzintensität von H2B-mClover im Vergleich zur PBS-Inkubation erhöhte (Abbildung 4A). Neben Blütenpflanzen ist CS auch auf Moospflanzen anwendbar (Abbildung 4C); nach 4 Tagen CS-Behandlung wurde die Fluoreszenz von H2B-mRFP für das gesamte Gametophor mit reduzierter Chlorophyll-Autofluoreszenz eindeutig nachgewiesen. Die Abbildungen 4D,E zeigen 3D-Rekonstruktionsbilder des H2B-mClover-Stempels in Nicotiana benthamiana, die mit CSA geräumt wurden. Die Probentiefe betrug 440 μm. Wie das tiefencodierte Projektionsbild mit maximaler Intensität zeigt, ermöglicht CSA eine tiefe Bildgebung von anspruchsvollem Gewebe wie Tabakstempeln.
CS und CSA waren auch mit der Fluoreszenzfarbstofffärbung kompatibel. Abbildung 5 zeigt, dass CS gleichzeitig verwendet werden könnte, um das fluoreszierende Protein (H2B-mClover) und die organische Fluoreszenzfarbstofffärbung (Calcofluor White) zu beobachten. Nach der 3D-Rekonstruktion aus den Z-Stack-Bildern konnte jeder Ausschnitt beobachtet werden.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig03.jpg"> Abbildung 3: Optische Räumung von Blättern und Stempeln mittels Clearinglösungen. (A-L) Feste Blätter verschiedener Arten wurden in PBS (A,C,E,G,I,K) oder CS (B,D,F,H,J,L) für 8 Tage und CS (M,O) oder CSA (N,P) für 2 Tage inkubiert. (A,B,O,P) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) Chrysanthemum morifolium, (M,N) Nicotiana benthamiana. Maßstabsstangen: 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig04.jpg"> Abbildung 4: Fluoreszenzbildgebung von Geweben, die mit Clearinglösungen behandelt wurden. (A,B) UBQ10pro::H2B-mClover-Blätter von Arabidopsis thaliana wurden 3 Tage lang mit PBS (A) oder CS (B) behandelt. (C) H2B-mRFP-Blatt-Gametophoren von Physcomitrium patens wurden 4 Tage lang mit CS behandelt. Die Kerne wurden mit H2B-mRFP (grün) markiert. Die CS-Behandlung reduzierte die Chlorophyll-Autofluoreszenz (Magenta). Das H2B-mRFP-Signal im apikalen Bereich wurde sowohl für zusammengeführte Bilder von H2B-mRFP als auch für Autofluoreszenz oder Hellfeld eindeutig beobachtet. (D,E) Das UBQ10pro::H2B-mClover-Stigma von Nicotiana benthamiana wurde 1 Monat lang in CSA behandelt. Die Projektion mit maximaler Intensität (D) und die tiefencodierte Projektion mit maximaler Intensität (E) wurden aus 88 z-Stack-Bildern in Intervallen von 5 μm erzeugt. Maßstabsstäbe: 100 μm. Die Bilder wurden mittels Weitfeldmikroskopie (A,B), konfokal (C) und Zwei-Photonen-Anregung (D,E) aufgenommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig05.jpg"> Abbildung 5: Die Fluoreszenzfarbstofffärbung ist mit CS kompatibel. (A) CS-behandelte Blätter, beobachtet durch Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie mit 950-nm-Anregung. Die Zellwand ist mit Calcofluor White (Cyan) gefärbt. Kerne sind mit UBQ10pro::H2B-mClover (gelb) gekennzeichnet. Die Bilder yz (B) und xz (C) sind Querschnitte an der Position, die durch die weiß gestrichelten Linien in (A) angezeigt wird. Maßstabsbalken: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig06.jpg"> Abbildung 6: Transparenz von Natriumdesoxycholat. (A) Farben verschiedener 15%iger Natriumdesoxycholate (in der Materialtabelle aufgeführt). (B) Fluoreszenzspektrum jedes 15%igen Natriumdesoxycholats mit 380-nm-Anregung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Hier wird ein Verfahren beschrieben, um pflanzliches Gewebe transparent zu machen und gleichzeitig die Stabilität fluoreszierender Proteine zu erhalten. Diese Technik ermöglicht eine tiefe Bildgebung von gereinigtem Pflanzengewebe ohne physikalische Schnitte.

Optische Reinigung von Pflanzengeweben für die Fluoreszenzbildgebung

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Diese Methode kann in der Ganzpflanzenbildgebung hilfreich sein, um intakte Morphologie, Entwicklungsprozesse und Wechselwirkungen zwischen Pflanze und Mikrobe aufzudecken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir das Innere eines Pflanzenkörpers direkt beobachten können, ohne ihn zu beschädigen. Da diese Methode auf eine Vielzahl von Pflanzenarten und -geweben angewendet wird, kann sie dazu beitragen, die Entdeckung neuer Phänomene in der pflanzenbiologischen Forschung zu beschleunigen.Die Fixierung ist ein kritischer Schritt in diesem Verfahren. Vor dem Clearing-Schritt muss man die Intensität des fluoreszierenden Proteins nach der Fixierung überprüfen. Um zu beginnen, tauchen Sie Pflanzenproben in die fixierende Lösung in einem Mikroröhrchen und stellen Sie sicher, dass das Volumen der fixativen Lösung mehr als das Fünffache des Probenvolumens beträgt.Verschließen Sie das Mikroröhrchen mit einem Parafilm und machen Sie Löcher mit einer Nadel. Legen Sie das Mikroröhrchen in einen Exsikkator und stellen Sie den Vakuumgrad langsam auf etwa 690 Millimeter Quecksilber ein, so dass allmählich Blasen aus den Proben entstehen. Schalten Sie die Vakuumpumpe aus, nachdem Sie den Exsikkator evakuiert haben.Entlüften Sie das Trockenmittel vorsichtig, ohne die Proben zu stören. Schalten Sie die Vakuumpumpe wieder ein und schalten Sie sie nach der Evakuierung des Exsikkators aus. Öffnen Sie den Exsikkator vorsichtig, ohne die Fixierlösung im Mikroröhrchen zu stoßen.Entfernen Sie die Fixierlösung und fügen Sie 1x PBS mit einer Mikropipette hinzu. Nachdem Sie eine Minute gelagert haben, ersetzen Sie den alten PBS durch den neuen 1x PBS. Nachdem Sie PBS mit dem Fünffachen des Probenvolumens der Clearinglösung entfernt haben, verschließen Sie das Mikroröhrchen mit Parafilm und machen Sie Löcher mit einer Nadel.Legen Sie die Proben in das Exsikkator. Evakuieren und schalten Sie die Vakuumpumpe aus. Öffnen Sie den Exsikkator vorsichtig und schließen Sie dann das Mikroröhrchen.Invertieren Sie das Mikroröhrchen alle ein bis zwei Tage, um den Clearing-Prozess zu beschleunigen. Schneiden Sie für den Abstandshalterrahmen eine Silikongummiplatte mit einer Rasierklinge und passen Sie die Dicke der Silikonkautschukfolie entsprechend der Probendicke an. Legen Sie den Silikonrahmen auf ein Deckglas, legen Sie dann die behandelten Proben in den Rahmen und fügen Sie etwa 100 Mikroliter Klärlösung hinzu, um Blasen zu entfernen.Mit einem weiteren Deckglas abdecken, um ein Verdampfen der Räumlösung zu verhindern. Beobachten Sie die Proben unter einem fluoreszierenden Mikroskop. Nach der Beobachtung werden die Proben in einem Mikroröhrchen in die Klärlösung zurückgeführt.Feste Blätter verschiedener Arten wurden acht Tage lang in PBS oder ClearSee inkubiert, in ClearSee oder ClearSeeAlpha zwei Tage lang. ClearSee kann Blätter verschiedener Arten entfernen. Nach der Extraktion der Nagelhaut konnte ClearSee Reisblätter entfernen.Da die Natriumsulfitkomponente in ClearSeeAlpha aufgrund der reduzierenden Wirkung eine Polyphenoloxidation verhindert, könnte ClearSeeAlpha Tabak- und Tirantia-Stempel ohne braune Pigmentierung entfernen. Ubiquitin-10 Promotor H2B-mClover Blätter von Arabidopsis thaliana wurden drei Tage lang mit PBS oder ClearSee behandelt. Die ClearSee-Behandlung reduzierte die blassgrüne Farbe des Arabidopsis H2B-mClover-Blattes und erhöhte die Fluoreszenzintensität von H2B-mClover im Vergleich zur PBS-Inkubation.Die mit ClearSee behandelten Blätter wurden mittels Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie mit 950-Nanometer-Anregung beobachtet. Die Zellwand ist mit kalcamehl-weiß gefärbt. Kerne sind mit Ubiquitin-10-Promotor, H2B-mClover, gekennzeichnet.Die Bilder von Y Z und X Z sind Querschnitte an der Position, die durch die weiß gestrichelten Linien angezeigt wird. Die Vorbereitung der fixativen Lösung ist wichtig, um die Proben zu fixieren. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, dass Schäden an den Proben unter Vakuum vermieden werden.Eine mikroskopische Bildgebung kann durchgeführt werden, um mehrere Genexpressionsmuster und intrazelluläre Kommunikation während der Pflanzenentwicklung und -infektion nach diesem Verfahren zu untersuchen.

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