Name: optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging
Uploaded: 2022-01-05T15:00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (מענק בסיוע למחקר מדעי על תחומים חדשניים (JP16H06464, JP16H06280 ל- T.H.), מענק סיוע למחקר מדעי (B, JP17H03697 ל- D.K.), מענק בסיוע למחקר אקספלורציה מאתגר (JP18K19331 ל- D.K.), מענק בסיוע למחקר מדעי על תחומים חדשניים (JP20H0H053358 עבור D.K.)) וסוכנות המדע והטכנולוגיה היפנית (תוכנית PRESTO (JPMJPR15QC עד Y.M., JPMJPR18K4 לD.K.)). המחברים מודים למרכז ההדמיה החיה במכון לביו-מולקולות טרנספורמטיביות (WPI-ITbM) של אוניברסיטת נגויה על תמיכתם במחקרים המיקרוסקופיים ובעריכה (www.editage.com) לעריכת השפה האנגלית.

1. הכנת פתרונות סליקה
<ol><li>להכנת פתרון CS, להמיס 10% (w / v) קסיליטול, 15% (w / v) נתרן deoxycholate, ו 25% (w / v) אוריאה במים מזוקקים על מערבל מגנטי. הערה: אבקת נתרן deoxycholate צריך להיות נשקל בתא טיוטה כפי שהוא צף בקלות באוויר. ניתן לאחסן במדעי המחשב בטמפרטורת החדר בחושך במשך יותר משנה אחת.</li>
	<li>כדי להכין פתרון CSA, להוסיף נתרן סולפיט (ריכוז סופי 50 mM) לפתרון CS המתקבל לעיל. הערה: הוסף נתרן סולפיט לפתרון הפקולטה למדעי המחשב ממש לפני השימוש כאשר הסוכן המפחית מתבטל בקלות.</li>
</ol>2. הכנת הפתרון הקבוע
<ol><li>מעבירים 40 מ"ל של מים מעוקרים לתוך צינור חרוטי ומוסיפים 2 גרם של paraformaldehyde. הוסף 200 μL של 2 N NaOH כדי להגדיל את ה- pH של הפתרון. לאחר סגירה ואיטום הצינור עם parafilm, דגירה ב 60 °C (60 °F) עם היפוכים מדי פעם עד שהכל מתמוסס.</li>
	<li>לאחר קירור הפתרון לטמפרטורת החדר, הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת מלח עם חוצץ פוספט 10x (PBS) כדי להתאים את ה-pH ל-7.4. מוסיפים מים מעוקרים כדי להפוך את הנפח ל 50 מ"ל. הערה: פתרון קבוע שהוכן טרי הוא מועדף. הפתרון יכול גם להיות מאוחסן ב -30 °C (50 °F) במשך מספר חודשים.</li>
</ol>3. קיבוע של דגימות
<ol><li>טבול דגימות צמחים בתמיסה הקיבוצית במיקרו-טיוב (איור 1A), והבטיח שהנפח של הפתרון הקיבוצי הוא יותר מפי חמישה מנפח הדגימה.</li>
	<li>לאטום את microtube עם parafilm ולעשות חורים באמצעות מחט. אין להשאיר את הצינור פתוח בשל סיכון של שפיכת מדגם במהלך הפחתת לחץ ואקום.</li>
	<li>הניחו את המיקרו-צינור במייבש והתאמו לאט לאט את מידת הוואקום (~690 מ"מ כספית) כך שהבועות יופיעו בהדרגה מהדגימות (איור 1B-C). כבה את משאבת הוואקום לאחר פינוי המייבש. השאר את המיקרו-צינור ללא הפרעה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לפרוק את המייבש בזהירות כדי למנוע הפרעה הדגימות. הפעל שוב את משאבת הוואקום וכבה אותה לאחר פינוי המייבש. השאר את המיקרו-צינור ללא הפרעה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: יש להקפיד על מניעת נזק לדגימות בעת אוורור התייבשות. החדירה של הפתרון הקיבוצי לדגימות משופרת על ידי שני טיפולי ואקום. טיפול ואקום נוסף מסייע לחדור את הפתרון הקיבוצי לדגימות עבות יותר.</li>
	<li>פתח את התייבשות בזהירות מבלי להקפיץ את הפתרון הקיבוצי במיקרו-tube. באמצעות micropipette, להסיר את הפתרון הקיבוצי ולהוסיף 1x PBS. לאחר אחסון למשך דקה אחת, החליפו את ה-PBS הישן ב-PBS 1x חדש (איור 1D).</li>
</ol>4. סליקה
<ol><li>לאחר הסרת PBS, הוסף פי חמישה מאמצעי האחסון לדוגמה של פתרון הסליקה.</li>
	<li>לאטום את microtube עם parafilm ולעשות חורים באמצעות מחט. מניחים את הדגימות במייבש, להתפנות כמו בשלב 3.3, ולכבות את משאבת ואקום. השאר את המיקרו-צינור ללא הפרעה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>פתח את המייבש בעדינות. סגור את המיקרו-צינור עם parafilm ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר בחושך, כדי למנוע צילום הלבנה של חלבונים פלואורסצנטיים. הפוך את המיקרו-צינור כל 1-2 ימים כדי להאיץ את תהליך הסליקה.</li>
	<li>כאשר פתרון הסליקה הופך לירוק, החלף אותו בפתרונות סליקה חדשים עד שהפתרון יישאר חסר צבע (איור 1E-H).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig01.jpg"> איור 1: הליך לטיפול במדעי המחשב. (א) שתיל Arabidopsis בפתרון PFA (Paraformaldehyde) של 4%. (B) המדגם ממוקם במייבש. (ג) השתיל קבוע תחת ואקום. (ד) השתיל ספוג בתמיסת PFA לאחר טיפול בוואקום. (ה) וכתוצאה מכך 3 ימים ניקוי פתרון טיפול שתיל. שים לב לצבע הירוק של פתרון הסליקה. (ו) פתרון הסליקה מוחלף 3 ימים לאחר הטיפול. (ז) וכתוצאה מכך 5 ימים ניקוי פתרון טיפול שתיל. (ח) פתרון הסליקה מוחלף 5 ימים לאחר הטיפול. סרגלי קנה מידה: 1 ס"מ (A, C-H) ו 5 ס"מ (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
5. כתמי צבע כימיים
<ol><li>למיקרו-צינור, הוסיפו את Hoechst 33342 (ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל) להכתמה גרעינית או לבן קלקופלואור (ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל) להכתמת דופן התא והמתינו שעה אחת. לאחר הסרת תמיסת הצבע, לשטוף את הדגימה עם פתרון ניקוי טרי במשך 1 שעות. הערה: כתמים ושטיפה במהלך הלילה יכולים לשפר את חדירת הצבע הפלואורסצנטי לרקמות ולהפחית את פלואורסצנטיות הרקע. צבעים פלואורסצנטיים שונים תואמים לפתרון CS כגון Fuchsin9 בסיסי (ליגנין), אוראמין O9 (ליגנין, suberin, ו cutin), הנילוס Red9 (suberin), צהוב ישיר 969, אדום ישיר 239, ו SR220010,11 (קירות תא).</li>
</ol>6. תצפית
<ol><li>חותכים יריעת גומי מסיליקון עם סכין גילוח כדי להכין מסגרת למרווח (איור 2A). הערה: התאם את עובי גיליון גומי הסיליקון בהתאם לעובי המדגם. כמו דגימות שטופלו עם פתרון ניקוי הם רכים, הם ייפגעו אם הם מכוסים ישירות עם זכוכית הכיסוי.</li>
	<li>הניחו את מסגרת הסיליקון על זכוכית כיסוי (לדוגמה, 25 x 60 מ"מ) (איור 2B). מקם את הדגימות שטופלו בתוך המסגרת ולהוסיף ~ 100 μL של פתרון ניקוי כדי להסיר את כל הבועות במסגרת. מכסים בכוס כיסוי נוספת (18 x 18 מ"מ או 24 x 24 מ"מ) כדי למנוע אידוי של פתרון הסליקה (איור 2C).</li>
	<li>שימו לב לדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר התצפית, החזירו את הדגימות לפתרון הסליקה שנלקח במיקרו-צינור ואחסנו בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig02.jpg"> איור 2: הכנה מדגמית לתצפית מיקרוסקופית. (A) חותכים יריעת סיליקון בעובי 0.2 מ"מ למסגרת. (B) שים את מסגרת גיליון הסיליקון על זכוכית הכיסוי. (ג) מקם את הדגימה המטופלת בתמיסת ניקוי (המסומנת בגבול מנוקד) בתוך המסגרת וכסה אותה בכוס כיסוי. סרגלי קנה מידה: 5 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol>
	<li>Vogelmann, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+within+the+plant.">Light within the plant.</a> Photomorphogenesis in Plants. , 491-535 (1994).</li><li>Krause, G. H., Weis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence+and+photosynthesis:+The+basics.">Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42 (1), 313-349 (1991).</li><li>Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+oxidation+in+plants:+from+biochemical+properties+to+physiological+functions.">Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions.</a> Trends in Plant Science. 12 (1), 29-36 (2007).</li><li>Lersten, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+annotated+bibliography+of+botanical+clearing+methods.">An annotated bibliography of botanical clearing methods.</a> Iowa State Journal of Science. 41 (4), 481-486 (1967).</li><li>Villani, T. S., Koroch, A. R., Simon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+clearing+and+mounting+solution+to+replace+chloral+hydrate+in+microscopic+applications.">An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications.</a> Applications in Plant Sciences. 1 (5), 1300016 (2013).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS ONE. 7 (3), 33916 (2012).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+a+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSeeAlpha:+advanced+optical+clearing+for+whole-plant+imaging.">ClearSeeAlpha: advanced optical clearing for whole-plant imaging.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).</li><li>Ursache, R., Andersen, T. G., Marhav&#253;, P., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+combining+fluorescent+proteins+with+histological+stains+for+diverse+cell+wall+components.">A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components.</a> The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).</li><li>Tofanelli, R., Vijayan, A., Scholz, S., Schneitz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+rapid+clearing+and+staining+of+fixed+Arabidopsis+ovules+for+improved+imaging+by+confocal+laser+scanning+microscopy.">Protocol for rapid clearing and staining of fixed Arabidopsis ovules for improved imaging by confocal laser scanning microscopy.</a> Plant Methods. 15 (1), 120 (2019).</li><li>Vijayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+3D+reference+atlas+reveals+cellular+growth+patterns+shaping+the+Arabidopsis+ovule.">A digital 3D reference atlas reveals cellular growth patterns shaping the Arabidopsis ovule.</a> eLife. 10, 1-38 (2021).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., George Barisas, B., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 1-20 (2013).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252, 1231-1240 (2015).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).</li><li>Warner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+clearing+technique+for+plant+tissues+allowing+deep+imaging+and+compatible+with+fluorescence+microscopy.">An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy.</a> Plant Physiology. 166 (4), 1684-1687 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+plant+organs+using+a+simple+and+rapid+transparency+technique.">Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique.</a> Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).</li><li>Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+optical+clearing+protocol+for+deep+tissue+imaging+of+fluorescent+proteins+in+Arabidopsis+thaliana.">A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana.</a> PLOS ONE. 11 (8), 0161107 (2016).</li><li>Sakamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+clearing+method+contributes+to+deep+imaging+of+plant+organs.">Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs.</a> Research Square. , (2021).</li><li>Tanaka, E., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-leaf+fluorescence+imaging+to+visualize+in+planta+fungal+structures+of+Victory+onion+leaf+rust+fungus,+Uromyces+japonicus,+and+its+taxonomic+evaluation.">Whole-leaf fluorescence imaging to visualize in planta fungal structures of Victory onion leaf rust fungus, Uromyces japonicus, and its taxonomic evaluation.</a> Mycoscience. 59 (2), 137-146 (2018).</li><li>Ohtsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+deep+imaging+of+syncytium+induced+by+the+soybean+cyst+nematode+Heterodera+glycines.">Spatiotemporal deep imaging of syncytium induced by the soybean cyst nematode Heterodera glycines.</a> Protoplasma. 254, 2107-2115 (2017).</li><li>Duman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+de-etiolation+increases+the+rooting+of+VC801+Avocado+rootstock.">Short de-etiolation increases the rooting of VC801 Avocado rootstock.</a> Plants. 9 (11), 1481 (2020).</li><li>Ho, W. W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+multi-omics+analyses+of+barley+rootzones+under+salinity+stress+reveal+two+distinctive+salt+tolerance+mechanisms.">Integrative multi-omics analyses of barley rootzones under salinity stress reveal two distinctive salt tolerance mechanisms.</a> Plant Communications. 1 (3), 100031 (2020).</li><li>Arsovski, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrphyB+is+critical+for+rapid+recovery+to+darkness+in+mature+Brassica+rapa+leaves.">BrphyB is critical for rapid recovery to darkness in mature Brassica rapa leaves.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Doll, Y., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+stomatal+development+regulation+in+Callitriche+is+related+to+the+intrageneric+diversity+in+lifestyles.">The diversity of stomatal development regulation in Callitriche is related to the intrageneric diversity in lifestyles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (14), (2021).</li><li>Eliyahu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetative+propagation+of+elite+Eucalyptus+clones+as+food+source+for+honeybees+(Apis+mellifera);+adventitious+roots+versus+callus+formation.">Vegetative propagation of elite Eucalyptus clones as food source for honeybees (Apis mellifera); adventitious roots versus callus formation.</a> Israel Journal of Plant Sciences. 67 (1-2), 83-97 (2020).</li><li>Kelliher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATRILINEAL,+a+sperm-specific+phospholipase,+triggers+maize+haploid+induction.">MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction.</a> Nature. 542, 105-109 (2017).</li><li>Aki, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+signaling+is+essential+for+organ+formation+in+Marchantia+polymorpha.">Cytokinin signaling is essential for organ formation in Marchantia polymorpha.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (8), 1842-1854 (2019).</li><li>Kinoshita, A., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+ANGUSTIFOLIA3+and+SHOOT+MERISTEMLESS,+key+genes+for+meristematic+activity+in+a+one-leaf+plant+Monophyllaea+glabra,+revealed+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Expression profiles of ANGUSTIFOLIA3 and SHOOT MERISTEMLESS, key genes for meristematic activity in a one-leaf plant Monophyllaea glabra, revealed by whole-mount in situ hybridization.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 1-11 (2020).</li><li>Okazawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+planteose+hydrolysis+during+seed+germination+of+Orobanche+minor.">Localization of planteose hydrolysis during seed germination of Orobanche minor.</a> bioRxiv. , 448768 (2021).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAPYRIN+attenuates+defence+by+repressing+PR+gene+induction+and+localized+lignin+accumulation+during+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+of+Petunia+hybrida.">VAPYRIN attenuates defence by repressing PR gene induction and localized lignin accumulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis of Petunia hybrida.</a> New Phytologist. 229 (6), 3481-3496 (2021).</li><li>Chu, T. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+markers+highlight+intracellular+dynamics+of+membrane+proteins+in+response+to+abiotic+treatments+in+rice.">Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice.</a> Rice. 11, 23 (2018).</li><li>Alaguero-Cordovilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin-mediated+regulatory+framework+for+wound-induced+adventitious+root+formation+in+tomato+shoot+explants.">An auxin-mediated regulatory framework for wound-induced adventitious root formation in tomato shoot explants.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 44 (5), 1642-1662 (2021).</li><li>Okuda, A., Matsusaki, M., Masuda, T., Urade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+GmPDIL7,+a+soybean+ER+membrane-bound+protein+disulfide+isomerase+family+protein.">Identification and characterization of GmPDIL7, a soybean ER membrane-bound protein disulfide isomerase family protein.</a> The FEBS Journal. 284 (3), 414-428 (2017).</li><li>Kim, D. -. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutualistic+interaction+between+Streptomyces+bacteria,+strawberry+plants+and+pollinating+bees.">A mutualistic interaction between Streptomyces bacteria, strawberry plants and pollinating bees.</a> Nature Communications. 10 (1), 4802 (2019).</li><li>Wu, J., Mock, H. -. P., Giehl, R. F. H., Pitann, B., M&#252;hling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+decreases+cadmium+concentrations+by+modulating+root+endodermal+suberin+development+in+wheat+plants.">Silicon decreases cadmium concentrations by modulating root endodermal suberin development in wheat plants.</a> Journal of Hazardous Materials. 364, 581-590 (2019).</li><li>Isoda, M., Oyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+duckweed+species,+Wolffiella+hyalina,+for+whole-plant+observation+of+physiological+behavior+at+the+single-cell+level.">Use of a duckweed species, Wolffiella hyalina, for whole-plant observation of physiological behavior at the single-cell level.</a> Plant Biotechnology. 35 (4), 387-391 (2018).</li><li>Ben-Targem, M., Ripper, D., Bayer, M., Ragni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+and+gibberellin+signaling+cross-talk+promotes+hypocotyl+xylem+expansion+and+cambium+homeostasis.">Auxin and gibberellin signaling cross-talk promotes hypocotyl xylem expansion and cambium homeostasis.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (10), 3647-3660 (2021).</li><li>Shwartz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VIL+gene+CRAWLING+ELEPHANT+controls+maturation+and+differentiation+in+tomato+via+polycomb+silencing.">The VIL gene CRAWLING ELEPHANT controls maturation and differentiation in tomato via polycomb silencing.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Levin, K. A., Tucker, M. R., Strock, C. F., Lynch, J. P., Mather, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+reveals+that+positions+of+cyst+nematode+feeding+sites+relative+to+xylem+vessels+differ+between+susceptible+and+resistant+wheat.">Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat.</a> Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).</li><li>Nouri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+suppression+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+involves+gibberellic+acid+signaling.">Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).</li><li>Evangelisti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+enables+the+identification+and+quantification+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi+in+plant+roots.">Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots.</a> bioRxiv. , 434067 (2021).</li></ol>

ClearSee ממוסחר (Fujifilm Wako טהור כימי תאגיד, יפן). אוניברסיטת נגויה מחזיקה בפטנט (JP6601842) על ריאגנט הסליקה ClearSee. ד. קוריהארה הוא ממציא הפטנטים. המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שיטה זו מורכבת מקיבעון, כביסה וניקוי. קיבעון הוא צעד קריטי בפרוטוקול זה. אם חלבון פלואורסצנטי לא נצפה לאחר קיבוע PFA, זה לא יהיה נצפה לאחר הטיפול עם פתרון ניקוי. החדירה של פתרון PFA לתוך רקמות היא קריטית, אבל טיפול ואקום גבוה אינו מומלץ כי זה יכול להרוס את מבנה התא. תנאי ואקום ותקופות קיבעון צריך להיות ממוטב עבור כל סוג של רקמות ומינים. מומלץ לבדוק חלבונים פלואורסצנטיים גם לאחר קיבוע. למרות דגימות היו קבועים בדרך כלל במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר, הם יכולים להיות קבועים ב 4 °C (4 ° C ( 4 ° C ( (לילה או יותר).
כפי שניתן לראות באיור 6A, לחלק מהנתרן דאוקסיכולטים היה צבע צהוב-חיוור בעת ההמסה. פתרונות כאלה של נתרן דאוקסיכולט הראו זרימה אוטומטית חזקה באזור 400-600 ננומטר לאחר עירור ב-380 ננומטר (איור 6B). זרם אוטומטי זה מונע ניקוי אופטי והדמיה פלואורסצנטית. משתמשים צריכים לבדוק את הצבע של פתרון נתרן deoxycholate כמו איכות הריאגנט עשוי להיות שונה בשל טוהר, וריאציה הרבה למגרש, או סיבות אחרות.
פתרונות הסליקה המשמשים כאן יש ריכוזים גבוהים של נתרן deoxycholate, אשר יכול להרוס את מבנה הממברנה. סמן קרום הפלזמה (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) נצפתה גם לאחר טיפול CS7. עם זאת, ייתכן שעדיף להפחית את הריכוז של נתרן deoxycholate, בהתאם למבנה ורקמת העניין. ואכן, תמונות עם בהירות משופרת הושגו עבור pistils Arabidopsis עם CS שונה, שבו הריכוז של נתרן deoxycholate מופחת בחצי; עם זאת, ריכוזים מופחתים של נתרן deoxycholate נדרש זמני טיפול ממושכים (למשל, 1 חודש עבור pistils Arabidopsis ).
CS יכול להפחית את autofluorescence אדום (>610 ננומטר) כדי להסיר כלורופיל בדגימות שטופלו. עם זאת, 500-600 ננומטר טווח autofluorescence (צהוב לכתום) נשאר אפילו בדגימות שטופלו CS7. זה autofluorescence הוא חשב נגזר דופן התא ורכיבים תאיים אחרים, כגון lignin12,13. לכן, קשה לעשות רקמות, כגון גבעולים עם קירות משניים מפותחים, שקוף לחלוטין על ידי טיפול במדעי המחשב.
מספר ריאגנטים ניקוי מלבד אלה המשמשים כאן פותחו כדי לצפות חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית14,15,16,17. בהשוואה לשיטות אלה, CS ו- CSA להסיר כלורופיל ולהפחית autofluorescence, מה שהופך את רקמות הצמח שקופות יותר. לאחרונה, Sakamoto ואח ' פיתח שיטה משופרת, iTOMEI, לקיבעון, ניקוי דטרגנטים, הרכבה כדי להתאים את אי התאמה אינדקס שבירה18. בשתילים Arabidopsis, iTOMEI ניקה את הרקמה בתוך 26 שעות.
CS חל על מגוון רחב של מיני צמחים, כגון Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, אבוקדו21, שעורה22, Brassica rapa23, Callitriche 24, אקליפטוס25, תירס26, מרצ'נטיה פולימורפ27, מונופילאאה גלאברה28, אורובנצ'ה מינור29, פטוניה30, אורז31, סולנום ליקופרסיקום32, פולי סויה33, תות שדה34, חיטה35, וולפיאלה היאלינה36. עבור רקמות עבות יותר, CS יכול גם להפוך את מקטעי הרטט לשקופים 37,38. שיטה זו אפשרה מחקרים של המבנה התאי ודפוסי ביטוי הגנים בצמחים37,38. יתר על כן, זיהומים נמטודות20,39, זיהומים פטרייתיים, וסימביוזה19,40,41 נצפו גם עמוק בתוך הרקמות שטופלו ב- CS. לפיכך, שיטה זו שימושית להדמיית רקמות שלמות ממיקרו-קשקשים ועד קשקשי מאקרו ויכולה לעזור לגלות אינטראקציות חדשניות בין תאים, רקמות, איברים ואורגניזמים שונים.

הדמיה של מבנים תאיים ולוקליזציה של חלבונים באורגניזמים חיים חשובה להבהרת תפקידיהם ב- vivo. עם זאת, מכיוון שהגוף החי אינו שקוף, מאתגר להתבונן במבנה הפנימי של אורגניזמים חיים ללא ניתוח. במיוחד, במקרה של רקמות צמחיות, אשר מרובות שכבות עם תאים בצורות שונות, אי התאמה אינדקס הנגרמת על ידי המבנה שלהם ואת נוכחות של פיגמנטים סופגים אור הוא בעייתי. לדוגמה, לעלים צמחיים יש מבנה מורכב המאפשר להם לנצל ביעילות את האור שנכנס לגופם לפוטוסינתזה1, ואילו המבנה גורם גם לחוסר התאמה של מדד שבירה, מה שהופך אותם לקשים לצפייה. עם זאת, עלים יש פיגמנטים סופגים אור רבים, כגון כלורופיל, אשר פולטים פלואורסצנטיות אדומה חזקה פיגמנטים חומים מיוצרים על ידי חמצון2,3. פיגמנטים אלה גם מעכבים תצפיות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות בהר שלם בצמחים. לכן, עבור התבוננות במבנה הפנימי של צמחים, decolorization וקיבעון על ידי אלכוהול וניקוי באמצעות הידרציה כלורל שימשו במשך זמן רב כדי לחסל את אי התאמה אינדקס שבירה autofluorescence4,5. שיטות קונבנציונליות אלה אומצו במשך שנים רבות, אך יש להן את החיסרון של ביטול הפלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים בו זמנית 6,7. זה בעייתי מאז חלבונים פלואורסצנטיים הפכו חיוניים בהדמיה פלואורסצנטית הנוכחית.
לכן, ClearSee (CS) ו ClearSeeAlpha (CSA) פותחו כריאגנטים ניקוי אופטי עבור רקמות צמחיות. שני ריאגנטים להפחית כלורופיל autofluorescence תוך שמירה על היציבות של חלבונים פלואורסצנטיים7,8. CSA שימושי במיוחד כאשר פיגמנטים חומים מיוצרים בשל חמצון רקמות. באמצעות ריאגנטים ניקוי אלה, ניתן לבחון את המבנה התאי ואת לוקליזציה חלבון בתוך הגוף הצמחי ללא חתך פיזי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcofluor White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearSee</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18&#215;18 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24&#215;24 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C024241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (25&#215;60 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>AS One</td>
			<td>1-5801-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>346-07951</td>
			<td>1 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS One</td>
			<td>6-9085-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>C0316</td>
			<td>Figure 6_1; Lot PSGYK-QB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Kishida Chemical</td>
			<td>260-71412</td>
			<td>Figure 6_2; Lot C05543H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Figure 6_3; Lot SLBS7362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td>Figure 6_4; Lot BCBW0612</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>10712-96</td>
			<td>Figure 6_5; Lot M5R3403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>194-08311</td>
			<td>Figure 6_6; Lot LKL0648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-03411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>211-01213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>BUCHI</td>
			<td>V-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylitol</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>248-00545</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging

זה מאתגר להתבונן ישירות במבנה הפנימי של דגימות צמחים רב שכבתיות ואטומות, ללא ניתוח, תחת מיקרוסקופ. בנוסף, autofluorescence המיוחס כלורופיל מעכב את התצפית של חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים. במשך זמן רב, ריאגנטים ניקוי שונים שימשו כדי להפוך את הצמחים שקופים. עם זאת, ריאגנטים ניקוי קונבנציונאלי להפחית אותות פלואורסצנטיים; לכן, לא ניתן היה לצפות במבנים התאיים והתאיים עם חלבונים פלואורסצנטיים. ריאגנטים פותחו שיכולים לנקות רקמות צמחיות על ידי הסרת כלורופיל תוך שמירה על יציבות חלבון פלואורסצנטי. פרוטוקול מפורט מסופק כאן עבור ניקוי אופטי של רקמות צמח באמצעות ריאגנטים ניקוי, ClearSee (CS) או ClearSeeAlpha (CSA). הכנת רקמות צמחיות מנוקות כרוכה בשלושה שלבים: קיבעון, כביסה ופינוי. קיבעון הוא צעד מכריע בשמירה על המבנים התאיים והיציבות התאית של חלבונים פלואורסצנטיים. זמן הדגירה לניקוי תלוי בסוג הרקמה ובמינים. ב - Arabidopsis thaliana, הזמן הנדרש לפינוי עם CS היה 4 ימים עבור עלים ושורשים, 7 ימים עבור שתילים, ו 1 חודש עבור pistils. CS גם נדרש זמן קצר יחסית של 4 ימים כדי להפוך את העלים gametophytic של Physcomitrium patens שקוף. לעומת זאת, pistils בטבק וטורניה מיוצר פיגמנט חום עקב חמצון במהלך טיפול במדעי המחשב. CSA הפחית את הפיגמנט החום על ידי מניעת חמצון ויכול להפוך את הטבק וטורניה pistils שקוף, אם כי זה לקח זמן רב יחסית (1 או 2 חודשים). CS ו- CSA היו תואמים גם עם כתמים באמצעות צבעים כימיים, כגון DAPI (4 ',6-diamidino-2-פנילינדולה) ו Hoechst 33342 עבור DNA ו Calcofluor לבן, SR2200, ואדום ישיר 23 עבור דופן התא. שיטה זו יכולה להיות שימושית עבור הדמיה של צמח שלם כדי לחשוף מורפולוגיה שלמה, תהליכים התפתחותיים, אינטראקציות צמח-חיידקים, וזיהומים נמטודים.

מדעי המחשב יכולים לנקות עלים של מינים שונים (איור 3A-H). קשה לפתרון הפקולטה למדעי המחשב לחדור עלה אורז מכיוון שמשטח העלה מכוסה בשעווה חותכת בצמח זה. עם זאת, לאחר חילוץ שעוות הציפורניים על ידי טבילה בכלורופורם במשך 10 שניות, CS יכול לנקות את עלי האורז (איור 3H). עם זאת, למדעי המחשב לא יכלו לחדור את עלי האאוטוזה של Chamaecyparis שהם פחות חדירים למדעי המחשב (איור 3I, J). בעלי החרצית נצפתה פיגמנטציה חומה הנגרמת על ידי חמצון פוליפנול בעלים שטופלו במדעי המחשב (איור 3K, L). באופן דומה, טבק וטורניה pistils הראו פיגמנטציה חומה במהלך הטיפול במדעי המחשב (איור 3M, O). מכיוון שרכיב הנתרן גופרתי ב-CSA מונע חמצון פוליפנול בשל ההשפעה המפחיתה, CSA יכול לנקות את הטבק ואת פיסטילים של טורניה ללא כל פיגמנטציה חומה (איור 3N, P).
איורים 4B מראים כי הטיפול במדעי המחשב הפחית את הצבע הירוק החיוור של עלה הארבידופסיס H2B-mClover (שדה בהיר) ושיפר את עוצמת הפלואורסצנטיות של H2B-mClover בהשוואה לדגירה PBS (איור 4A). בנוסף לצמחים פורחים, CS חל גם על צמחי טחב (איור 4C); לאחר 4 ימים של טיפול בפקולטה למדעי המחשב, הפלואורסצנטיות של H2B-mRFP זוהתה בבירור עבור כל המשחק כולו עם כלורופיל אוטופלואורסצנטיות מופחתת. איורים 4D,E מציגים תמונות שחזור תלת-ממדיות של ה-H2B-mClover pistil בניקוטיאנה בנת'מיאנה שנוקתה באמצעות CSA. עומק המדגם היה 440 מיקרומטר. כפי שמראה תמונת ההקרנה בעוצמה מרבית המקודדת לעומק, CSA מאפשר הדמיה עמוקה של רקמות מאתגרות, כגון pistils טבק.
CS ו- CSA היו תואמים גם עם כתמי צבע פלואורסצנטיים. איור 5 מראה שניתן להשתמש ב-CS בו-זמנית כדי לצפות בחלבון הפלואורסצנטי (H2B-mClover) ובכתמי צבע פלואורסצנטיים אורגניים (Calcofluor White). לאחר שחזור תלת-ממדי מתמונות מחסנית z, ניתן היה לצפות בכל מקטע.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig03.jpg"> איור 3: סליקה אופטית של עלים ופיסטילים באמצעות פתרונות סליקה. (A-L) עלים קבועים של מינים שונים דוגרו ב- PBS (A,C, E, G, I, K) או CS (B,D, F, H, J, L) במשך 8 ימים ו- CS (M,O) או CSA (N,P) במשך יומיים. (A,B, O, P) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) מוריפולום חרצית, (M,N) Nicotiana benthamiana. סרגלי קנה מידה: 1 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig04.jpg"> איור 4: הדמיית פלואורסצנטיות של רקמות שטופלו בפתרונות סליקה. (A,B) UBQ10pro::H2B-mClover עלים של טליאנה Arabidopsis טופלו עם PBS (A) או CS (B) במשך 3 ימים. (C) H2B-mRFP עלים של פטנס פיזיקומיטריום טופלו עם CS במשך 4 ימים. הגרעינים סומנו עם H2B-mRFP (ירוק). הטיפול במדעי המחשב הפחית את כמות הכלורופיל האוטופלואורסצנטית (מגנטה). האות H2B-mRFP באזור apical נצפתה בבירור הן עבור תמונות ממוזגות של H2B-mRFP והן autofluorescence או שדה בהיר. (ד, ה) סטיגמת UBQ10pro::H2B-mClover סטיגמת ניקוטיאנה בנת'מיאנה טופלה ב- CSA במשך חודש אחד. הקרנה בעצימות מרבית (D) והקרנה בעוצמה מרבית (E) מקודדת עומק נוצרו מתמונות 88 z-stack במרווחי זמן של 5 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה: 100 מיקרומטר. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה (A,B), קונפוקל (C) ושני פוטונים (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig05.jpg"> איור 5: כתמי צבע פלואורסצנטיים תואמים ל-CS. (A) עלים שטופלו ב-CS שנצפו על ידי מיקרוסקופיה של עירור שני פוטונים עם עירור של 950 ננומטר. דופן התא מוכתמת בלבן קלקופלואור (ציאן). גרעינים מסומנים עם UBQ10pro::H2B-mClover (צהוב). התמונות yz (B) ו- xz (C) הן חתכים במיקום שצוין על-ידי הקווים המסווגים הלבנים ב- (A). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig06.jpg"> איור 6: שקיפות של נתרן דוקסיכולאט. (A) צבעים של 15% דיוקסיכולטים נתרן שונים ( המפורטים בטבלת החומרים). (B) ספקטרום פלואורסצנטיות של כל 15% נתרן deoxycholate עם עירור 380 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

כאן, מתוארת שיטה להפיכת רקמות הצמח לשקופות תוך שמירה על יציבות חלבונים פלואורסצנטיים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה עמוקה של רקמות צמחים מנוקות ללא חתך פיזי.

ניקוי אופטי של רקמות צמחים להדמיית פלואורסצנטיות

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

שיטה זו יכולה להיות מועילה בהדמיה של צמח שלם כדי לחשוף מורפולוגיה שלמה, תהליכים התפתחותיים ואינטראקציות של חיידקים צמחיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים להתבונן ישירות בחלק הפנימי של גוף הצמח מבלי לגרום נזק על זה. כמו שיטה זו חלה על מגוון רחב של מינים ורקמות צמחים, זה יכול לעזור להאיץ את הגילוי של תופעות חדשות במחקר הביולוגי של הצמח.קיבעון הוא צעד קריטי בהליך זה. לפני שלב הסליקה, צריך לבדוק את עוצמת החלבון הפלואורסצנטי לאחר הקיבעון. כדי להתחיל לטבול דגימות צמחים בתמיסה המקבעת בצינור מיקרו, ולוודא כי נפח הפתרון הקיבוצי הוא יותר מפי חמישה מנפח המדגם.לאטום את צינור מיקרו עם parafilm ולעשות חורים באמצעות מחט. מניחים את צינור המיקרו במייבש ולהתאים לאט את מידת הוואקום לסביבות 690 מילימטרים של כספית, כך בועות מופיעות בהדרגה מן הדגימות. כבה את משאבת הוואקום לאחר פינוי המייבש.לפרוק את ההתייבשות בזהירות מבלי להפריע לדגימות. הפעל שוב את משאבת הוואקום וכבה אותה לאחר פינוי המייבש. פתח את התייבשות בזהירות מבלי להקפיץ את הפתרון הקיבוצי במיקרו-tube.הסר את הפתרון הקיבוצי והוסף PBS 1x עם פיפטה מיקרו. לאחר אחסון למשך דקה אחת, החלף את ה- PBS הישן ב- PBS 1x חדש. לאחר הסרת PBS פי חמישה מנפח המדגם של פתרון הסליקה, לאטום את צינור המיקרו עם parafilm ולעשות חורים עם מחט.מקם את הדגימות במייבש. לפנות ולכבות את משאבת ואקום. פתח את המייבש בעדינות, ולאחר מכן סגור את microtube.הפוך את צינור המיקרו, כל יום עד יומיים כדי להאיץ את תהליך הסליקה. עבור מסגרת מרווח, לחתוך יריעת גומי סיליקון עם סכין גילוח התאמת עובי גיליון גומי סיליקון בהתאם לעובי המדגם. מניחים את מסגרת הסיליקון על כיסוי, ואז מניחים את הדגימות שטופלו בתוך המסגרת ומוסיפים כ -100 מיקרוליטרים של פתרון ניקוי כדי להסיר בועות.לכסות עם זכוכית כיסוי נוספת כדי למנוע אידוי של פתרון הסליקה. שימו לב לדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר התצפית להחזיר את הדגימות לפתרון ניקוי במיקרו-צינור.עלים קבועים של מינים שונים היו דגירה PBS או ClearSee במשך שמונה ימים, ב ClearSee או ClearSeeAlpha במשך יומיים. ClearSee יכול לנקות עלים של מינים שונים. לאחר חילוץ הציפורן, ClearSee יכול לנקות עלי אורז.כמו רכיב נתרן סולפיט ב ClearSeeAlpha מונע חמצון פוליפנול בשל ההשפעה המפחיתה, ClearSeeAlpha יכול לנקות טבק ו tirania pistils ללא כל פיגמנטציה חומה. Ubiquitin-10 מקדם H2B-mClover עלים של arabidopsis טאליאנה טופלו עם PBS או ClearSee במשך שלושה ימים. טיפול ClearSee הפחית את הצבע הירוק החיוור של עלה Arabidopsis H2B-mClover ולשפר את עוצמת הפלואורסצנטיות של H2B-mClover בהשוואה לדגירה PBS.עלים שטופלו ב- ClearSee נצפו על ידי מיקרוסקופיה של עירור שני פוטונים עם עירור של 950 ננומטר. דופן התא מוכתמת בקלקלפלור-לבן. גרעינים מסומנים עם ubiquitin-10 מקדם, H2B-mClover.התמונות Y Z ו- X Z הן חתכים במיקום המצוין על-ידי הקווים המסווגים הלבנים. הכנת הפתרון הקבוע חשובה כדי לתקן את הדגימות. עם זאת, יש לנקוט בזהירות כדי למנוע נזק לדגימות תחת ואקום.הדמיה מיקרוסקופית יכולה להתבצע כדי לחקור דפוסי ביטוי גנים מרובים ותקשורת תאית במהלך התפתחות הצמח וזיהום בעקבות הליך זה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Plant Cell Structure and Organization

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

טיפול ניקוי נאות של המיקרוסקופ

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

הרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ אור

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

נורמליזציה נולד עבור טומוגרפיה Fluorescence הקרנה אופטית עבור הדמיה בלב שלם

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...