Name: optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging
Uploaded: 2022-01-05T15:00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for the Promotion of Science (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 til T.H.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B, JP17H03697 til D.K.), Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (JP18K19331 til D.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP20H05358 for D.K.)) og Japan Science and Technology Agency (PRESTO-programmet (JPMJPR15QC til Y.M., JPMJPR18K4 til D.K.)). Forfatterne er takknemlige til Live Imaging Center ved Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM) ved Nagoya University for å støtte de mikroskopiske studiene og Redigering (www.editage.com) for engelskspråklig redigering.

1. Utarbeidelse av ryddeløsninger
<ol><li>For å forberede CS-oppløsning, oppløs 10% (w / v) xylitol, 15% (w / v) natriumdeoksycholat og 25% (w / v) urea i destillert vann på en magnetisk omrører. MERK: Natriumdeoksykollatpulver skal veies i et trekkkammer, da det lett flyter i luften. CS kan lagres ved romtemperatur i mørket i mer enn 1 år.</li>
	<li>For å forberede CSA-oppløsning, tilsett natriumsulfitt (50 mM endelig konsentrasjon) til CS-løsningen oppnådd ovenfor. MERK: Tilsett natriumsulfitt i CS-oppløsningen rett før bruk, da reduksjonsmiddelet enkelt deaktiveres.</li>
</ol>2. Forberedelse av den fikseringsløsningen
<ol><li>Overfør 40 ml sterilisert vann til et konisk rør og tilsett 2 g paraformaldehyd. Tilsett 200 μL 2 N NaOH for å øke pH-en til løsningen. Etter lukking og tetting av røret med parafilm, inkuber ved 60 °C med sporadiske inversjoner til alt er oppløst.</li>
	<li>Etter avkjøling av løsningen på romtemperatur, tilsett 5 ml 10x fosfatbufret saltvann (PBS) for å justere pH til 7,4. Tilsett sterilisert vann for å utgjøre volumet til 50 ml. MERK: En nylaget fikseringsløsning foretrekkes. Løsningen kan også lagres ved -30 °C i flere måneder.</li>
</ol>3. Fiksering av prøver
<ol><li>Senk planteprøvene ned i den fikseringsløsningen i et mikrorør (figur 1A), og sørg for at volumet av den fikseringsløsningen er mer enn fem ganger prøvevolumet.</li>
	<li>Forsegle mikrorøret med en parafilm og lag hull ved hjelp av en nål. Ikke la røret stå åpent på grunn av fare for prøvesøl under vakuumdekompresjon.</li>
	<li>Plasser mikrorøret i en tørkemiddel og juster vakuumgraden (~690 mmHg) langsomt slik at bobler vises gradvis fra prøvene (figur 1B-C). Slå av vakuumpumpen etter evakuering av tørkeapparatet. La mikrorøret stå uforstyrret i 30 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Luft tørkeapparatet forsiktig for å unngå å forstyrre prøvene. Slå på vakuumpumpen igjen og slå den av etter at du har evakuert tørkeapparatet. La mikrorøret stå uforstyrret i 30 minutter ved romtemperatur. MERK: Det må utvises forsiktighet for å forhindre skade på prøvene under ventilasjon av tørkeapparatet. Penetrasjonen av den fikseringsløsningen i prøvene forsterkes av to vakuumbehandlinger. Ytterligere vakuumbehandling bidrar til å trenge inn i den fikseringsløsningen i tykkere prøver.</li>
	<li>Åpne tørkemiddelet forsiktig uten å støte på den fikseringsløsningen i mikrorøret. Bruk en mikropipette, fjern fikseringsløsningen og tilsett 1x PBS. Etter oppbevaring i 1 min, bytt ut den gamle PBS med ny 1x PBS (figur 1D).</li>
</ol>4. Rydding
<ol><li>Etter at du har fjernet PBS, legger du til fem ganger prøvevolumet til tømmeløsningen.</li>
	<li>Forsegle mikrorøret med parafilm og lag hull med en nål. Plasser prøvene i tørkeapparatet, evakuer som i trinn 3.3, og slå av vakuumpumpen. La mikrorøret stå uforstyrret i 60 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Åpne tørkeapparatet forsiktig. Lukk mikrorøret med parafilm og oppbevar det ved romtemperatur i mørket for å unngå fotobleaching av fluorescerende proteiner. Snu mikrorøret hver 1-2 dager for å akselerere clearingprosessen.</li>
	<li>Når avregningsløsningen blir grønn, bytt den ut med nye avregningsløsninger til løsningen forblir fargeløs (figur 1E-H).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig01.jpg"> Figur 1: Prosedyre for CS-behandling. (A) Arabidopsis frøplante i 4% PFA (Paraformaldehyd) løsning. (B) Prøven plasseres i en desiccator. (C) Frøplanten er festet under et vakuum. (D) Frøplanten er gjennomvåt i PFA-løsningen etter vakuumbehandling. (E) Resulterende 3-dagers rydding løsningsbehandlet frøplante. Legg merke til den grønne fargen på clearingløsningen. (F) Avregningsløsningen skiftes ut 3 dager etter behandling. (G) Resulterende 5-dagers rydding løsningsbehandlet frøplante. (H) Avregningsløsningen skiftes ut 5 dager etter behandling. Skalastenger: 1 cm (A, C-H) og 5 cm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
5. Kjemisk fargestofffarging
<ol><li>Til mikrorøret legger du til Hoechst 33342 (endelig konsentrasjon på 10 μg/ml) for kjernefysisk farging eller calcofluor White (endelig konsentrasjon på 1 mg/ml) for celleveggfarging og vent i 1 time. Etter å ha fjernet fargestoffoppløsningen, vask prøven med en frisk avregningsløsning i 1 time. MERK: Farging og vask over natten kan forbedre fluorescerende fargestoffinntrengning i vev og redusere fluorescens i bakgrunnen. Ulike fluorescerende fargestoffer er kompatible med CS-løsningen som Basic Fuchsin9 (lignin), Auramine O9 (lignin, suberin og cutin), Nile Red9 (suberin), Direct Yellow 969, Direct Red 239 og SR220010,11 (cellevegger).</li>
</ol>6. Observasjon
<ol><li>Klipp silikongummiplaten med et barberblad for å klargjøre en ramme for avstandsstykket (figur 2A). MERK: Juster tykkelsen på silisiumgummiplaten i henhold til tykkelsen på prøven. Siden prøver behandlet med clearingløsning er myke, vil de bli skadet hvis de er dekket direkte med dekkglasset.</li>
	<li>Plasser silikonrammen på dekkglasset (f.eks. 25 x 60 mm) (figur 2B). Plasser de behandlede prøvene i rammen og tilsett ~100 μL klaringsløsning for å fjerne eventuelle bobler i rammen. Dekk med et annet dekselglass (18 x 18 mm eller 24 x 24 mm) for å forhindre fordampning av avregningsløsningen (figur 2C).</li>
	<li>Vær oppmerksom på prøvene under et fluorescerende mikroskop. Etter observasjon, returner prøvene til clearingløsningen tatt i et mikrorør og lagre ved romtemperatur i mørket.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig02.jpg"> Figur 2: Prøvepreparering for mikroskopisk observasjon. (A) Skjær et 0,2 mm tykt silikonark inn i en ramme. (B) Sett silikonplaterammen på dekkglasset. (C) Plasser prøven som behandles med avregningsoppløsning (merket med prikket kant) innenfor rammen og dekk den med et dekselglass. Skalastenger: 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<ol>
	<li>Vogelmann, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+within+the+plant.">Light within the plant.</a> Photomorphogenesis in Plants. , 491-535 (1994).</li><li>Krause, G. H., Weis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence+and+photosynthesis:+The+basics.">Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42 (1), 313-349 (1991).</li><li>Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+oxidation+in+plants:+from+biochemical+properties+to+physiological+functions.">Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions.</a> Trends in Plant Science. 12 (1), 29-36 (2007).</li><li>Lersten, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+annotated+bibliography+of+botanical+clearing+methods.">An annotated bibliography of botanical clearing methods.</a> Iowa State Journal of Science. 41 (4), 481-486 (1967).</li><li>Villani, T. S., Koroch, A. R., Simon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+clearing+and+mounting+solution+to+replace+chloral+hydrate+in+microscopic+applications.">An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications.</a> Applications in Plant Sciences. 1 (5), 1300016 (2013).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS ONE. 7 (3), 33916 (2012).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+a+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSeeAlpha:+advanced+optical+clearing+for+whole-plant+imaging.">ClearSeeAlpha: advanced optical clearing for whole-plant imaging.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).</li><li>Ursache, R., Andersen, T. G., Marhav&#253;, P., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+combining+fluorescent+proteins+with+histological+stains+for+diverse+cell+wall+components.">A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components.</a> The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).</li><li>Tofanelli, R., Vijayan, A., Scholz, S., Schneitz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+rapid+clearing+and+staining+of+fixed+Arabidopsis+ovules+for+improved+imaging+by+confocal+laser+scanning+microscopy.">Protocol for rapid clearing and staining of fixed Arabidopsis ovules for improved imaging by confocal laser scanning microscopy.</a> Plant Methods. 15 (1), 120 (2019).</li><li>Vijayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+3D+reference+atlas+reveals+cellular+growth+patterns+shaping+the+Arabidopsis+ovule.">A digital 3D reference atlas reveals cellular growth patterns shaping the Arabidopsis ovule.</a> eLife. 10, 1-38 (2021).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., George Barisas, B., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 1-20 (2013).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252, 1231-1240 (2015).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).</li><li>Warner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+clearing+technique+for+plant+tissues+allowing+deep+imaging+and+compatible+with+fluorescence+microscopy.">An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy.</a> Plant Physiology. 166 (4), 1684-1687 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+plant+organs+using+a+simple+and+rapid+transparency+technique.">Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique.</a> Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).</li><li>Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+optical+clearing+protocol+for+deep+tissue+imaging+of+fluorescent+proteins+in+Arabidopsis+thaliana.">A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana.</a> PLOS ONE. 11 (8), 0161107 (2016).</li><li>Sakamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+clearing+method+contributes+to+deep+imaging+of+plant+organs.">Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs.</a> Research Square. , (2021).</li><li>Tanaka, E., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-leaf+fluorescence+imaging+to+visualize+in+planta+fungal+structures+of+Victory+onion+leaf+rust+fungus,+Uromyces+japonicus,+and+its+taxonomic+evaluation.">Whole-leaf fluorescence imaging to visualize in planta fungal structures of Victory onion leaf rust fungus, Uromyces japonicus, and its taxonomic evaluation.</a> Mycoscience. 59 (2), 137-146 (2018).</li><li>Ohtsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+deep+imaging+of+syncytium+induced+by+the+soybean+cyst+nematode+Heterodera+glycines.">Spatiotemporal deep imaging of syncytium induced by the soybean cyst nematode Heterodera glycines.</a> Protoplasma. 254, 2107-2115 (2017).</li><li>Duman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+de-etiolation+increases+the+rooting+of+VC801+Avocado+rootstock.">Short de-etiolation increases the rooting of VC801 Avocado rootstock.</a> Plants. 9 (11), 1481 (2020).</li><li>Ho, W. W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+multi-omics+analyses+of+barley+rootzones+under+salinity+stress+reveal+two+distinctive+salt+tolerance+mechanisms.">Integrative multi-omics analyses of barley rootzones under salinity stress reveal two distinctive salt tolerance mechanisms.</a> Plant Communications. 1 (3), 100031 (2020).</li><li>Arsovski, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrphyB+is+critical+for+rapid+recovery+to+darkness+in+mature+Brassica+rapa+leaves.">BrphyB is critical for rapid recovery to darkness in mature Brassica rapa leaves.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Doll, Y., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+stomatal+development+regulation+in+Callitriche+is+related+to+the+intrageneric+diversity+in+lifestyles.">The diversity of stomatal development regulation in Callitriche is related to the intrageneric diversity in lifestyles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (14), (2021).</li><li>Eliyahu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetative+propagation+of+elite+Eucalyptus+clones+as+food+source+for+honeybees+(Apis+mellifera);+adventitious+roots+versus+callus+formation.">Vegetative propagation of elite Eucalyptus clones as food source for honeybees (Apis mellifera); adventitious roots versus callus formation.</a> Israel Journal of Plant Sciences. 67 (1-2), 83-97 (2020).</li><li>Kelliher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATRILINEAL,+a+sperm-specific+phospholipase,+triggers+maize+haploid+induction.">MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction.</a> Nature. 542, 105-109 (2017).</li><li>Aki, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+signaling+is+essential+for+organ+formation+in+Marchantia+polymorpha.">Cytokinin signaling is essential for organ formation in Marchantia polymorpha.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (8), 1842-1854 (2019).</li><li>Kinoshita, A., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+ANGUSTIFOLIA3+and+SHOOT+MERISTEMLESS,+key+genes+for+meristematic+activity+in+a+one-leaf+plant+Monophyllaea+glabra,+revealed+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Expression profiles of ANGUSTIFOLIA3 and SHOOT MERISTEMLESS, key genes for meristematic activity in a one-leaf plant Monophyllaea glabra, revealed by whole-mount in situ hybridization.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 1-11 (2020).</li><li>Okazawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+planteose+hydrolysis+during+seed+germination+of+Orobanche+minor.">Localization of planteose hydrolysis during seed germination of Orobanche minor.</a> bioRxiv. , 448768 (2021).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAPYRIN+attenuates+defence+by+repressing+PR+gene+induction+and+localized+lignin+accumulation+during+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+of+Petunia+hybrida.">VAPYRIN attenuates defence by repressing PR gene induction and localized lignin accumulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis of Petunia hybrida.</a> New Phytologist. 229 (6), 3481-3496 (2021).</li><li>Chu, T. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+markers+highlight+intracellular+dynamics+of+membrane+proteins+in+response+to+abiotic+treatments+in+rice.">Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice.</a> Rice. 11, 23 (2018).</li><li>Alaguero-Cordovilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin-mediated+regulatory+framework+for+wound-induced+adventitious+root+formation+in+tomato+shoot+explants.">An auxin-mediated regulatory framework for wound-induced adventitious root formation in tomato shoot explants.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 44 (5), 1642-1662 (2021).</li><li>Okuda, A., Matsusaki, M., Masuda, T., Urade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+GmPDIL7,+a+soybean+ER+membrane-bound+protein+disulfide+isomerase+family+protein.">Identification and characterization of GmPDIL7, a soybean ER membrane-bound protein disulfide isomerase family protein.</a> The FEBS Journal. 284 (3), 414-428 (2017).</li><li>Kim, D. -. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutualistic+interaction+between+Streptomyces+bacteria,+strawberry+plants+and+pollinating+bees.">A mutualistic interaction between Streptomyces bacteria, strawberry plants and pollinating bees.</a> Nature Communications. 10 (1), 4802 (2019).</li><li>Wu, J., Mock, H. -. P., Giehl, R. F. H., Pitann, B., M&#252;hling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+decreases+cadmium+concentrations+by+modulating+root+endodermal+suberin+development+in+wheat+plants.">Silicon decreases cadmium concentrations by modulating root endodermal suberin development in wheat plants.</a> Journal of Hazardous Materials. 364, 581-590 (2019).</li><li>Isoda, M., Oyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+duckweed+species,+Wolffiella+hyalina,+for+whole-plant+observation+of+physiological+behavior+at+the+single-cell+level.">Use of a duckweed species, Wolffiella hyalina, for whole-plant observation of physiological behavior at the single-cell level.</a> Plant Biotechnology. 35 (4), 387-391 (2018).</li><li>Ben-Targem, M., Ripper, D., Bayer, M., Ragni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+and+gibberellin+signaling+cross-talk+promotes+hypocotyl+xylem+expansion+and+cambium+homeostasis.">Auxin and gibberellin signaling cross-talk promotes hypocotyl xylem expansion and cambium homeostasis.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (10), 3647-3660 (2021).</li><li>Shwartz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VIL+gene+CRAWLING+ELEPHANT+controls+maturation+and+differentiation+in+tomato+via+polycomb+silencing.">The VIL gene CRAWLING ELEPHANT controls maturation and differentiation in tomato via polycomb silencing.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Levin, K. A., Tucker, M. R., Strock, C. F., Lynch, J. P., Mather, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+reveals+that+positions+of+cyst+nematode+feeding+sites+relative+to+xylem+vessels+differ+between+susceptible+and+resistant+wheat.">Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat.</a> Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).</li><li>Nouri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+suppression+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+involves+gibberellic+acid+signaling.">Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).</li><li>Evangelisti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+enables+the+identification+and+quantification+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi+in+plant+roots.">Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots.</a> bioRxiv. , 434067 (2021).</li></ol>

ClearSee kommersialiseres (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Japan). Nagoya University har patent (JP6601842) på clearingreagensen ClearSee. D. Kurihara er patentoppfinneren. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Denne metoden består av fiksering, vasking og rengjøring. Fiksering er et kritisk trinn i denne protokollen. Hvis det fluorescerende proteinet ikke observeres etter PFA-fiksering, vil det ikke bli observert etter behandling med clearingløsning. Penetrasjon av PFA-løsning i vev er kritisk, men høy vakuumbehandling anbefales ikke fordi den kan ødelegge cellestrukturen. Vakuumforhold og fikseringsperioder bør optimaliseres for hver type vev og arter. Det anbefales å sjekke fluorescerende proteiner selv etter fiksering. Selv om prøver vanligvis ble fikset i 30-60 min ved romtemperatur, kan de festes ved 4 °C i lengre tid (over natten eller mer).
Som vist i figur 6A, hadde noen natriumdeoksycholater en blekgul farge når de ble oppløst. Slike natriumdeoksykolatløsninger viste sterk autofluorescens i 400-600 nm-regionen etter eksitasjon ved 380 nm (figur 6B). Denne autofluorescensen forhindrer optisk rydding og fluorescensavbildning. Brukere bør sjekke fargen på natrium deoksycholate løsning som kvaliteten på reagenset kan variere på grunn av renhet, mye-til-mye variasjon, eller andre grunner.
Clearingløsningene som brukes her har høye konsentrasjoner av natriumdeoksykolat, noe som kan ødelegge membranstrukturen. Plasmamembranmarkøren (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) ble observert selv etter CS-behandling7. Det kan imidlertid være bedre å redusere konsentrasjonen av natriumdeoksykolat, avhengig av struktur og vev av interesse. Faktisk ble bilder med forbedret klarhet oppnådd for Arabidopsis pistils med modifisert CS, hvor konsentrasjonen av natriumdeoksykolat reduseres med halvparten; Reduserte konsentrasjoner av natriumdeoksykollat krevde imidlertid forlengede behandlingstider (f.eks. 1 måned for Arabidopsis pistils).
CS kan redusere rød autofluorescence (>610 nm) for å fjerne klorofyll i behandlede prøver. Imidlertid forble 500-600 nm rekkevidde autofluorescence (gul til oransje) selv i CS-behandlede prøver7. Denne autofluorescensen antas å være avledet fra celleveggen og andre cellulære komponenter, for eksempel lignin12,13. Derfor er det vanskelig å lage vev, for eksempel stengler med utviklede sekundære vegger, helt gjennomsiktig ved CS-behandling.
Flere clearing reagenser foruten de som brukes her er utviklet for å observere fluorescerende proteiner i planter ved hjelp av fluorescerende mikroskopi14,15,16,17. Sammenlignet med disse metodene fjerner CS og CSA klorofyll og reduserer autofluorescence, noe som gjør plantevevet mer gjennomsiktig. Nylig utviklet Sakamoto et al. en forbedret metode, iTOMEI, for fiksering, vaskemiddelrydding og montering for å justere brytningsindeksens mismatch18. I Arabidopsis frøplanter ryddet iTOMEI vevet innen 26 timer.
CS gjelder for et bredt spekter av plantearter, som Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avokado21, bygg22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Eucalyptus25, mais26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, soyabønne33, jordbær34, hvete35 og Wolffiella hyalina36. For tykkere vev kan CS også gjøre vibratomseksjonene gjennomsiktige37,38. Denne metoden tillot studier av cellulær struktur og genuttrykksmønstre i planter37,38. Videre ble nematodeinfeksjoner20,39, soppinfeksjoner og symbiose19,40,41 også observert dypt inne i det CS-behandlede vevet. Dermed er denne metoden nyttig for hele vevsavbildning fra mikro- til makroskalaer og kan bidra til å oppdage nye interaksjoner mellom ulike celler, vev, organer og organismer.

Visualisering av cellulære strukturer og lokalisering av proteiner i levende organismer er viktig for å avklare deres funksjoner in vivo. Men siden den levende kroppen ikke er gjennomsiktig, er det utfordrende å observere den indre strukturen til levende organismer uten disseksjon. Spesielt når det gjelder plantevev, som er flerlags med celler av forskjellige former, er indekskonflikten forårsaket av deres struktur og tilstedeværelsen av lysabsorberende pigmenter problematisk. For eksempel har planteblader en kompleks struktur som gjør at de effektivt kan utnytte lyset som kommer inn i kroppene sine for fotosyntese1, mens strukturen også forårsaker brytningsindekskonflikt, noe som gjør dem vanskelige å observere. Bladene har imidlertid mange lysabsorberende pigmenter, som klorofyll, som avgir sterk rød fluorescens og brune pigmenter produseres ved oksidasjon2,3. Disse pigmentene hindrer også mikroskopiobservasjoner av full montering i planter. Derfor, for å observere den indre strukturen av planter, har decolorization og fiksering av alkohol og rydding ved hjelp av klorhydrat blitt brukt i lang tid for å eliminere brytningsindeksens mismatch og autofluorescence4,5. Disse konvensjonelle metodene har blitt vedtatt i mange år, men de har ulempen med å eliminere fluorescensen av fluorescence av fluorescerende proteiner samtidig6,7. Dette er problematisk siden fluorescerende proteiner har blitt uunnværlige i dagens fluorescerende avbildning.
Derfor er ClearSee (CS) og ClearSeeAlpha (CSA) utviklet som optiske clearingreagenser for plantevev. Begge reagensene reduserer klorofyll autofluorescens samtidig som stabiliteten til fluorescerende proteiner opprettholdes7,8. CSA er spesielt nyttig når brune pigmenter produseres på grunn av vevsoksidasjon. Ved hjelp av disse ryddereagensene er det mulig å observere cellulær struktur og proteinlokalisering inne i plantekroppen uten fysisk seksjonering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcofluor White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearSee</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18&#215;18 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24&#215;24 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C024241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (25&#215;60 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>AS One</td>
			<td>1-5801-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>346-07951</td>
			<td>1 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS One</td>
			<td>6-9085-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>C0316</td>
			<td>Figure 6_1; Lot PSGYK-QB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Kishida Chemical</td>
			<td>260-71412</td>
			<td>Figure 6_2; Lot C05543H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Figure 6_3; Lot SLBS7362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td>Figure 6_4; Lot BCBW0612</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>10712-96</td>
			<td>Figure 6_5; Lot M5R3403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>194-08311</td>
			<td>Figure 6_6; Lot LKL0648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-03411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>211-01213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>BUCHI</td>
			<td>V-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylitol</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>248-00545</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging

Det er utfordrende å direkte observere den indre strukturen til flerlags og ugjennomsiktige planteprøver, uten disseksjon, under et mikroskop. I tillegg hemmer autofluorescence tilskrevet klorofyll observasjonen av fluorescerende proteiner i planter. I lang tid har ulike clearingreagenser blitt brukt til å gjøre planter gjennomsiktige. Konvensjonelle clearingreagenser reduserer imidlertid fluorescerende signaler; Derfor har det ikke vært mulig å observere de cellulære og intracellulære strukturene med fluorescerende proteiner. Reagenser ble utviklet som kan fjerne plantevev ved å fjerne klorofyll samtidig som fluorescerende proteinstabilitet opprettholdes. En detaljert protokoll er gitt her for optisk rydding av plantevev ved hjelp av clearing reagenser, ClearSee (CS) eller ClearSeeAlpha (CSA). Utarbeidelsen av ryddet plantevev innebærer tre trinn: fiksering, vasking og rydding. Fiksering er et avgjørende skritt for å opprettholde cellulære strukturer og intracellulær stabilitet av fluorescerende proteiner. Inkubasjonstiden for rydding avhenger av vevstype og art. I Arabidopsis thaliana var tiden som kreves for rydding med CS 4 dager for blader og røtter, 7 dager for frøplanter og 1 måned for pistils. CS krevde også en relativt kort tid på 4 dager for å gjøre de gametofytiske bladene til Physcomitrium patens gjennomsiktige. I motsetning produserte pistils i tobakk og torenia brunt pigment på grunn av oksidasjon under CS-behandling. CSA reduserte det brune pigmentet ved å forhindre oksidasjon og kunne gjøre tobakk og torenia pistils gjennomsiktig, selv om det tok relativt lang tid (1 eller 2 måneder). CS og CSA var også kompatible med farging ved hjelp av kjemiske fargestoffer, som DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole) og Hoechst 33342 for DNA og Calcofluor White, SR2200 og Direct Red 23 for celleveggen. Denne metoden kan være nyttig for avbildning av hele anlegget for å avdekke intakt morfologi, utviklingsprosesser, plantemikrobeinteraksjoner og nematodeinfeksjoner.

CS kan fjerne blader av ulike arter (figur 3A-H). Det er vanskelig for CS-løsningen å trenge inn i et risblad fordi bladoverflaten er dekket av kutikulær voks i denne planten. Men etter å ha ekstrahert kutikulær voks ved å dyppe i kloroform i 10 s, kan CS fjerne risbladene (figur 3H). CS kunne imidlertid ikke trenge inn i Chamaecyparis obtusa-blader som er mindre gjennomtrengelige for CS (figur 3I,J). I Krysantemumblader ble brun pigmentering indusert av polyfenoloksidasjon observert i CS-behandlede blader (figur 3K,L). På samme måte viste tobakks- og torenia pistils brun pigmentering under CS-behandlingen (figur 3M,O). Ettersom natriumsulfittkomponenten i CSA forhindrer polyfenoloksidasjon på grunn av den reduserende effekten, kan CSA fjerne tobakk og torenia pistils uten brun pigmentering (figur 3N, P).
Figur 4B viser at CS-behandling reduserte den lysegrønne fargen på Arabidopsis H2B-mClover-bladet (lyst felt) og forbedret fluorescensintensiteten til H2B-mClover sammenlignet med PBS-inkubasjon (figur 4A). I tillegg til blomstrende planter gjelder CS også for moseplanter (figur 4C); etter 4 dager med CS-behandling ble fluorescensen til H2B-mRFP tydelig påvist for hele gametophoren med redusert klorofyll autofluorescence. Figur 4D,E viser 3D rekonstruksjon bilder av H2B-mClover pistil i Nicotiana benthamiana ryddet ved hjelp av CSA. Prøvedybden var 440 μm. Som det dybdekodede bildet av maksimal intensitetsprojeksjon viser, gir CSA mulighet for dyp bildebehandling av utfordrende vev, for eksempel tobakk pistils.
CS og CSA var også kompatible med fluorescerende fargestofffarging. Figur 5 viser at CS samtidig kan brukes til å observere fluorescerende protein (H2B-mClover) og organisk fluorescerende fargestofffarging (Calcofluor White). Etter 3D-rekonstruksjon fra z-stack-bildene, kan enhver seksjon observeres.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig03.jpg"> Figur 3: Optisk rydding av blader og pistiler ved hjelp av ryddeløsninger. (A-L) Faste blader av ulike arter ble inkubert i PBS (A, C, E, G, I, K) eller CS (B,D,F,H,J,L) i 8 dager og CS (M,O) eller CSA (N,P) i 2 dager. (A,B,O,P) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) Chrysanthemum morifolium, (M,N) Nikotiana benthamiana. Skalastenger: 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig04.jpg"> Figur 4: Fluorescensavbildning av vev behandlet med clearingløsninger. (A,B) UBQ10pro::H2B-mCloverblader av Arabidopsis thaliana ble behandlet med PBS (A) eller CS (B) i 3 dager. (C) H2B-mRFP løvrike gametophores av Physcomitrium patens ble behandlet med CS i 4 dager. Kjernene ble merket med H2B-mRFP (grønn). CS-behandlingen reduserte klorofyll autofluorescens (magenta). H2B-mRFP-signalet i den apikale regionen ble tydelig observert for både sammenslåtte bilder av H2B-mRFP og autofluorescence eller bright field. (D,E) UBQ10pro::H2B-mClover stigma av Nicotiana benthamiana ble behandlet i CSA i 1 måned. Projeksjon med maksimal intensitet (D) og dybdekodet projeksjon med maksimal intensitet (E) ble generert fra 88 z-stack-bilder med intervaller på 5 μm. Skalastenger: 100 μm. Bilder ble tatt ved hjelp av bredfeltsmikroskopi (A, B), konfokal (C) og tofotoneksitasjon (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig05.jpg"> Figur 5: Fluorescerende fargestofffarging er kompatibel med CS. (A) CS-behandlede blader observert ved to-foton eksitasjonsmikroskopi med 950 nm eksitasjon. Celleveggen er farget med Calcofluor White (cyan). Nuclei er merket med UBQ10pro::H2B-mClover (gul). Bildene yz (B) og xz (C) er tverrsnitt i den posisjonen som indikeres av de hvite stiplede linjene i (A). Skalalinje: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig06.jpg"> Figur 6: Gjennomsiktighet av natriumdeoksycholat. (A) Farger av ulike 15% natriumdeoksycholater (oppført i Materialfortegnelse). (B) Fluorescensspekter av hver 15% natriumdeoksycholat med 380 nm eksitasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Her er en metode beskrevet for å gjøre plantevev gjennomsiktig samtidig som stabiliteten til fluorescerende proteiner opprettholdes. Denne teknikken letter dyp avbildning av ryddet plantevev uten fysisk seksjonering.

Optisk rydding av plantevev for fluorescensavbildning

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Denne metoden kan være nyttig i hele anleggets avbildning for å avdekke intakt morfologi, utviklingsprosesser og plantemikrobeinteraksjoner. Den største fordelen med denne teknikken er at vi direkte kan observere innsiden av en plantekropp uten å påføre skade på den. Siden denne metoden gjelder et bredt spekter av plantearter og vev, kan det bidra til å akselerere oppdagelsen av nye fenomener i plantebiologiske forskning.Fiksering er et kritisk trinn i denne prosedyren. Før ryddetrinnet må man sjekke intensiteten av fluorescerende protein etter fiksering. For å begynne å nedsenke planteprøver i fikseringsløsningen i et mikrorør, og sørg for at volumet av den fikseringsløsningen er mer enn fem ganger prøvevolumet.Forsegle mikrorøret med en parafilm og lag hull med en nål. Plasser mikrorøret i en desiccator og juster vakuumgraden sakte til rundt 690 millimeter kvikksølv slik at bobler vises gradvis fra prøvene. Slå av vakuumpumpen etter evakuering av tørkeapparatet.Luft ut uttørken forsiktig uten å forstyrre prøvene. Slå på vakuumpumpen igjen og slå den av etter at du har evakuert tørkeapparatet. Åpne tørkemiddelet forsiktig uten å støte på den fikseringsløsningen i mikrorøret.Fjern den fikseringsløsningen og tilsett 1x PBS med en mikropipette. Etter lagring i ett minutt, bytt ut den gamle PBS med ny 1x PBS. Etter å ha fjernet PBS ved fem ganger prøvevolumet av avregningsløsningen, forsegler du mikrorøret med parafilm og lager hull med en nål.Plasser prøvene i tørkeapparatet. Evakuer og slå av vakuumpumpen. Åpne tørkeapparatet forsiktig, og lukk deretter mikrorøret.Snu mikrorøret, hver en til to dager for å akselerere ryddingsprosessen. For avstandsrammen, kutt et silikongummiark med et barberblad som justerer silikongummiplatens tykkelse i henhold til prøvetykkelsen. Plasser silikonrammen på et dekselglass, plasser deretter de behandlede prøvene i rammen og legg til rundt 100 mikroliter clearingløsning for å fjerne eventuelle bobler.Dekk med et annet dekselglass for å forhindre fordampning av avregningsløsningen. Vær oppmerksom på prøvene under et fluorescerende mikroskop. Etter observasjon returnere prøvene til clearing løsning i en mikrotube.Faste blader av ulike arter ble inkubert i PBS eller ClearSee i åtte dager, i ClearSee eller ClearSeeAlpha i to dager. ClearSee kan fjerne blader av ulike arter. Etter å ha trukket ut kutikulær, kunne ClearSee fjerne risblader.Ettersom natriumsulfittkomponenten i ClearSeeAlpha forhindrer polyfenoloksidasjon på grunn av den reduserende effekten, kan ClearSeeAlpha fjerne tobakk og tirania pistils uten brun pigmentering. Ubiquitin-10 promotør H2B-mClover blader av arabidopsis thaliana ble behandlet med PBS eller ClearSee i tre dager. ClearSee-behandling reduserte den lysegrønne fargen på arabidopsis H2B-mClover-bladet og forbedrer fluorescensintensiteten til H2B-mClover sammenlignet med PBS-inkubasjon.ClearSee-behandlede blader ble observert ved to-foton eksitasjonsmikroskopi med 950 nanometereksitasjon. Celleveggen er farget med calcaflour-hvit. Nuclei er merket med ubiquitin-10 promotor, H2B-mClover.Y Z- og X Z-bildene er tverrsnitt i den posisjonen som indikeres av de hvite stiplede linjene. Forberedelse av den fikseringsløsningen er viktig for å fikse prøvene. Det må imidlertid utvises forsiktighet for å forhindre skade på prøvene under vakuum.Mikroskopisk avbildning kan utføres for å studere flere genuttrykksmønstre og intracellulær kommunikasjon under planteutvikling og infeksjon etter denne prosedyren.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Plant Cell Structure and Organization

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Høytrykks Frysing og Quick Freeze Bytte av plantemateriale for transmisjonselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule Frequency med Fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...