Name: optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging
Uploaded: 2022-01-05T15:00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Japan Society for the Promotion of Science (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 till T.H.), Anslag för vetenskaplig forskning (B, JP17H03697 till D.K.), anslag för utmanande förberedande forskning (JP18K19331 till D.K.), Anslag för vetenskaplig forskning om innovativa områden (JP20H05358 för D.K.)) och Japan Science and Technology Agency (PRESTO.M-programmet JPMJPR18K4 till D.K.)). Författarna är tacksamma för Live Imaging Center vid Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM) vid Nagoya University för att stödja de mikroskopiska studierna och Editage (www.editage.com) för engelskspråkig redigering.

1. Utarbetande av clearinglösningar
<ol><li>För att förbereda CS-lösningen, lös upp 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) natriumdeoxikolat och 25% (w/v) urea i destillerat vatten på en magnetomrörare. OBS: Natriumdeoxikolatpulver bör vägas i en utkastkammare eftersom det lätt flyter i luften. CS kan förvaras i rumstemperatur i mörker i mer än 1 år.</li>
	<li>För att förbereda CSA-lösningen, tillsätt natriumsulfit (50 mM slutlig koncentration) till den CS-lösning som erhålls ovan. OBS: Tillsätt natriumsulfit till CS-lösningen precis innan den används eftersom reduktionsmedlet lätt avaktiveras.</li>
</ol>2. Beredning av den fixativa lösningen
<ol><li>Överför 40 ml steriliserat vatten till ett koniskt rör och tillsätt 2 g paraformaldehyd. Tillsätt 200 μL 2 N NaOH för att öka lösningens pH. Efter stängning och tätning av röret med parafilm, inkubera vid 60 °C med tillfälliga inversioner tills allt är upplöst.</li>
	<li>Efter kylning av lösningen till rumstemperatur, tillsätt 5 ml 10x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för att justera pH-värdet till 7,4. Tillsätt steriliserat vatten för att kompensera volymen till 50 ml. OBS: En nyberedd fixativ lösning är att föredra. Lösningen kan också förvaras vid -30 °C i flera månader.</li>
</ol>3. Fixering av prover
<ol><li>Fördjupa växtprover i den fixativa lösningen i ett mikrorör (figur 1A), vilket säkerställer att volymen av den fixativa lösningen är mer än fem gånger provvolymen.</li>
	<li>Försegla mikroröret med en parafilm och gör hål med en nål. Lämna inte röret öppet på grund av risk för provspill under vakuumdekompression.</li>
	<li>Placera mikroröret i en desiccator och justera långsamt graden av vakuum (~ 690 mmHg) så att bubblor uppträder gradvis från proverna (figur 1B-C). Stäng av vakuumpumpen efter evakuering av avsickatorn. Lämna mikroröret ostört i 30 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Ventilera avsickatorn försiktigt för att förhindra att proverna störs. Slå på vakuumpumpen igen och stäng av den efter evakuering av desiccatorn. Lämna mikroröret ostört i 30 minuter vid rumstemperatur. OBS: Var försiktig så att proverna skadas när desiccatorn ventileras. Penetrationen av den fixativa lösningen i proverna förbättras av två vakuumbehandlingar. Ytterligare vakuumbehandling hjälper till att penetrera den fixativa lösningen i tjockare prover.</li>
	<li>Öppna avsickatorn försiktigt utan att stöta den fixativa lösningen i mikroröret. Använd en mikropipette, ta bort den fixativa lösningen och tillsätt 1x PBS. Efter lagring i 1 min, byt ut den gamla PBS med ny 1x PBS (bild 1D).</li>
</ol>4. Clearing
<ol><li>När du har tagit bort PBS lägger du till fem gånger provvolymen för clearinglösningen.</li>
	<li>Försegla mikroröret med parafilm och gör hål med en nål. Placera proverna i desiccatorn, evakuera enligt steg 3.3 och stäng av vakuumpumpen. Lämna mikroröret ostört i 60 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Öppna avsickatorn försiktigt. Stäng mikroröret med parafilm och förvara det vid rumstemperatur i mörkret för att undvika fotobleaching av fluorescerande proteiner. Invertera mikroröret var 1-2 dag för att påskynda clearingprocessen.</li>
	<li>När clearinglösningen blir grön, byt ut den mot nya clearinglösningar tills lösningen förblir färglös (figur 1E-H).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig01.jpg"> Figur 1: Förfarande för CS-behandling. (A) Arabidopsis planta i 4% PFA (Paraformaldehyd) lösning. B) Provet placeras i en desiccator. C) Plantan fixeras under ett vakuum. (D) Plantan blötläggs i PFA-lösningen efter vakuumbehandling. (E) Resulterande 3-dagars rensningslösningsbehandlad planta. Notera den gröna färgen på clearinglösningen. F) Clearinglösningen byts ut 3 dagar efter behandlingen. (G) Resulterande 5-dagars rensningslösningsbehandlad planta. (H) Clearinglösningen byts ut 5 dagar efter behandlingen. Skalstänger: 1 cm (A,C-H) och 5 cm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
5. Kemisk färgfärgning
<ol><li>Tillsätt Hoechst 33342 (slutlig koncentration på 10 μg/ml) för kärnfärgning eller calcofluorvit (slutlig koncentration på 1 mg/ml) för cellväggsfärgning och vänta i 1 h. Efter att ha tagit bort färglösningen, tvätta provet med en ny clearinglösning i 1 h. OBS: Färgning och tvättning över natten kan förbättra fluorescerande färgpenetration i vävnader och minska bakgrundfluorescens. Olika fluorescerande färgämnen är kompatibla med CS-lösningen som Basic Fuchsin9 (lignin), Auramine O9 (lignin, suberin och cutin), Nile Red9 (suberin), Direct Yellow 969, Direct Red 239 och SR220010,11 (cellväggar).</li>
</ol>6. Observation
<ol><li>Skär silikongummiplåt med ett rakblad för att förbereda en ram för distansen (figur 2A). OBS: Justera tjockleken på kiselgummiplåten efter provets tjocklek. Eftersom prover som behandlats med klareringslösning är mjuka kommer de att skadas om de täcks direkt med täckglaset.</li>
	<li>Placera silikonramen på täckglas (t.ex. 25 x 60 mm) (figur 2B). Placera de behandlade proverna i ramen och tillsätt ~ 100 μL klareringslösning för att avlägsna eventuella bubblor i ramen. Täck med ett annat täckglas (18 x 18 mm eller 24 x 24 mm) för att förhindra avdunstning av klareringslösningen (figur 2C).</li>
	<li>Observera proverna under ett fluorescerande mikroskop. Efter observation, returnera proverna till clearinglösningen som tagits i ett mikrorör och förvara vid rumstemperatur i mörkret.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig02.jpg"> Bild 2: Provberedning för mikroskopisk observation. (B) Lägg silikonplåtsramen på täckglaset. C) Placera provet som behandlats med klareringslösning (märkt med prickad kantlinje) inom ramen och täck det med ett täckglas. Skalningsstaplar: 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<ol>
	<li>Vogelmann, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+within+the+plant.">Light within the plant.</a> Photomorphogenesis in Plants. , 491-535 (1994).</li><li>Krause, G. H., Weis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence+and+photosynthesis:+The+basics.">Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42 (1), 313-349 (1991).</li><li>Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+oxidation+in+plants:+from+biochemical+properties+to+physiological+functions.">Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions.</a> Trends in Plant Science. 12 (1), 29-36 (2007).</li><li>Lersten, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+annotated+bibliography+of+botanical+clearing+methods.">An annotated bibliography of botanical clearing methods.</a> Iowa State Journal of Science. 41 (4), 481-486 (1967).</li><li>Villani, T. S., Koroch, A. R., Simon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+clearing+and+mounting+solution+to+replace+chloral+hydrate+in+microscopic+applications.">An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications.</a> Applications in Plant Sciences. 1 (5), 1300016 (2013).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS ONE. 7 (3), 33916 (2012).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+a+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSeeAlpha:+advanced+optical+clearing+for+whole-plant+imaging.">ClearSeeAlpha: advanced optical clearing for whole-plant imaging.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).</li><li>Ursache, R., Andersen, T. G., Marhav&#253;, P., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+combining+fluorescent+proteins+with+histological+stains+for+diverse+cell+wall+components.">A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components.</a> The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).</li><li>Tofanelli, R., Vijayan, A., Scholz, S., Schneitz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+rapid+clearing+and+staining+of+fixed+Arabidopsis+ovules+for+improved+imaging+by+confocal+laser+scanning+microscopy.">Protocol for rapid clearing and staining of fixed Arabidopsis ovules for improved imaging by confocal laser scanning microscopy.</a> Plant Methods. 15 (1), 120 (2019).</li><li>Vijayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+3D+reference+atlas+reveals+cellular+growth+patterns+shaping+the+Arabidopsis+ovule.">A digital 3D reference atlas reveals cellular growth patterns shaping the Arabidopsis ovule.</a> eLife. 10, 1-38 (2021).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., George Barisas, B., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 1-20 (2013).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252, 1231-1240 (2015).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).</li><li>Warner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+clearing+technique+for+plant+tissues+allowing+deep+imaging+and+compatible+with+fluorescence+microscopy.">An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy.</a> Plant Physiology. 166 (4), 1684-1687 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+plant+organs+using+a+simple+and+rapid+transparency+technique.">Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique.</a> Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).</li><li>Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+optical+clearing+protocol+for+deep+tissue+imaging+of+fluorescent+proteins+in+Arabidopsis+thaliana.">A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana.</a> PLOS ONE. 11 (8), 0161107 (2016).</li><li>Sakamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+clearing+method+contributes+to+deep+imaging+of+plant+organs.">Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs.</a> Research Square. , (2021).</li><li>Tanaka, E., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-leaf+fluorescence+imaging+to+visualize+in+planta+fungal+structures+of+Victory+onion+leaf+rust+fungus,+Uromyces+japonicus,+and+its+taxonomic+evaluation.">Whole-leaf fluorescence imaging to visualize in planta fungal structures of Victory onion leaf rust fungus, Uromyces japonicus, and its taxonomic evaluation.</a> Mycoscience. 59 (2), 137-146 (2018).</li><li>Ohtsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+deep+imaging+of+syncytium+induced+by+the+soybean+cyst+nematode+Heterodera+glycines.">Spatiotemporal deep imaging of syncytium induced by the soybean cyst nematode Heterodera glycines.</a> Protoplasma. 254, 2107-2115 (2017).</li><li>Duman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+de-etiolation+increases+the+rooting+of+VC801+Avocado+rootstock.">Short de-etiolation increases the rooting of VC801 Avocado rootstock.</a> Plants. 9 (11), 1481 (2020).</li><li>Ho, W. W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+multi-omics+analyses+of+barley+rootzones+under+salinity+stress+reveal+two+distinctive+salt+tolerance+mechanisms.">Integrative multi-omics analyses of barley rootzones under salinity stress reveal two distinctive salt tolerance mechanisms.</a> Plant Communications. 1 (3), 100031 (2020).</li><li>Arsovski, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrphyB+is+critical+for+rapid+recovery+to+darkness+in+mature+Brassica+rapa+leaves.">BrphyB is critical for rapid recovery to darkness in mature Brassica rapa leaves.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Doll, Y., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+stomatal+development+regulation+in+Callitriche+is+related+to+the+intrageneric+diversity+in+lifestyles.">The diversity of stomatal development regulation in Callitriche is related to the intrageneric diversity in lifestyles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (14), (2021).</li><li>Eliyahu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetative+propagation+of+elite+Eucalyptus+clones+as+food+source+for+honeybees+(Apis+mellifera);+adventitious+roots+versus+callus+formation.">Vegetative propagation of elite Eucalyptus clones as food source for honeybees (Apis mellifera); adventitious roots versus callus formation.</a> Israel Journal of Plant Sciences. 67 (1-2), 83-97 (2020).</li><li>Kelliher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATRILINEAL,+a+sperm-specific+phospholipase,+triggers+maize+haploid+induction.">MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction.</a> Nature. 542, 105-109 (2017).</li><li>Aki, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+signaling+is+essential+for+organ+formation+in+Marchantia+polymorpha.">Cytokinin signaling is essential for organ formation in Marchantia polymorpha.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (8), 1842-1854 (2019).</li><li>Kinoshita, A., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+ANGUSTIFOLIA3+and+SHOOT+MERISTEMLESS,+key+genes+for+meristematic+activity+in+a+one-leaf+plant+Monophyllaea+glabra,+revealed+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Expression profiles of ANGUSTIFOLIA3 and SHOOT MERISTEMLESS, key genes for meristematic activity in a one-leaf plant Monophyllaea glabra, revealed by whole-mount in situ hybridization.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 1-11 (2020).</li><li>Okazawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+planteose+hydrolysis+during+seed+germination+of+Orobanche+minor.">Localization of planteose hydrolysis during seed germination of Orobanche minor.</a> bioRxiv. , 448768 (2021).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAPYRIN+attenuates+defence+by+repressing+PR+gene+induction+and+localized+lignin+accumulation+during+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+of+Petunia+hybrida.">VAPYRIN attenuates defence by repressing PR gene induction and localized lignin accumulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis of Petunia hybrida.</a> New Phytologist. 229 (6), 3481-3496 (2021).</li><li>Chu, T. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+markers+highlight+intracellular+dynamics+of+membrane+proteins+in+response+to+abiotic+treatments+in+rice.">Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice.</a> Rice. 11, 23 (2018).</li><li>Alaguero-Cordovilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin-mediated+regulatory+framework+for+wound-induced+adventitious+root+formation+in+tomato+shoot+explants.">An auxin-mediated regulatory framework for wound-induced adventitious root formation in tomato shoot explants.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 44 (5), 1642-1662 (2021).</li><li>Okuda, A., Matsusaki, M., Masuda, T., Urade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+GmPDIL7,+a+soybean+ER+membrane-bound+protein+disulfide+isomerase+family+protein.">Identification and characterization of GmPDIL7, a soybean ER membrane-bound protein disulfide isomerase family protein.</a> The FEBS Journal. 284 (3), 414-428 (2017).</li><li>Kim, D. -. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutualistic+interaction+between+Streptomyces+bacteria,+strawberry+plants+and+pollinating+bees.">A mutualistic interaction between Streptomyces bacteria, strawberry plants and pollinating bees.</a> Nature Communications. 10 (1), 4802 (2019).</li><li>Wu, J., Mock, H. -. P., Giehl, R. F. H., Pitann, B., M&#252;hling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+decreases+cadmium+concentrations+by+modulating+root+endodermal+suberin+development+in+wheat+plants.">Silicon decreases cadmium concentrations by modulating root endodermal suberin development in wheat plants.</a> Journal of Hazardous Materials. 364, 581-590 (2019).</li><li>Isoda, M., Oyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+duckweed+species,+Wolffiella+hyalina,+for+whole-plant+observation+of+physiological+behavior+at+the+single-cell+level.">Use of a duckweed species, Wolffiella hyalina, for whole-plant observation of physiological behavior at the single-cell level.</a> Plant Biotechnology. 35 (4), 387-391 (2018).</li><li>Ben-Targem, M., Ripper, D., Bayer, M., Ragni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+and+gibberellin+signaling+cross-talk+promotes+hypocotyl+xylem+expansion+and+cambium+homeostasis.">Auxin and gibberellin signaling cross-talk promotes hypocotyl xylem expansion and cambium homeostasis.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (10), 3647-3660 (2021).</li><li>Shwartz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VIL+gene+CRAWLING+ELEPHANT+controls+maturation+and+differentiation+in+tomato+via+polycomb+silencing.">The VIL gene CRAWLING ELEPHANT controls maturation and differentiation in tomato via polycomb silencing.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Levin, K. A., Tucker, M. R., Strock, C. F., Lynch, J. P., Mather, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+reveals+that+positions+of+cyst+nematode+feeding+sites+relative+to+xylem+vessels+differ+between+susceptible+and+resistant+wheat.">Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat.</a> Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).</li><li>Nouri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+suppression+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+involves+gibberellic+acid+signaling.">Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).</li><li>Evangelisti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+enables+the+identification+and+quantification+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi+in+plant+roots.">Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots.</a> bioRxiv. , 434067 (2021).</li></ol>

ClearSee kommersialiseras (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Japan). Nagoya University innehar ett patent (JP6601842) på clearingreagenset ClearSee. D. Kurihara är patentuppfinnaren. Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Denna metod består av fixering, tvättning och rengöring. Fixering är ett kritiskt steg i det här protokollet. Om det fluorescerande proteinet inte observeras efter PFA-fixering kommer det inte att observeras efter behandling med clearinglösning. Penetrationen av PFA-lösning i vävnader är kritisk, men hög vakuumbehandling rekommenderas inte eftersom det kan förstöra cellstrukturen. Vakuumförhållanden och fixeringsperioder bör optimeras för varje typ av vävnad och art. Det rekommenderas att kontrollera fluorescerande proteiner även efter fixering. Även om proverna vanligtvis var fasta i 30-60 min vid rumstemperatur, kan de fixeras vid 4 °C under en längre tid (över natten eller mer).
Som visas i figur 6A hade vissa natriumdeoxikolater en blekgul färg när de upplöstes. Sådana natriumdeoxikolalatlösningar visade stark autofluorescens i regionen 400-600 nm efter excitation vid 380 nm (figur 6B). Denna autofluorescens förhindrar optisk rensning och fluorescensavbildning. Användare bör kontrollera färgen på natriumdeoxikolatlösning eftersom kvaliteten på reagenset kan skilja sig åt på grund av renhet, lot-to-lot variation eller andra skäl.
De clearinglösningar som används här har höga koncentrationer av natriumdeoxikolat, vilket kan förstöra membranstrukturen. Plasmamembranmarkören (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) observerades även efter CS-behandling7. Det kan dock vara bättre att minska koncentrationen av natriumdeoxikolat, beroende på strukturen och vävnaden av intresse. Bilder med förbättrad klarhet erhölls faktiskt för Arabidopsis pistiller med modifierad CS, där koncentrationen av natriumdeoxykolat minskas med hälften. Minskade koncentrationer av natriumdeoxikolat krävde dock förlängda behandlingstider (t.ex. 1 månad för arabidopsis pistils).
CS kan minska röd autofluorescens (>610 nm) för att avlägsna klorofyll i behandlade prover. 500-600 nm intervall autofluorescens (gul till orange) förblev dock även i CS-behandlade prover7. Denna autofluorescens tros härledas från cellväggen och andra cellulära komponenter, såsom lignin12,13. Därför är det svårt att göra vävnader, såsom stjälkar med utvecklade sekundära väggar, helt transparenta genom CS-behandling.
Flera röjningreagenser förutom de som används här har utvecklats för att observera fluorescerande proteiner i växter med fluorescerande mikroskopi14,15,16,17. Jämfört med dessa metoder tar CS och CSA bort klorofyll och minskar autofluorescens, vilket gör växtvävnaderna mer transparenta. Utvecklade nyligen en förbättrad metod, iTOMEI, för fixering, tvättmedelsrensning och montering för att justera brytningsindexet matchar inte18. I Arabidopsis plantor rensade iTOMEI vävnaden inom 26 h.
CS är tillämpligt på ett brett spektrum av växtarter, såsom Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avokado21, korn22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Eucalyptus25, majs26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, sojabönor33, jordgubbe34, vete35 och Wolffiella hyalina36. För tjockare vävnader kan CS också göra vibratomsektionerna transparenta37,38. Denna metod tillät studier av cellulär struktur och genuttryck mönster i växter37,38. Dessutom observerades nematodinfektioner20,39, svampinfektioner och symbios19,40,41 också djupt inne i de CS-behandlade vävnaderna. Således är denna metod användbar för hela vävnad imaging från mikro- till makro-skalor och kan hjälpa till att upptäcka nya interaktioner mellan olika celler, vävnader, organ och organismer.

Visualisering av cellulära strukturer och lokalisering av proteiner i levande organismer är viktigt för att klargöra deras funktioner in vivo. Men eftersom den levande kroppen inte är transparent är det utmanande att observera den inre strukturen hos levande organismer utan dissekering. Särskilt när det gäller växtvävnader, som är flerskiktade med celler av olika former, är indexfelet som orsakas av deras struktur och närvaron av ljusabsorberande pigment problematiskt. Till exempel har växtblad en komplex struktur som gör det möjligt för dem att effektivt utnyttja ljuset som kommer in i deras kroppar för fotosyntes1, medan strukturen också orsakar brytningsindexfel, vilket gör dem svåra att observera. Bladen har dock många ljusabsorberande pigment, såsom klorofyll, som avger stark röd fluorescens och brunaktiga pigment produceras genom oxidation2,3. Dessa pigment hindrar också hela berget fluorescensmikroskopi observationer i växter. För att observera växternas inre struktur har därför avfärgning och fixering genom alkohol och röjning med klorhydrat använts under lång tid för att eliminera brytningsindex missmatchning och autofluorescens4,5. Dessa konventionella metoder har antagits i många år, men de har nackdelen att eliminera fluorescensen av fluorescerande proteiner samtidigt6,7. Detta är problematiskt eftersom fluorescerande proteiner har blivit oumbärliga i nuvarande fluorescerande avbildning.
Därför har ClearSee (CS) och ClearSeeAlpha (CSA) utvecklats som optiska clearingreagenser för växtvävnader. Båda reagenserna minskar klorofyll autofluorescens samtidigt som stabiliteten hos fluorescerande proteiner7,8 bibehålls. CSA är särskilt användbart när bruna pigment produceras på grund av vävnadsoxidation. Med hjälp av dessa clearingreagenser är det möjligt att observera cellstrukturen och proteinlokaliseringen inuti växtkroppen utan fysisk sektionering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcofluor White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearSee</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18&#215;18 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24&#215;24 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C024241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (25&#215;60 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>AS One</td>
			<td>1-5801-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>346-07951</td>
			<td>1 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS One</td>
			<td>6-9085-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>C0316</td>
			<td>Figure 6_1; Lot PSGYK-QB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Kishida Chemical</td>
			<td>260-71412</td>
			<td>Figure 6_2; Lot C05543H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Figure 6_3; Lot SLBS7362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td>Figure 6_4; Lot BCBW0612</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>10712-96</td>
			<td>Figure 6_5; Lot M5R3403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>194-08311</td>
			<td>Figure 6_6; Lot LKL0648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-03411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>211-01213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>BUCHI</td>
			<td>V-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylitol</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>248-00545</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging

Det är utmanande att direkt observera den inre strukturen hos flerskiktiga och ogenomskinliga växtprover, utan dissekering, under ett mikroskop. Dessutom hindrar autofluorescens som tillskrivs klorofyll observationen av fluorescerande proteiner i växter. Under lång tid har olika clearingreagenser använts för att göra växter transparenta. Konventionella clearingreagenser minskar dock fluorescerande signaler; därför har det inte varit möjligt att observera cellulära och intracellulära strukturer med fluorescerande proteiner. Reagenser utvecklades som kan rensa växtvävnader genom att ta bort klorofyll samtidigt som fluorescerande protein stabilitet upprätthålls. Ett detaljerat protokoll finns här för optisk röjning av växtvävnader med hjälp av clearingreagenser, ClearSee (CS) eller ClearSeeAlpha (CSA). Beredningen av rensade växtvävnader innebär tre steg: fixering, tvättning och clearing. Fixering är ett avgörande steg för att upprätthålla cellulära strukturer och intracellulär stabilitet av fluorescerande proteiner. Inkubationstiden för röjning beror på vävnadstyp och art. I Arabidopsis thaliana var den tid som krävdes för röjning med CS 4 dagar för löv och rötter, 7 dagar för plantor och 1 månad för pistiller. CS krävde också en relativt kort tid på 4 dagar för att göra de gametofytiska bladen av Physcomitrium patens transparenta. Pistiller i tobak och toreni producerade däremot brunt pigment på grund av oxidation under CS-behandlingen. CSA minskade det bruna pigmentet genom att förhindra oxidation och kunde göra tobaks- och toreniapiss transparenta, även om det tog relativt lång tid (1 eller 2 månader). CS och CSA var också kompatibla med färgning med kemiska färgämnen, såsom DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole) och Hoechst 33342 för DNA och Calcofluor White, SR2200 och Direct Red 23 för cellväggen. Denna metod kan vara användbar för hela anläggningen imaging att avslöja intakt morfologi, utvecklingsprocesser, växt-mikrob interaktioner och nematod infektioner.

CS kan rensa blad av olika arter (figur 3A-H). Det är svårt för CS-lösningen att tränga in i ett risblad eftersom bladytan är täckt av cuticular vax i denna växt. Efter att ha extraherat det kapikulära vaxet genom att doppa i kloroform i 10 s, kunde CS dock rensa risbladen (figur 3H). CS kunde dock inte tränga igenom Chamaecyparis obtusablad som är mindre genomsläppliga för CS (figur 3I,J). I krysantemumblad observerades brun pigmentering inducerad av polyfenol oxidation i de CS-behandlade bladen (figur 3K,L). På samma sätt visade tobaks- och toreniahyckor brun pigmentering under CS-behandlingen (figur 3M, O). Eftersom natriumsulfitkomponenten i CSA förhindrar polyfenoloxidation på grund av den reducerande effekten, skulle CSA kunna rensa tobaks- och toreniahyckler utan brun pigmentering (figur 3N,P).
Figurerna 4B visar att CS-behandlingen minskade den blekgröna färgen på Arabidopsis H2B-mClover-bladet (ljust fält) och förbättrade fluorescensintensiteten hos H2B-mClover jämfört med PBS inkubation (figur 4A). Förutom blommande växter är CS också tillämpligt på mossväxter (figur 4C). efter 4 dagar av CS behandling upptäcktes fluorescens av H2B-mRFP tydligt för hela gametophore med minskad klorofyll autofluorescens. Figurerna 4D, E visar 3D rekonstruktion bilder av H2B-mClover pistill i Nicotiana benthamiana rensas med hjälp av CSA. Provdjupet var 440 μm. Som den djupkodade maximala intensitetsprojektionsbilden visar möjliggör CSA djup avbildning av utmanande vävnader, såsom tobaksflikar.
CS och CSA var också kompatibla med fluorescerande färg färg färgning. Figur 5 visar att CS samtidigt kan användas för att observera fluorescerande protein (H2B-mClover) och organisk fluorescerande färg färg färgning (Calcofluor White). Efter 3D-rekonstruktion från z-stack-bilderna kunde alla avsnitt observeras.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig03.jpg"> Figur 3: Optisk röjning av blad och pistiller med hjälp av röjningslösningar. (A,B,O,P) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) Chrysanthemum morifolium, (M,N) Nicotiana benthamiana. Skalningsstaplar: 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig04.jpg"> Figur 4: Fluorescensavbildning av vävnader som behandlats med clearinglösningar. (C) H2B-mRFP lummiga gametoforer av Physcomitrium patens behandlades med CS i 4 dagar. Kärnorna var märkta med H2B-mRFP (grön). CS-behandlingen minskade klorofyll autofluorescens (magenta). H2B-mRFP signalen i den apikala regionen observerades tydligt för både sammanslagna bilder av H2B-mRFP och autofluorescens eller ljust fält. (D,E) UBQ10pro::H2B-mClover stigma av Nicotiana benthamiana behandlades i CSA i 1 månad. Maximal intensitetsprojektion (D) och djupkodad maximal intensitetsprojektion (E) genererades från 88 z-stack-bilder med 5 μm intervall. Skalstänger: 100 μm. Bilderna togs med bredfält (A,B), konfokal (C) och två-fotonexcitation (D,E) mikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig05.jpg"> Bild 5: Fluorescerande färgfärgning är kompatibel med CS. A) CS-behandlade blad som observerats av två fotonexcitationsmikroskopi med 950 nm excitation. Cellväggen är fläckad med Calcofluor White (cyan). Kärnor är märkta med UBQ10pro::H2B-mClover (gul). Bilderna yz (B) och xz (C) är tvärsnitt på den position som indikeras av de vita streckade linjerna i (A). Skalningslist: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig06.jpg"> Figur 6: Genomskinlighet av natriumdeoxikolat. (A) Färger av olika 15% natriumdeoxikolater (listas i materialförteckning). (B) Fluorescensspektrum för varje 15% natriumdeoxikolat med 380 nm excitation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Här beskrivs en metod för att göra växtvävnader transparenta samtidigt som stabiliteten hos fluorescerande proteiner bibehålls. Denna teknik underlättar djup avbildning av rensade växt vävnader utan fysisk avsnitting.

Optisk röjning av växtvävnader för fluorescensavbildning

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Denna metod kan vara till hjälp vid hela anläggningen imaging för att avslöja intakt morfologi, utvecklingsprocesser och växt-mikrob interaktioner. Den största fördelen med denna teknik är att vi direkt kan observera insidan av en växtkropp utan att skada den. Eftersom denna metod gäller för ett brett spektrum av växtarter och vävnader kan det bidra till att påskynda upptäckten av nya fenomen inom växtbiologisk forskning.Fixering är ett kritiskt steg i den här proceduren. Före clearingsteget måste man kontrollera intensiteten av fluorescerande protein efter fixering. För att börja nedsänka växtprover i den fixativa lösningen i ett mikrorör och se till att volymen av den fixativa lösningen är mer än fem gånger provvolymen.Försegla mikroröret med en parafilm och gör hål med en nål. Placera mikroröret i en desiccator och justera långsamt graden av vakuum till cirka 690 millimeter kvicksilver så att bubblor uppträder gradvis från proverna. Stäng av vakuumpumpen efter evakuering av avsickatorn.Ventilera torkan försiktigt utan att störa proverna. Slå på vakuumpumpen igen och stäng av den efter evakuering av desiccatorn. Öppna avsickatorn försiktigt utan att stöta den fixativa lösningen i mikroröret.Ta bort den fixativa lösningen och tillsätt 1x PBS med en mikropipett. Efter lagring i en minut, byt ut den gamla PBS med ny 1x PBS. Efter att ha tagit bort PBS vid fem gånger provvolymen för clearinglösningen, försegla mikroröret med parafilm och gör hål med en nål.Placera proverna i desiccatorn. Evakuera och stäng av vakuumpumpen. Öppna avsickatorn försiktigt och stäng sedan mikroröret.Invertera mikroröret, var och en till två dagar för att påskynda clearingprocessen. För distansramen, skär ett silikongummiark med ett rakblad som justerar silikongummiplåtens tjocklek enligt provtjockleken. Placera silikonramen på ett täckglas, placera sedan de behandlade proverna i ramen och tillsätt cirka 100 mikroliter av clearinglösningen för att avlägsna eventuella bubblor.Täck med ett annat täckglas för att förhindra avdunstning av clearinglösningen. Observera proverna under ett fluorescerande mikroskop. Efter observationen returnera proverna till clearinglösning i ett mikrorör.Fasta blad av olika arter inkuberades i PBS eller ClearSee i åtta dagar, i ClearSee eller ClearSeeAlpha i två dagar. ClearSee kan rensa blad av olika arter. Efter att ha extraherat skärikulären kunde ClearSee rensa risblad.Eftersom natriumsulfitkomponenten i ClearSeeAlpha förhindrar polyfenoloxidation på grund av den reducerande effekten, kan ClearSeeAlpha rensa tobak och tirania pistiller utan någon brun pigmentering. Ubiquitin-10 promotorn H2B-mClover blad av arabidopsis thaliana behandlades med PBS eller ClearSee i tre dagar. ClearSee behandling minskade den blekgröna färgen på arabidopsis H2B-mClover blad och förbättra fluorescens intensitet av H2B-mClover jämfört med PBS inkubation.ClearSee behandlade blad observerades av två-foton excitation mikroskopi med 950 nanometer excitation. Cellväggen är fläckad med calcaflour-vit. Nuclei är märkta med ubiquitin-10 promotor, H2B-mClover.Y Z- och X Z-bilderna är tvärsnitt på den position som indikeras av de vita streckade linjerna. Förberedelse av den fixativa lösningen är viktigt för att fixa proverna. Försiktighet bör dock vidtas för att förhindra skador på proverna under vakuum.Mikroskopiska imaging kan utföras för att studera flera gen uttryck mönster och intracellulär kommunikation under växt utveckling och infektion efter denna procedur.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Plant Cell Structure and Organization

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Korrekt vård och rengöring av mikroskopet

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

Viktigaste komponenterna i ljusmikroskop

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Faskontrast och differentierad interferenskontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Född Normalisering för fluorescens Optical Projection Tomography för hela hjärtat Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescens Aktiverade cellsortering för växt Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robotics och Dynamic bildanalys för studier av genuttryck i plantvävnader

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Högtrycks Frysning och Quick Freeze Substitution av växtvävnad för transmissionselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule frekvens med fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...