Name: optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging
Uploaded: 2022-01-05T15:00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (Yenilikçi Alanlar Üzerine Bilimsel Araştırmalar için Hibe-in-Aid (JP16H06464, JP16H06280 - T.H.), Bilimsel Araştırma için Hibe-in-Aid (B, JP17H03697 - DC), Zorlu Keşif Araştırmaları için Yardım Hibesi (JP18K19331 - DC), Yenilikçi Alanlar Üzerine Bilimsel Araştırma için Hibe-in-Aid (DC için JP20H05358)) ve Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı (PRESTO programı (JPMJPR15QC to Y.M.) tarafından desteklenmiştir. JPMJPR18K4 ila D.K.)). Yazarlar, Nagoya Üniversitesi Dönüştürücü Biyo-Moleküller Enstitüsü'ndeki (WPI-ITbM) Canlı Görüntüleme Merkezi'ne, mikroskobik çalışmaları ve İngilizce dil düzenlemesi için Editage'ı (www.editage.com) destekledikleri için teşekkür eder.

1. Takas çözeltilerinin hazırlanması
<ol><li>CS çözeltisi hazırlamak için,% 10 (w / v) ksilitol,% 15 (w / v) sodyum deoksikolat ve% 25 (w / v) üre, manyetik bir karıştırıcı üzerinde damıtılmış suda çözün. NOT: Sodyum deoksikolat tozu, havada kolayca yüzdüğü için bir taslak odasında tartılmalıdır. CS, oda sıcaklığında karanlıkta 1 yıldan fazla saklanabilir.</li>
	<li>CSA çözeltisini hazırlamak için, yukarıda elde edilen CS çözeltisine sodyum sülfit (50 mM nihai konsantrasyon) ekleyin. NOT: İndirgeyici madde kolayca devre dışı bırakıldığı için kullanımdan hemen önce CS çözeltisine sodyum sülfit ekleyin.</li>
</ol>2. Fiksatif çözeltinin hazırlanması
<ol><li>40 mL sterilize edilmiş suyu konik bir tüpe aktarın ve 2 g paraformaldehit ekleyin. Çözeltinin pH'ını arttırmak için 200 μL 2 N NaOH ekleyin. Tüpü parafilm ile kapatıp kapattıktan sonra, her şey çözülene kadar ara sıra ters çevrilerek 60 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Çözeltiyi oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, pH'ı 7,4'e ayarlamak için 5 mL 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Hacmi 50 mL'ye kadar çıkarmak için sterilize edilmiş su ekleyin. NOT: Taze hazırlanmış fiksatif bir çözelti tercih edilir. Çözelti ayrıca birkaç ay boyunca -30 ° C'de saklanabilir.</li>
</ol>3. Numunelerin sabitlenmesi
<ol><li>Bitki numunelerini fiksatif çözeltiye bir mikrotüp içine daldırın (Şekil 1A), fiksatif çözeltinin hacminin numune hacminin beş katından fazla olmasını sağlayın.</li>
	<li>Mikrotüpü bir parafilm ile kapatın ve bir iğne kullanarak delikler açın. Vakumlu dekompresyon sırasında numune dökülme riski nedeniyle tüpü açık bırakmayın.</li>
	<li>Mikrotüpü bir kurutucuya yerleştirin ve vakum derecesini (~ 690 mmHg) yavaşça ayarlayın, böylece kabarcıklar numunelerden kademeli olarak ortaya çıkar (Şekil 1B-C). Kurutucuyu tahliye ettikten sonra vakum pompasını kapatın. Mikrotüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.</li>
	<li>Numunelerin rahatsız edilmesini önlemek için kurutucuyu dikkatlice havalandırın. Vakum pompasını tekrar açın ve kurutucuyu tahliye ettikten sonra kapatın. Mikrotüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. NOT: Kurutucuyu havalandırırken numunelerin zarar görmemesine özen gösterilmelidir. Fiksatif çözeltinin numunelere nüfuz etmesi, iki vakum işlemi ile arttırılır. Daha ileri vakum işlemi, fiksatif çözeltinin daha kalın numunelere nüfuz etmesine yardımcı olur.</li>
	<li>Fiksatif çözeltiyi mikrotüp içinde çarpmadan kurutucuyu dikkatlice açın. Bir mikropipet kullanarak, fiksatif çözeltiyi çıkarın ve 1x PBS ekleyin. 1 dakika sakladıktan sonra, eski PBS'yi yeni 1x PBS ile değiştirin (Şekil 1D).</li>
</ol>4. Takas
<ol><li>PBS'yi çıkardıktan sonra, temizleme çözeltisinin örnek hacminin beş katını ekleyin.</li>
	<li>Mikrotüpü parafilm ile kapatın ve bir iğne kullanarak delikler açın. Numuneleri kurutucuya yerleştirin, adım 3.3'teki gibi boşaltın ve vakum pompasını kapatın. Mikrotüpü oda sıcaklığında 60 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.</li>
	<li>Kurutucuyu yavaşça açın. Mikrotüpü parafilm ile kapatın ve floresan proteinlerin fotobeyazlatmasını önlemek için karanlıkta oda sıcaklığında saklayın. Temizleme işlemini hızlandırmak için mikrotüpü her 1-2 günde bir ters çevirin.</li>
	<li>Temizleme çözeltisi yeşile döndüğünde, çözelti renksiz kalana kadar yeni temizleme çözeltileriyle değiştirin (Şekil 1E-H).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig01.jpg"> Şekil 1: CS tedavisi için prosedür. (A) %4 PFA (Paraformaldehit) çözeltisinde Arabidopsis fidesi. (B) Numune bir kurutucuya yerleştirilir. (C) Fide vakum altında sabitlenir. (D) Fide vakum işleminden sonra PFA çözeltisine batırılır. (E) Elde edilen 3 günlük temizleme çözeltisi ile muamele edilmiş fide. Temizleme çözümünün yeşil rengine dikkat edin. (F) Takas çözeltisi tedaviden 3 gün sonra değiştirilir. (G) Elde edilen 5 günlük temizleme çözeltisi ile muamele edilmiş fide. (H) Takas çözeltisi tedaviden 5 gün sonra değiştirilir. Ölçek çubukları: 1 cm (A,C-H) ve 5 cm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
5. Kimyasal boya boyama
<ol><li>Mikrotüpe nükleer boyama için Hoechst 33342 (son konsantrasyonu 10 μg / mL) veya hücre duvarı boyama için Calcofluor White (1 mg / mL'lik son konsantrasyon) ekleyin ve 1 saat bekleyin. Boya çözeltisini çıkardıktan sonra, numuneyi 1 saat boyunca taze bir temizleme çözeltisi ile yıkayın. NOT: Gece boyunca boyama ve yıkama, dokulara floresan boya penetrasyonunu artırabilir ve arka plan floresansını azaltabilir. Temel Fuchsin9 (lignin), Auramin O9 (lignin, suberin ve cutin), Nil Red9 (suberin), Direct Yellow 969, Direct Red 239 ve SR220010,11 (hücre duvarları) gibi çeşitli floresan boyalar CS çözeltisiyle uyumludur.</li>
</ol>6. Gözlem
<ol><li>Ara parça için bir çerçeve hazırlamak için silikon kauçuk tabakayı tıraş bıçağı ile kesin (Şekil 2A). NOT: Silikon kauçuk levhanın kalınlığını numunenin kalınlığına göre ayarlayın. Takas çözeltisi ile muamele edilen numuneler yumuşak olduğundan, doğrudan kapak camı ile kaplandıklarında hasar görürler.</li>
	<li>Silikon çerçeveyi kapak camına (örneğin, 25 x 60 mm) yerleştirin (Şekil 2B). İşlem görmüş numuneleri çerçeveye yerleştirin ve çerçevedeki kabarcıkları gidermek için ~ 100 μL temizleme çözeltisi ekleyin. Temizleme çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için başka bir kapak camı (18 x 18 mm veya 24 x 24 mm) ile örtün (Şekil 2C).</li>
	<li>Örnekleri floresan mikroskop altında gözlemleyin. Gözlemden sonra, numuneleri bir mikrotüp içinde alınan temizleme çözeltisine geri koyun ve karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig02.jpg"> Şekil 2: Mikroskobik gözlem için numune hazırlama. (A) 0,2 mm kalınlığında bir silikon levhayı bir çerçeveye kesin. (B) Silikon levha çerçeveyi kapak camının üzerine yerleştirin. (C) Temizleme çözeltisi (noktalı kenarlıkla işaretlenmiş) ile işlenmiş numuneyi çerçevenin içine yerleştirin ve bir kapak camı ile örtün. Ölçek çubukları: 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<ol>
	<li>Vogelmann, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+within+the+plant.">Light within the plant.</a> Photomorphogenesis in Plants. , 491-535 (1994).</li><li>Krause, G. H., Weis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence+and+photosynthesis:+The+basics.">Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42 (1), 313-349 (1991).</li><li>Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+oxidation+in+plants:+from+biochemical+properties+to+physiological+functions.">Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions.</a> Trends in Plant Science. 12 (1), 29-36 (2007).</li><li>Lersten, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+annotated+bibliography+of+botanical+clearing+methods.">An annotated bibliography of botanical clearing methods.</a> Iowa State Journal of Science. 41 (4), 481-486 (1967).</li><li>Villani, T. S., Koroch, A. R., Simon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+clearing+and+mounting+solution+to+replace+chloral+hydrate+in+microscopic+applications.">An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications.</a> Applications in Plant Sciences. 1 (5), 1300016 (2013).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS ONE. 7 (3), 33916 (2012).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+a+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSeeAlpha:+advanced+optical+clearing+for+whole-plant+imaging.">ClearSeeAlpha: advanced optical clearing for whole-plant imaging.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).</li><li>Ursache, R., Andersen, T. G., Marhav&#253;, P., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+combining+fluorescent+proteins+with+histological+stains+for+diverse+cell+wall+components.">A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components.</a> The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).</li><li>Tofanelli, R., Vijayan, A., Scholz, S., Schneitz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+rapid+clearing+and+staining+of+fixed+Arabidopsis+ovules+for+improved+imaging+by+confocal+laser+scanning+microscopy.">Protocol for rapid clearing and staining of fixed Arabidopsis ovules for improved imaging by confocal laser scanning microscopy.</a> Plant Methods. 15 (1), 120 (2019).</li><li>Vijayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+3D+reference+atlas+reveals+cellular+growth+patterns+shaping+the+Arabidopsis+ovule.">A digital 3D reference atlas reveals cellular growth patterns shaping the Arabidopsis ovule.</a> eLife. 10, 1-38 (2021).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., George Barisas, B., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 1-20 (2013).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252, 1231-1240 (2015).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).</li><li>Warner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+clearing+technique+for+plant+tissues+allowing+deep+imaging+and+compatible+with+fluorescence+microscopy.">An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy.</a> Plant Physiology. 166 (4), 1684-1687 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+plant+organs+using+a+simple+and+rapid+transparency+technique.">Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique.</a> Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).</li><li>Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+optical+clearing+protocol+for+deep+tissue+imaging+of+fluorescent+proteins+in+Arabidopsis+thaliana.">A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana.</a> PLOS ONE. 11 (8), 0161107 (2016).</li><li>Sakamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+clearing+method+contributes+to+deep+imaging+of+plant+organs.">Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs.</a> Research Square. , (2021).</li><li>Tanaka, E., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-leaf+fluorescence+imaging+to+visualize+in+planta+fungal+structures+of+Victory+onion+leaf+rust+fungus,+Uromyces+japonicus,+and+its+taxonomic+evaluation.">Whole-leaf fluorescence imaging to visualize in planta fungal structures of Victory onion leaf rust fungus, Uromyces japonicus, and its taxonomic evaluation.</a> Mycoscience. 59 (2), 137-146 (2018).</li><li>Ohtsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+deep+imaging+of+syncytium+induced+by+the+soybean+cyst+nematode+Heterodera+glycines.">Spatiotemporal deep imaging of syncytium induced by the soybean cyst nematode Heterodera glycines.</a> Protoplasma. 254, 2107-2115 (2017).</li><li>Duman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+de-etiolation+increases+the+rooting+of+VC801+Avocado+rootstock.">Short de-etiolation increases the rooting of VC801 Avocado rootstock.</a> Plants. 9 (11), 1481 (2020).</li><li>Ho, W. W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+multi-omics+analyses+of+barley+rootzones+under+salinity+stress+reveal+two+distinctive+salt+tolerance+mechanisms.">Integrative multi-omics analyses of barley rootzones under salinity stress reveal two distinctive salt tolerance mechanisms.</a> Plant Communications. 1 (3), 100031 (2020).</li><li>Arsovski, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrphyB+is+critical+for+rapid+recovery+to+darkness+in+mature+Brassica+rapa+leaves.">BrphyB is critical for rapid recovery to darkness in mature Brassica rapa leaves.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Doll, Y., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+stomatal+development+regulation+in+Callitriche+is+related+to+the+intrageneric+diversity+in+lifestyles.">The diversity of stomatal development regulation in Callitriche is related to the intrageneric diversity in lifestyles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (14), (2021).</li><li>Eliyahu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetative+propagation+of+elite+Eucalyptus+clones+as+food+source+for+honeybees+(Apis+mellifera);+adventitious+roots+versus+callus+formation.">Vegetative propagation of elite Eucalyptus clones as food source for honeybees (Apis mellifera); adventitious roots versus callus formation.</a> Israel Journal of Plant Sciences. 67 (1-2), 83-97 (2020).</li><li>Kelliher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATRILINEAL,+a+sperm-specific+phospholipase,+triggers+maize+haploid+induction.">MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction.</a> Nature. 542, 105-109 (2017).</li><li>Aki, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+signaling+is+essential+for+organ+formation+in+Marchantia+polymorpha.">Cytokinin signaling is essential for organ formation in Marchantia polymorpha.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (8), 1842-1854 (2019).</li><li>Kinoshita, A., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+ANGUSTIFOLIA3+and+SHOOT+MERISTEMLESS,+key+genes+for+meristematic+activity+in+a+one-leaf+plant+Monophyllaea+glabra,+revealed+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Expression profiles of ANGUSTIFOLIA3 and SHOOT MERISTEMLESS, key genes for meristematic activity in a one-leaf plant Monophyllaea glabra, revealed by whole-mount in situ hybridization.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 1-11 (2020).</li><li>Okazawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+planteose+hydrolysis+during+seed+germination+of+Orobanche+minor.">Localization of planteose hydrolysis during seed germination of Orobanche minor.</a> bioRxiv. , 448768 (2021).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAPYRIN+attenuates+defence+by+repressing+PR+gene+induction+and+localized+lignin+accumulation+during+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+of+Petunia+hybrida.">VAPYRIN attenuates defence by repressing PR gene induction and localized lignin accumulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis of Petunia hybrida.</a> New Phytologist. 229 (6), 3481-3496 (2021).</li><li>Chu, T. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+markers+highlight+intracellular+dynamics+of+membrane+proteins+in+response+to+abiotic+treatments+in+rice.">Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice.</a> Rice. 11, 23 (2018).</li><li>Alaguero-Cordovilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin-mediated+regulatory+framework+for+wound-induced+adventitious+root+formation+in+tomato+shoot+explants.">An auxin-mediated regulatory framework for wound-induced adventitious root formation in tomato shoot explants.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 44 (5), 1642-1662 (2021).</li><li>Okuda, A., Matsusaki, M., Masuda, T., Urade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+GmPDIL7,+a+soybean+ER+membrane-bound+protein+disulfide+isomerase+family+protein.">Identification and characterization of GmPDIL7, a soybean ER membrane-bound protein disulfide isomerase family protein.</a> The FEBS Journal. 284 (3), 414-428 (2017).</li><li>Kim, D. -. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutualistic+interaction+between+Streptomyces+bacteria,+strawberry+plants+and+pollinating+bees.">A mutualistic interaction between Streptomyces bacteria, strawberry plants and pollinating bees.</a> Nature Communications. 10 (1), 4802 (2019).</li><li>Wu, J., Mock, H. -. P., Giehl, R. F. H., Pitann, B., M&#252;hling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+decreases+cadmium+concentrations+by+modulating+root+endodermal+suberin+development+in+wheat+plants.">Silicon decreases cadmium concentrations by modulating root endodermal suberin development in wheat plants.</a> Journal of Hazardous Materials. 364, 581-590 (2019).</li><li>Isoda, M., Oyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+duckweed+species,+Wolffiella+hyalina,+for+whole-plant+observation+of+physiological+behavior+at+the+single-cell+level.">Use of a duckweed species, Wolffiella hyalina, for whole-plant observation of physiological behavior at the single-cell level.</a> Plant Biotechnology. 35 (4), 387-391 (2018).</li><li>Ben-Targem, M., Ripper, D., Bayer, M., Ragni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+and+gibberellin+signaling+cross-talk+promotes+hypocotyl+xylem+expansion+and+cambium+homeostasis.">Auxin and gibberellin signaling cross-talk promotes hypocotyl xylem expansion and cambium homeostasis.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (10), 3647-3660 (2021).</li><li>Shwartz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VIL+gene+CRAWLING+ELEPHANT+controls+maturation+and+differentiation+in+tomato+via+polycomb+silencing.">The VIL gene CRAWLING ELEPHANT controls maturation and differentiation in tomato via polycomb silencing.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Levin, K. A., Tucker, M. R., Strock, C. F., Lynch, J. P., Mather, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+reveals+that+positions+of+cyst+nematode+feeding+sites+relative+to+xylem+vessels+differ+between+susceptible+and+resistant+wheat.">Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat.</a> Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).</li><li>Nouri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+suppression+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+involves+gibberellic+acid+signaling.">Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).</li><li>Evangelisti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+enables+the+identification+and+quantification+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi+in+plant+roots.">Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots.</a> bioRxiv. , 434067 (2021).</li></ol>

ClearSee ticarileştirildi (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Japonya). Nagoya Üniversitesi, takas reaktifi ClearSee üzerinde bir patente (JP6601842) sahiptir. D. Kurihara patent mucididir. Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Bu yöntem sabitleme, yıkama ve temizlemeden oluşur. Fiksasyon, bu protokolde kritik bir adımdır. PFA fiksasyonundan sonra floresan protein gözlenmezse, temizleme çözeltisi ile işlemden sonra gözlenmeyecektir. PFA çözeltisinin dokulara nüfuz etmesi kritiktir, ancak hücre yapısını tahrip edebileceğinden yüksek vakum tedavisi önerilmez. Vakum koşulları ve fiksasyon süreleri, her doku ve tür türü için optimize edilmelidir. Fiksasyondan sonra bile floresan proteinlerinin kontrol edilmesi önerilir. Numuneler genellikle oda sıcaklığında 30-60 dakika sabitlenmiş olsa da, 4 ° C'de daha uzun süre (gece veya daha fazla) sabitlenebilirler.
Şekil 6A'da gösterildiği gibi, bazı sodyum deoksikolatlar çözündüğünde soluk sarı bir renge sahipti. Bu tür sodyum deoksikolat çözeltileri, 380 nm'de uyarıldıktan sonra 400-600 nm bölgesinde güçlü otofloresan göstermiştir (Şekil 6B). Bu otofloresan, optik temizlemeyi ve floresan görüntülemeyi önler. Kullanıcılar sodyum deoksikolat çözeltisinin rengini kontrol etmelidir, çünkü reaktifin kalitesi saflık, lot-lot varyasyonu veya diğer nedenlerden dolayı farklılık gösterebilir.
Burada kullanılan temizleme çözeltileri, membran yapısını tahrip edebilecek yüksek konsantrasyonlarda sodyum deoksikolata sahiptir. Plazma membran belirteci (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) CS tedavisinden sonra bile gözlendi7. Bununla birlikte, ilgilenilen yapıya ve dokuya bağlı olarak sodyum deoksikolat konsantrasyonunu azaltmak daha iyi olabilir. Gerçekten de, sodyum deoksikolat konsantrasyonunun yarı yarıya azaldığı modifiye CS'li Arabidopsis pistilleri için daha net görüntüler elde edildi; Bununla birlikte, sodyum deoksikolat konsantrasyonlarının azalması uzun tedavi süreleri gerektiriyordu (örneğin, Arabidopsis pistilleri için 1 ay).
CS, işlenmiş numunelerde klorofili gidermek için kırmızı otofloresanı (>610 nm) azaltabilir. Bununla birlikte, CS ile işlenmiş numunelerde bile 500-600 nm aralığında otofloresan (sarıdan turuncuya) kalmıştır7. Bu otofloresanın hücre duvarından ve lignin12,13 gibi diğer hücresel bileşenlerden türetildiği düşünülmektedir. Bu nedenle, gelişmiş ikincil duvarlara sahip saplar gibi dokuların CS tedavisi ile tamamen şeffaf hale getirilmesi zordur.
Burada kullanılanların yanı sıra floresan mikroskopi kullanılarak bitkilerde floresan proteinleri gözlemlemek için çeşitli temizleme reaktifleri geliştirilmiştir14,15,16,17. Bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, CS ve CSA klorofili uzaklaştırır ve otofloresansı azaltarak bitki dokularını daha şeffaf hale getirir. Son zamanlarda, Sakamoto ve ark. fiksasyon, deterjan temizleme ve kırılma indisi uyumsuzluğunu ayarlamak için montaj için geliştirilmiş bir yöntem olan iTOMEI'yi geliştirdiler18. Arabidopsis fidelerinde, iTOMEI dokuyu 26 saat içinde temizledi.
CS, Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, arpa22, Brassica rapa23, Callitriche gibi çok çeşitli bitki türlerine uygulanabilir. 24, Eucalyptus25, mısır26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, pirinç31, Solanum lycopersicum32, soya fasulyesi33, çilek34, buğday35 ve Wolffiella hyalina36. Daha kalın dokular için, CS ayrıca vibratom bölümlerini saydam hale getirebilir37,38. Bu yöntem, bitkilerdeki hücresel yapı ve gen ekspresyon paternlerinin incelenmesine izin verdi37,38. Ayrıca, CS ile tedavi edilen dokuların derinliklerinde nematod enfeksiyonları20,39, mantar enfeksiyonları ve simbiyoz19,40,41 de gözlenmiştir. Bu nedenle, bu yöntem mikrodan makro ölçeklere kadar tüm doku görüntüleme için yararlıdır ve çeşitli hücreler, dokular, organlar ve organizmalar arasındaki yeni etkileşimlerin keşfedilmesine yardımcı olabilir.

Canlı organizmalarda hücresel yapıların görselleştirilmesi ve proteinlerin lokalizasyonu, fonksiyonlarının in vivo olarak açıklığa kavuşturulması açısından önemlidir. Bununla birlikte, canlı vücudu şeffaf olmadığından, canlı organizmaların iç yapısını diseksiyon olmadan gözlemlemek zordur. Özellikle farklı şekillerdeki hücrelerle çok katmanlı olan bitki dokularında, yapılarından ve ışık emici pigmentlerin varlığından kaynaklanan indeks uyumsuzluğu sorunludur. Örneğin, bitki yaprakları, fotosentez için vücutlarına giren ışığı verimli bir şekilde kullanmalarını sağlayan karmaşık bir yapıya sahiptir1, oysa yapı aynı zamanda kırılma indisi uyumsuzluğuna neden olur ve bu da onları gözlemlemeyi zorlaştırır. Bununla birlikte, yapraklar klorofil gibi güçlü kırmızı floresan yayan birçok ışık emici pigmente sahiptir ve oksidasyonla kahverengimsi pigmentler üretilir2,3. Bu pigmentler ayrıca bitkilerde tam montajlı floresan mikroskopi gözlemlerini de engeller. Bu nedenle, bitkilerin iç yapısını gözlemlemek için, alkol ile renk giderme ve sabitleme ve kloral hidrat kullanarak temizleme, kırılma indisi uyumsuzluğunu ve otofloresansı ortadan kaldırmak için uzun süredir kullanılmaktadır4,5. Bu geleneksel yöntemler uzun yıllardır benimsenmiştir, ancak floresan proteinlerinin floresansını aynı anda ortadan kaldırma dezavantajına sahiptir6,7. Floresan proteinler mevcut floresan görüntülemede vazgeçilmez hale geldiği için bu sorunludur.
Bu nedenle, ClearSee (CS) ve ClearSeeAlpha (CSA), bitki dokuları için optik temizleme reaktifleri olarak geliştirilmiştir. Her iki reaktif de floresan proteinlerinin stabilitesini korurken klorofil otofloresansını azaltır7,8. CSA, doku oksidasyonu nedeniyle kahverengi pigmentler üretildiğinde özellikle yararlıdır. Bu temizleme reaktiflerini kullanarak, fiziksel kesitleme olmadan bitki gövdesi içindeki hücresel yapıyı ve protein lokalizasyonunu gözlemlemek mümkündür.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcofluor White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearSee</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18&#215;18 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24&#215;24 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C024241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (25&#215;60 No.1)</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>C025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>AS One</td>
			<td>1-5801-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>346-07951</td>
			<td>1 mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS One</td>
			<td>6-9085-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>C0316</td>
			<td>Figure 6_1; Lot PSGYK-QB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Kishida Chemical</td>
			<td>260-71412</td>
			<td>Figure 6_2; Lot C05543H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Figure 6_3; Lot SLBS7362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td>Figure 6_4; Lot BCBW0612</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>10712-96</td>
			<td>Figure 6_5; Lot M5R3403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>194-08311</td>
			<td>Figure 6_6; Lot LKL0648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-03411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>211-01213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>BUCHI</td>
			<td>V-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylitol</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>248-00545</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging

Çok katmanlı ve opak bitki örneklerinin iç yapısını, diseksiyon olmadan, mikroskop altında doğrudan gözlemlemek zordur. Ek olarak, klorofil'e atfedilen otofloresan, bitkilerde floresan proteinlerinin gözlemlenmesini engeller. Uzun süredir, bitkileri şeffaf hale getirmek için çeşitli temizleme reaktifleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, geleneksel temizleme reaktifleri floresan sinyallerini azaltır; bu nedenle floresan proteinlerle hücresel ve hücre içi yapıları gözlemlemek mümkün olmamıştır. Floresan protein stabilitesini korurken klorofil gidererek bitki dokularını temizleyebilen reaktifler geliştirilmiştir. Burada, temizleme reaktifleri, ClearSee (CS) veya ClearSeeAlpha (CSA) kullanılarak bitki dokularının optik olarak temizlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Temizlenmiş bitki dokularının hazırlanması üç adımdan oluşur: fiksasyon, yıkama ve temizleme. Fiksasyon, floresan proteinlerin hücresel yapılarını ve hücre içi stabilitesini korumada çok önemli bir adımdır. Temizleme için kuluçka süresi doku tipine ve türüne bağlıdır. Arabidopsis thaliana'da, CS ile temizlik için gereken süre yapraklar ve kökler için 4 gün, fideler için 7 gün ve pistiller için 1 aydı. CS ayrıca Physcomitrium patens'in gametofitik yapraklarını şeffaf hale getirmek için nispeten kısa bir süre 4 gün gerektirdi. Buna karşılık, tütün ve toreniadaki pistiller, CS tedavisi sırasında oksidasyona bağlı olarak kahverengi pigment üretti. CSA, oksidasyonu önleyerek kahverengi pigmenti azalttı ve nispeten uzun bir süre (1 veya 2 ay) sürmesine rağmen, tütün ve torenia pistillerini şeffaf hale getirebilir. CS ve CSA, DNA için DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) ve Hoechst 33342 ve hücre duvarı için Calcofluor White, SR2200 ve Direct Red 23 gibi kimyasal boyalar kullanılarak boyama ile de uyumluydu. Bu yöntem, bozulmamış morfolojiyi, gelişimsel süreçleri, bitki-mikrop etkileşimlerini ve nematod enfeksiyonlarını ortaya çıkarmak için tüm bitki görüntülemesi için yararlı olabilir.

CS çeşitli türlerin yapraklarını temizleyebilir (Şekil 3A-H). CS çözeltisinin bir pirinç yaprağına nüfuz etmesi zordur, çünkü yaprak yüzeyi bu bitkide kütiküler balmumu ile kaplıdır. Bununla birlikte, kütiküler balmumunu 10 s boyunca kloroforma batırarak çıkardıktan sonra, CS pirinç yapraklarını temizleyebilir (Şekil 3H). Bununla birlikte, CS, CS'ye daha az geçirgen olan Chamaecyparis obtusa yapraklarına nüfuz edememiştir (Şekil 3I, J). Krizantem yapraklarında, CS ile muamele edilmiş yapraklarda polifenol oksidasyonun neden olduğu kahverengi pigmentasyon gözlenmiştir (Şekil 3K, L). Benzer şekilde, Tütün ve torenia pistilleri CS tedavisi sırasında kahverengi pigmentasyon gösterdi (Şekil 3M, O). CSA'daki sodyum sülfit bileşeni, indirgeyici etki nedeniyle polifenol oksidasyonunu önlediğinden, CSA tütün ve torenia tabancalarını kahverengi pigmentasyon olmadan temizleyebilir (Şekil 3N, P).
Şekil 4B, CS tedavisinin Arabidopsis H2B-mClover yaprağının soluk yeşil rengini (parlak alan) azalttığını ve PBS inkübasyonuna kıyasla H2B-mClover'ın floresan yoğunluğunu arttırdığını göstermektedir (Şekil 4A). Çiçekli bitkilere ek olarak, CS yosun bitkilerine de uygulanabilir (Şekil 4C); 4 günlük CS tedavisinden sonra, H2B-mRFP'nin floresansı, azaltılmış klorofil otofloresansı ile tüm gametofor için açıkça tespit edildi. Şekil 4D, E, CSA kullanılarak temizlenen Nicotiana benthamiana'daki H2B-mClover pistilinin 3D rekonstrüksiyon görüntülerini göstermektedir. Numune derinliği 440 μm idi. Derinlik kodlu maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsünün gösterdiği gibi, CSA, tütün pistilleri gibi zorlu dokuların derin görüntülenmesini sağlar.
CS ve CSA, floresan boya boyama ile de uyumluydu. Şekil 5 , CS'nin floresan proteini (H2B-mClover) ve organik floresan boya boyamasını (Calcofluor White) gözlemlemek için aynı anda kullanılabileceğini göstermektedir. Z-stack görüntülerinden 3D rekonstrüksiyondan sonra, herhangi bir bölüm gözlemlenebilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig03.jpg"> Şekil 3: Yaprakların ve pistillerin temizleme çözeltileri kullanılarak optik olarak temizlenmesi. (A-L) Çeşitli türlerin sabit yaprakları 8 gün boyunca PBS (A, C, E, G, I, K) veya CS (B, D, F, H, J, L) ve 2 gün boyunca CS (M, O) veya CSA (N, P) cinsinden inkübe edildi. (A,B,O,P) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) Chrysanthemum morifolium, (M,N) Nicotiana benthamiana. Ölçek çubukları: 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig04.jpg"> Şekil 4: Temizleme solüsyonları ile tedavi edilen dokuların floresan görüntülemesi. (A,B) UBQ10pro::Arabidopsis thaliana'nın H2B-mClover yaprakları 3 gün boyunca PBS (A) veya CS (B) ile tedavi edildi. (C) Physcomitrium patens'in H2B-mRFP yapraklı gametoforları 4 gün boyunca CS ile tedavi edildi. Çekirdekler H2B-mRFP (yeşil) ile etiketlendi. CS tedavisi klorofil otofloresansını (macenta) azaltmıştır. Apikal bölgedeki H2B-mRFP sinyali, hem H2B-mRFP'nin birleştirilmiş görüntüleri hem de otofloresan veya parlak alan için açıkça gözlendi. (D,E) Nicotiana benthamiana'nın UBQ10pro::H2B-mClover damgası CSA'da 1 ay boyunca tedavi edildi. Maksimum yoğunluklu projeksiyon (D) ve derinlik kodlu maksimum yoğunluklu projeksiyon (E), 5 μm aralıklarla 88 z-yığın görüntüden oluşturulmuştur. Ölçek çubukları: 100 μm. Görüntüler geniş alan (A,B), konfokal (C) ve iki foton uyarma (D,E) mikroskopisi kullanılarak alındı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig05.jpg"> Şekil 5: Floresan boya boyama CS ile uyumludur. (A) 950 nm uyarma ile iki foton uyarma mikroskobu ile gözlenen CS ile işlenmiş yapraklar. Hücre duvarı Calcofluor White (camgöbeği) ile boyanır. Çekirdekler UBQ10pro::H2B-mClover (sarı) ile etiketlenmiştir. yz (B) ve xz (C) görüntüleri, (A) içindeki beyaz kesikli çizgilerle gösterilen konumda kesitlerdir. Ölçek çubuğu: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig06.jpg"> Şekil 6: Sodyum deoksikolatın şeffaflığı. (A) Çeşitli% 15 sodyum deoksikolatların renkleri ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir). (B) 380 nm uyarma ile her %15 sodyum deoksikolatın floresan spektrumu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Burada, floresan proteinlerinin stabilitesini korurken bitki dokularını şeffaf hale getirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, temizlenmiş bitki dokularının fiziksel kesitleme olmadan derin görüntülenmesini kolaylaştırır.

Floresan Görüntüleme için Bitki Dokularının Optik Temizlenmesi

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Bu yöntem, bozulmamış morfolojiyi, gelişimsel süreçleri ve bitki-mikrop etkileşimlerini ortaya çıkarmak için tüm bitki görüntülemede yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir bitki gövdesinin içini zarar vermeden doğrudan gözlemleyebilmemizdir. Bu yöntem çok çeşitli bitki türleri ve dokuları için geçerli olduğundan, bitki biyolojik araştırmalarında yeni olayların keşfini hızlandırmaya yardımcı olabilir.Fiksasyon bu yordamda kritik bir adımdır. Temizleme adımından önce, fiksasyondan sonra floresan proteinin yoğunluğunu kontrol etmek gerekir. Bitki numunelerini fiksatif çözeltiye bir mikro tüp içinde daldırmaya başlamak ve fiksatif çözeltinin hacminin numune hacminin beş katından fazla olduğundan emin olmak.Mikro tüpü bir parafilm ile kapatın ve bir iğne kullanarak delikler açın. Mikro tüpü bir kurutucuya yerleştirin ve vakum derecesini yavaşça yaklaşık 690 milimetre cıvaya ayarlayın, böylece kabarcıklar numunelerden yavaş yavaş ortaya çıkar. Kurutucuyu tahliye ettikten sonra vakum pompasını kapatın.Numuneleri rahatsız etmeden kurutucuyu dikkatlice havalandırın. Vakum pompasını tekrar açın ve kurutucuyu tahliye ettikten sonra kapatın. Fiksatif çözeltiyi mikrotüp içinde çarpmadan kurutucuyu dikkatlice açın.Fiksatif çözeltiyi çıkarın ve mikro pipetle 1x PBS ekleyin. Bir dakika sakladıktan sonra, eski PBS'yi yeni 1x PBS ile değiştirin. PBS'yi temizleme çözeltisinin numune hacminin beş katından çıkardıktan sonra, mikro tüpü parafilm ile kapatın ve bir iğne ile delikler açın.Örnekleri kurutucuya yerleştirin. Vakum pompasını boşaltın ve kapatın. Kurutucuyu yavaşça açın, ardından mikrotüpü kapatın.Temizleme işlemini hızlandırmak için mikro tüpü her bir ila iki günde bir ters çevirin. Ara parça çerçevesi için, silikon kauçuk levha kalınlığını numune kalınlığına göre ayarlayan bir jilet bıçağı ile bir silikon kauçuk levha kesin. Silikon çerçeveyi bir kapak camına yerleştirin, ardından işlenmiş numuneleri çerçevenin içine yerleştirin ve kabarcıkları gidermek için yaklaşık 100 mikrolitre temizleme çözeltisi ekleyin.Temizleme çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için başka bir kapak camı ile örtün. Örnekleri floresan mikroskop altında gözlemleyin. Gözlemden sonra numuneleri bir mikrotüp içindeki temizleme çözeltisine geri döndürün.Çeşitli türlerin sabit yaprakları PBS veya ClearSee'de sekiz gün, ClearSee veya ClearSeeAlpha'da iki gün boyunca inkübe edildi. ClearSee çeşitli türlerin yapraklarını temizleyebilir. Kütiküler çıkarıldıktan sonra, ClearSee pirinç yapraklarını temizleyebilir.ClearSeeAlpha'daki sodyum sülfit bileşeni, indirgeyici etki nedeniyle polifenol oksidasyonunu önlediğinden, ClearSeeAlpha herhangi bir kahverengi pigmentasyon olmadan tütün ve tirania tabancalarını temizleyebilir. Arabidopsis thaliana'nın Ubiquitin-10 promotörü H2B-mClover yaprakları üç gün boyunca PBS veya ClearSee ile tedavi edildi. ClearSee tedavisi, arabidopsis H2B-mClover yaprağının soluk yeşil rengini azalttı ve PBS inkübasyonuna kıyasla H2B-mClover'ın floresan yoğunluğunu arttırdı.ClearSee ile tedavi edilen yapraklar, 950 nanometre uyarma ile iki foton uyarma mikroskobu ile gözlendi. Hücre duvarı kalsaun beyazı ile boyanır. Çekirdekler ubikitin-10 promotörü, H2B-mClover ile etiketlenmiştir.Y Z ve X Z görüntüleri, beyaz kesikli çizgilerle gösterilen konumda kesitlerdir. Fiksatif çözeltinin hazırlanması, numuneleri sabitlemek için önemlidir. Bununla birlikte, vakum altındaki numunelerin zarar görmesini önlemek için özen gösterilmelidir.Bu prosedürü takiben bitki gelişimi ve enfeksiyonu sırasında çoklu gen ekspresyon paternlerini ve hücre içi iletişimi incelemek için mikroskobik görüntüleme yapılabilir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Plant Cell Structure and Organization

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Tüm Kalp Görüntüleme Floresan Optik Projeksiyon Tomografi tarihi Normalizasyon

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...