Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

نشكر المعهد الوطني للمترولوجيا والجودة والتكنولوجيا (INMETRO ، RJ ، البرازيل) على استخدام مرافقه. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو لدعم البحوث في ولاية ريو دي جانيرو (Faperj) (قانون التمويل: E26/202.682/2018 و E-26/010.001771/2019 ، والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) (رمز التمويل: 307460/2019-3) ، ومكتب البحوث البحرية (ONR) (رمز التمويل: N62909-21-1-2091). تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المركز الوطني للعلوم والتكنولوجيا حول الطب التجديدي - INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

تم عزل ASCs المستخدمة في هذه الدراسة سابقا عن المتبرعين البشريين الأصحاء وحفظها بالتجميد كما هو موضح في14 وفقا للجنة أخلاقيات البحث في مستشفى جامعة كليمنتينو فراغا فيلهو ، الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو ، البرازيل (25818719.4.0000.5257). انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل ح...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

تعرض هذه الورقة الجيل الواسع النطاق من الكرويات ASC باستخدام نظام ماصة آلي. الخطوة الحاسمة للبروتوكول هي إعداد البرنامج بدقة لضمان الحجم الصحيح لتعليق الخلايا وسرعتها ومسافة السحب عليها. تم تحديد المعلمات الموصوفة في البروتوكول بعد عدد من التجارب لتحسين توزيع تعليق خلية ASC في آبار ألواح 12 ...

تعتبر الكرويات نهجا خاليا من السقالات في هندسة الأنسجة. ASCs قادرة على تشكيل كرويات من خلال عملية التجميع الذاتي. تزيد البنية الدقيقة ثلاثية الأبعاد للكروية من الإمكانات التجديدية ل ASCs ، بما في ذلك قدرة التمايز إلى سلالات متعددة1،2،3. تعمل هذه المجموعة البحثية مع كرويات ASC لهندسة الغضاريف والأنسجة العظمية4،5،6. الأهم من ذلك ، تعتبر الكرويات لبنات بناء في التصنيع الحيوي للأنسجة والأعضاء ، ويرجع ذلك أساسا إلى قدرتها على الاندماج.
يعتمد استخدام الكرويات لتشكيل الأنسجة على ثلاث نقاط رئيسية: (1) تطوير طرق روبوتية موحدة وقابلة للتطوير لتصنيعها الحيوي7 ، (2) التنميط الظاهري المنهجي للكرويات النسيجية8 ، (3) تطوير طرق لتجميع الأنسجة ثلاثية الأبعاد9. يمكن تشكيل هذه الكرويات بأنواع مختلفة من الخلايا والحصول عليها من خلال طرق مختلفة ، بما في ذلك السقوط المعلق ، وإعادة التجميع ، والموائع الدقيقة ، والقوالب الدقيقة8،9،10. كل من هذه الطرق لها مزايا وعيوب تتعلق بتجانس حجم وشكل الكرويات ، واستعادة الكرويات بعد التكوين ، وعدد الكرويات المنتجة ، وأتمتة العمليات ، وكثافة العمالة ، والتكاليف11.
في طريقة micromold ، يتم توزيع الخلايا وإيداعها في الجزء السفلي من micromold بسبب الجاذبية. لا يسمح الهيدروجيل غير اللاصق للخلايا بالالتصاق بالقاع ، وتؤدي التفاعلات بين الخلايا إلى تكوين كروي واحد لكل ركود 8,12. تولد طريقة التصنيع الحيوي هذه كرويات ذات حجم متجانس ومضبوط ، ويمكن استخدامها آليا للإنتاج على نطاق واسع بطريقة فعالة من حيث الوقت بأقل جهد ممكن ، ولها عوامل جيدة من حيث الفعالية من حيث التكلفة في تصميم التصنيع الحيوي للأنسجة الكروية 7,8. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتشكيل كرويات من أي سلالة خلوية لإعداد نوع جديد من الأنسجة بخصائص يمكن التنبؤ بها ومثالية ويمكن التحكم فيها8.
يعرف التصنيع الحيوي بأنه "التوليد الآلي للمنتجات الوظيفية بيولوجيا مع التنظيم الهيكلي ..."13. لذلك ، يعتبر الإنتاج الآلي للكرويات الخطوة الإلزامية الأولى لتطوير خط التصنيع الحيوي ، والذي يستمر في عملية الطباعة الحيوية 3D وينتهي في النضج الكامل للأنسجة المطبوعة بيولوجيا عن طريق الانصهار الكروي. في هذه الدراسة ، لتحسين قابلية التوسع في التصنيع الحيوي الكروي ASC ، نستخدم نظام سحب آلي لزرع تعليق الخلية ، وبالتالي ضمان تجانس حجم وشكل كروي. تظهر هذه الورقة أنه كان من الممكن إنتاج عدد كبير (الآلاف) من الكرويات اللازمة لنهج الطباعة الحيوية 3D للتصنيع الحيوي لنماذج الأنسجة الأكثر تعقيدا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

الخلايا اللحمية / الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا الموجودة في الجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البشرية تحت الجلد المعترف بها كمصدر كلاسيكي للخلايا اللحمية / الجذعية الوسيطة. تم نشر العديد من الدراسات مع ASCs لنهج هندسة الأنسجة القائمة على السقالات ، والتي استكشفت بشكل رئيسي سلوك هذه الخلايا بعد بذرها على السقالات النشطة بيولوجيا. ومع ذلك ، تظهر مناهج خالية من السقالات لهندسة الأنسجة في المختبر وفي الجسم الحي ، وذلك أساسا باستخدام الكرويات ، للتغلب على قيود النهج القائمة على السقالات.
الكروية هي الأنسجة الدقيقة 3D التي شكلتها عملية التجميع الذاتي. يمكنهم محاكاة البنية والبيئة الدقيقة للأنسجة الأصلية بشكل أفضل ، ويرجع ذلك أساسا إلى تكبير تفاعلات المصفوفة من خلية إلى خلية ومن خلية إلى خارج الخلية. في الآونة الأخيرة ، يتم استكشاف الكرويات بشكل رئيسي كنماذج للأمراض ، ودراسات فحص الأدوية ، ولبنات البناء للطباعة الحيوية 3D. ومع ذلك ، بالنسبة لنهج الطباعة الحيوية 3D ، فإن العديد من الكرويات ، المتجانسة في الحجم والشكل ، ضرورية للتصنيع الحيوي لنماذج الأنسجة والأعضاء المعقدة. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم إنتاج الكرويات تلقائيا ، هناك فرصة ضئيلة للتلوث الميكروبيولوجي ، مما يزيد من قابلية تكرار الطريقة.
يعتبر الإنتاج الواسع النطاق للكرويات الخطوة الإلزامية الأولى لتطوير خط التصنيع الحيوي ، والذي يستمر في عملية الطباعة الحيوية 3D وينتهي في النضج الكامل لبناء الأنسجة في المفاعلات الحيوية. ومع ذلك ، فإن عدد الدراسات التي استكشفت إنتاج ASC الكروي على نطاق واسع لا يزال نادرا ، إلى جانب عدد الدراسات التي استخدمت كرويات ASC ككتل بناء للطباعة الحيوية 3D. لذلك ، تهدف هذه المقالة إلى إظهار الإنتاج الواسع النطاق للكرويات ASC باستخدام تقنية هيدروجيل غير لاصقة micromolded تنشر كرويات ASC ككتل بناء لأساليب الطباعة الحيوية 3D.

يمكن لنظام الماصة الأوتوماتيكي زرع تعليق خلية ASC في 12 بئرا من لوحة واحدة من 12 بئرا في 15 دقيقة. باستخدام 81 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، سينتج 972 كرويا في نهاية البروتوكول. باستخدام 256 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، سينتج 3072 كرويا في نهاية البروتوكول. تم تحليل الكرويات ASC للتأك?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

هنا ، نصف الإنتاج على نطاق واسع من الكرويات اللحمية / الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASC) باستخدام نظام سحب آلي لزرع تعليق الخلية ، وبالتالي ضمان تجانس حجم وشكل الكروية. يمكن استخدام هذه الكروية ASC ككتل بناء لنهج الطباعة الحيوية 3D.

الإنتاج الآلي على نطاق واسع من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون كروية للطباعة الحيوية 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

تعتمد أهمية البروتوكول على الحد من الأخطاء البشرية وتلوث علم الأحياء الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، مسؤولة عن إنتاج الآلاف من الكرويات لنهج الطباعة الحيوية 3D. الميزة الرئيسية لهذه المسألة ، على الرغم من ذلك ، هي أنها حسنت ساعات العمل.تعتبر معلمات البرنامج حاسمة لأنها يمكن أن تؤثر على الجودة النهائية للكرويات. وأفضل نصيحة هي إجراء الاختبارات فقط باستخدام وسائط زراعة الخلايا. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنها طريقة تقليدية قديمة لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد تعتمد على Begin عن طريق حصاد تعليق الخلايا الجذعية باستخدام ماصة مصلية 10 ملليلتر ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر.ثم ، جهاز طرد مركزي في 400 RCF لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه ASC. أعد تعليق حبيبات الخلايا باستخدام DMEM-Low الذي يحتوي على 10٪ FBS. بعد إجراء تعداد الخلايا ، خذ ASCs في أنابيب طرد مركزي منفصلة 15 ملليلتر لزرع 81 و 256 حالة ركود ميكرومصبوب بهيدروجيل غير ملتصق.ارجع إلى مخطوطة النص للحصول على تفاصيل حول عدد الخلايا المستخدمة. أضف 500 ميكرولتر من محلول الأغاروز المعقم 2٪ فائق النقاء في وسط قالب سيليكون يحتوي على 81 أو 256 استراحة دائرية. بعد 40 دقيقة ، قم بفك قالب الأغاروز النقي للغاية من قالب السيليكون وضعه في بئر من لوحة بلاستيكية من 12 بئرا.أضف ملليلترين من DMEM-Low في البئر مع الأغاروز المصبوب الدقيق واحتضنه عند 37 درجة مئوية مع إمدادات ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي بنسبة 5٪ لمدة 12 ساعة على الأقل قبل بذر ASCs. تأكد من أن التدفق الرقائقي قيد التشغيل وأن تدفق الهواء في الخزانة يعمل بشكل صحيح. تأكد من توصيل الجهاز بالجهد الصحيح وأن الجهاز اللوحي متصل بالمعدات.تحقق مما إذا كان ارتفاع زجاج حماية الخزانة في نفس مستوى وضع علامة المستشعر على المعدات. اضغط على زر التشغيل أو الإيقاف الموجود على الجانب الأيسر من الجهاز. ثم انتظر حتى يبدأ الجهاز اللوحي والمعدات.ضع صناديق الأطراف ، ورف أنابيب الطرد المركزي ، واللوحة التي تحتوي على هيدروجيل الأغاروز المصبوب في مساحة عمل المعدات. في البرنامج المفتوح في الجهاز اللوحي، انقر فوق محرر LabWare. قم بإعداد طاولة عمل افتراضية واختر مواضع الماصات وصناديق الأطراف والحامل للأنابيب البلاستيكية والألواح.انقر فوق الزر "التبديل إلى الإجراء" لتضمين جميع المعلمات والأوامر التي نفذتها المعدات طوال التجربة. انتظر حتى يتم فتح شريط أدوات وقائمة إجراءات في البرنامج. في البداية ، للإشارة إلى الأوامر ، قم بدمج عدد العينات التي سيتم ماصها واسحبها إلى قائمة الإجراءات.ثم انقر فوق زر الأمر "نقل الكاشف" على البرنامج لنقل تعليق ASC إلى آبار لوحة 12 بئرا التي تحتوي على القوالب الدقيقة وسحبها إلى قائمة الإجراءات. انقر فوق خصائص"لإعداد مواضع البداية والنهاية" للمعدات لنقل العينة. انتظر حتى يعود البرنامج إلى صفحة جدول العمل.قم بإعداد معلمات البذر الآلي ل ASCs كما هو موضح في مخطوطة النص. حدد الماء كنوع السائل القياسي. انقر فوق الزر "خيارات" لإعداد المعلمات لإنشاء تعليق متجانس ل ASCs كما هو موضح في مخطوطة النص.انقر فوق الزر مع رمز التحقق "في الشريط العلوي من البرنامج لضمان عدم وجود خطأ في البرمجة. انقر فوق الزر "تشغيل" في الشريط العلوي من البرنامج لبدء تشغيل البرنامج. دع المعدات تبدأ كما هو مبرمج.وانتظر حتى يصدر صوتا يشير إلى أنه قد انتهى. اجمع الصفيحة المكونة من 12 بئرا ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية مع إمدادات ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي بنسبة 5٪ لمدة 18 ساعة على الأقل ، للسماح بتكوين كرويات كاملة ومدمجة. حصاد الكرويات يدويا بعد يوم واحد وثلاثة وسبعة أيام من الثقافة للتحليل.اغسل الوسط بماصة صغيرة لإطلاق الكرويات من هيدروجيل الأغاروز غير الملتصق بالقوالب الدقيقة. جمع الكروية يدويا باستخدام ماصة صغيرة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. تم قياس ما مجموعه 85 و 160 كروية من الهلاميات المائية غير اللاصقة ذات القوالب الدقيقة مع 81 و 256 حالة ركود دائرية ، على التوالي.قام نظام الماصة الأوتوماتيكي بزرع تعليق خلية ASC في 12 بئرا من صفيحة واحدة من 12 بئرا في 15 دقيقة. باستخدام 81 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، أنتجت 972 كروية في هذه الدراسة. في حين أن 256 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، أنتجت 3072 كروية.تم تحليل الكرويات ASC للتأكد من تجانس حجمها وشكلها. أظهرت المنشطات ASC من القوالب الدقيقة مع 81 حالة ركود قطرا متجانسا خلال فترة الثقافة. على النقيض من المنشطات ASC من القوالب الدقيقة مع 256 حالة ركود ، كانت نسبة الأقطار الأصغر والأكبر قريبة من واحدة في الكرويات ASC من القوالب الدقيقة مع 81 و 256 حالة ركود.وقدمت تحليلات الجدوى والتشكل والقوة دليلا على نجاح الإنتاج الواسع النطاق للكرويات ASC. الأكثر حالة هي التأكد من أن المشكلة قد تم حلها فجأة دون أخطاء.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

إسقاط خلية بسيطة الشنق بروتوكول الثقافة للجيل 3D الأجسام الشبه الكروية

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

الاستنساخ واسع النطاق إنتاج ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية استنادا إلى نوع اتش 5 الإنسان

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

الآلية الروبوتية الاستغناء عن تقنية لتوجيه السطحية وBioprinting من الخلايا

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

إنشاء الأنسجة القلبية عرض التكامل الميكانيكي للكروية باستخدام بيوبرينتينغ 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

بيوبرينتينج الغضاريف والجلد الأنسجة النظير استخدام سلبية رواية خلط وحدة تقنية بريسيلولاريزيشن بيوينك

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

الطباعة الحيوية المباشرة لـ 3D Multicellular الثدي Spheroids على الشبكات السفحلية

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

إعداد وتوصيف الحبر الحيوي الهجين الحيوي 3D القائم على الجرافين للهندسة العصبية الطرفية

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

صياغة وتوصيف نظام ناقل الدوبامين القائم على الإكسوسوم

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...