Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Vi takker National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO, RJ, Brasilien) for brugen af deres faciliteter. Denne undersøgelse blev delvist støttet af Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (Faperj) (finanskode: E26/202.682/2018 og E-26/010.001771/2019, National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (finanskode: 307460/2019-3) og Office of Naval Research (ONR) (finanskode: N62909-21-1-2091). Dette arbejde blev delvist støttet af National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

De ASC'er, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev tidligere isoleret fra raske humane donorer og kryopræserveret som beskrevet14 ifølge den forskningsetiske komité for Clementino Fraga Filho University Hospital, Federal University of Rio de Janeiro, Brasilien (25818719.4.0000.5257). Se materialetabel for detaljer om alle materialer og udstyr, der anvendes i denne undersøgelse.
1. Trypsinisering af ASC-monolag ved passage tre...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

Dette papir præsenterer den store produktion af ASC-sfæroider ved hjælp af et automatiseret pipettesystem. Det kritiske trin i protokollen er at konfigurere softwaren nøjagtigt for at sikre det korrekte volumen af celleophæng, hastighed og afstand til pipettering. Parametrene beskrevet i protokollen blev bestemt efter en række forsøg for at optimere dispenseringen af ASC-cellesuspensionen i brøndene på 12-brøndplader indeholdende de mikromolderede, ikke-klæbende hydrogeler. Optimeringen blev evalueret ved at m...

Sfæroider betragtes som en stilladsfri tilgang inden for vævsteknik. ASC'er er i stand til at danne sfæroider ved selvmonteringsprocessen. Sfæroidens 3D-mikroarkitektur øger ASC'ernes regenerative potentiale, herunder differentieringskapaciteten i flere slægter 1,2,3. Denne forskningsgruppe har arbejdet med ASC-sfæroider til brusk- og knoglevævsteknik 4,5,6. Endnu vigtigere betragtes sfæroider som byggesten i biofabrikation af væv og organer, hovedsageligt på grund af deres fusionskapacitet.
Anvendelsen af sfæroider til vævsdannelse afhænger af tre hovedpunkter: (1) udviklingen af standardiserede og skalerbare robotmetoder til deres biofabrikation7, (2) den systematiske fænotypning af vævssfæroider8, (3) udviklingen af metoder til samling af 3D-væv9. Disse sfæroider kan dannes med forskellige celletyper og opnås ved forskellige metoder, herunder hængende dråbe, reaggregation, mikrofluidik og mikromol 8,9,10. Hver af disse metoder har fordele og ulemper relateret til homogeniteten af størrelse og form af sfæroiderne, genopretning af sfæroiderne efter dannelse, antallet af producerede sfæroider, procesautomatisering, arbejdsintensitet og omkostninger11.
I mikromoldmetoden dispenseres cellerne og deponeres i bunden af mikromolden på grund af tyngdekraften. Den ikke-klæbende hydrogel tillader ikke cellerne at klæbe til bunden, og celle-til-celle-interaktioner fører til dannelsen af en enkelt sfæroid pr. Recession 8,12. Denne biofabrikationsmetode genererer sfæroider af homogen og kontrolleret størrelse, kan robotiseres til storskala produktion på en tidseffektiv måde med minimal indsats og har gode omkostningseffektivitetskritiske faktorer i designet af en biofabrikation af vævsferoid 7,8. Denne metode kan anvendes til at danne sfæroider af enhver celleslægt for at forberede en ny vævstype med forudsigelige, optimale og kontrollerbare egenskaber8.
Biofabrikation defineres som "den automatiserede generering af biologisk funktionelle produkter med strukturel organisation ..."13. Derfor betragtes den automatiserede produktion af sfæroider som det første obligatoriske skridt til udvikling af en biofabrikationslinje, som fortsætter i 3D-bioprintprocessen og afsluttes i fuld modning af det bioprintede væv ved sfæroid fusion. I denne undersøgelse bruger vi et automatiseret pipetteringssystem til at frø cellesuspensionen for at forbedre skalerbarheden af ASC-sfæroid biofabrikation og dermed sikre homogeniteten af sfæroid størrelse og form. Dette papir viser, at det var muligt at producere et stort antal (tusinder) sfæroider, der var nødvendige for 3D-bioprintmetoder til biofabrikat af mere komplekse vævsmodeller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

Fedtafledte stromale / stamceller (ASC'er) er en underpopulation af celler, der findes i den stromale vaskulære fraktion af humant subkutant fedtvæv anerkendt som en klassisk kilde til mesenkymale stromale / stamceller. Mange undersøgelser er blevet offentliggjort med ASC'er for stilladsbaserede vævstekniske tilgange, som hovedsageligt undersøgte disse cellers opførsel efter deres såning på bioaktive stilladser. Imidlertid dukker stilladsfrie tilgange op til at konstruere væv in vitro og in vivo, hovedsageligt ved hjælp af sfæroider, for at overvinde begrænsningerne ved stilladsbaserede tilgange.
Sfæroider er 3D-mikrotissuer dannet af selvmonteringsprocessen. De kan bedre efterligne arkitekturen og mikromiljøet af indfødte væv, hovedsageligt på grund af forstørrelsen af celle-til-celle og celle-til-ekstracellulære matrixinteraktioner. For nylig udforskes sfæroider hovedsageligt som sygdomsmodeller, lægemiddelscreeningsundersøgelser og byggesten til 3D-bioprinting. Til 3D-bioprintmetoder er talrige sfæroider, homogene i størrelse og form, imidlertid nødvendige for at biofabrikere komplekse vævs- og organmodeller. Derudover er der ringe chance for mikrobiologisk kontaminering, når sfæroider produceres automatisk, hvilket øger metodens reproducerbarhed.
Den store produktion af sfæroider betragtes som det første obligatoriske skridt til udvikling af en biofabrikationslinje, som fortsætter i 3D-bioprintprocessen og afsluttes i fuld modning af vævskonstruktionen i bioreaktorer. Antallet af undersøgelser, der udforskede den store ASC-sfæroidproduktion, er dog stadig knappe sammen med antallet af undersøgelser, der brugte ASC-sfæroider som byggesten til 3D-bioprinting. Derfor har denne artikel til formål at vise den store produktion af ASC-sfæroider ved hjælp af en ikke-klæbende mikromolded hydrogelteknik, der spreder ASC-sfæroider som byggesten til 3D-bioprintmetoder.

Det automatiske pipettesystem kan så ASC-cellesuspensionen i 12 brønde med en 12-brøndplade på 15 minutter. Brug af 81 mikromolded non-adherent hydrogel vil producere 972 sfæroider i slutningen af protokollen. Brug af den 256 mikromolded ikke-klæbende hydrogel vil producere 3.072 sfæroider i slutningen af protokollen. ASC-sfæroider blev analyseret for homogeniteten af deres størrelse og form. ASC-sfæroider fra mikromol med 81 recessioner viste homogen diameter i kulturperioden i modsætning til ASC-sfæroider f...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Her beskriver vi den store produktion af fedtafledte stromale / stamcelle (ASC) sfæroider ved hjælp af et automatiseret pipetteringssystem til at frø cellesuspensionen og dermed sikre homogenitet af sfæroid størrelse og form. Disse ASC-sfæroider kan bruges som byggesten til 3D-bioprinting-tilgange.

Storstilet, automatiseret produktion af fedtafledte stamcellesfæroider til 3D-bioprint

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Betydningen af protokollen er afhængig af at reducere menneskelige fejl og mikrobiologisk forurening. Derudover ansvarlig for at producere tusindvis af sfæroider til 3D bioprinting tilgange. Den største fordel ved denne sag er dog, at det er optimeret arbejdstiden.Softwareparametrene er afgørende, fordi de kan påvirke den endelige kvalitet af sfæroiderne. Og det bedste råd ville være at udføre test kun med cellekulturmedier. Den visuelle demonstration af denne metode er kritisk, fordi det er en gammel traditionel 3D-cellekulturmetode baseret på Begin ved at høste stamcellesuspensionen med en 10 milliliter serologisk pipette og overføre den til et 50 ml centrifugerør.Centrifuger derefter ved 400 RCF i 5 minutter for at opnå ASC-pelleten. Resuspender cellepillen ved hjælp af DMEM-Low indeholdende 10% FBS. Efter udførelse af celleantal skal du tage ASC'er i separate 15 ml centrifugerør for at frø 81 og 256 recessioner mikromolded med ikke-klæbende hydrogel.Se tekstmanuskriptet for detaljer om antallet af anvendte celler. Tilsæt 500 mikroliter steril 2% ultra ren agaroseopløsning i midten af en silikoneform indeholdende 81 eller 256 cirkulære fordybninger. Efter 40 minutter udformes den ultra rene agarose fra silikoneformen og placeres i en brønd med en 12-brønd plastplade.Tilsæt to milliliter DMEM-Low i brønden med mikromolded agarose og inkuberes ved 37 grader Celsius med 5% atmosfærisk kuldioxidforsyning i mindst 12 timer før såning af ASC'erne. Sørg for, at den laminære strøm er tændt, og at kabinettets luftstrøm fungerer korrekt. Bekræft, at udstyret er tilsluttet den korrekte spænding, og tabletten er tilsluttet udstyret.Kontroller, om højden på kabinetbeskyttelsesglasset er på samme niveau som udstyrets sensormærkning. Tryk på tænd eller sluk-knappen i venstre side af udstyret. Vent derefter på, at tabletten og udstyret starter.Placer tipboksene, stativet til centrifugerør og pladen, der indeholder den mikromolede agarosehydrogel, i udstyrets arbejdsområde. I den software, der åbnes på tabletten, skal du klikke på LabWare Editor. Opret et virtuelt arbejdsbord, og vælg placeringen af pipetterne, tipboksene, stativet til plastrørene og pladerne.Klik på knappen Skift til procedure "for at inkludere alle de parametre og kommandoer, der udføres af udstyret under hele eksperimentet. Vent på, at en værktøjslinje og en procedureliste åbnes i softwaren. For at angive kommandoerne skal du oprindeligt inkorporere antallet af prøver, der skal pipetteres, og trække det til procedurelisten.Klik derefter på kommandoknappen reagensoverførsel "på softwaren for at overføre ASC-suspensionen til brøndene på 12-brøndpladen, der indeholder mikroformene, og træk den til procedurelisten. Klik på egenskaber"for at indstille start- og slutpositionerne for udstyret til at overføre prøven. Vent på, at softwaren vender tilbage til siden Arbejdstabel.Opsæt parametrene for automatiseret såning af ASC'erne som beskrevet i tekstmanuskriptet. Vælg vand som standard væsketype. Klik på optionsknappen for at indstille parametrene til at skabe en homogen suspension af ASC'erne som beskrevet i tekstmanuskriptet.Klik på knappen med et check"symbol på den øverste bjælke i softwaren for at sikre, at der ikke er nogen programmeringsfejl. Klik på play"-knappen på den øverste bjælke i softwaren for at starte programmet. Lad udstyret starte som programmeret.Og vent på, at den laver en lyd, der indikerer, at den er færdig. Saml pladen med 12 brønde, og inkuber den derefter ved 37 grader Celsius med en 5% atmosfærisk kuldioxidforsyning i mindst 18 timer for at tillade fuldstændig og kompakt dannelse af sfæroider. Høst sfæroider manuelt efter en, tre og syv dages kultur til analyse.Skyl mediet med en mikropipette for at frigøre sfæroiderne fra den mikromolderede ikke-klæbende agarosehydrogel. Saml sfæroiderne manuelt ved hjælp af en mikropipette og overfør dem til et 15 ml centrifugerør. I alt 85 og 160 sfæroider blev målt fra mikromolderede ikke-klæbende hydrogeler med henholdsvis 81 og 256 cirkulære recessioner.Det automatiske pipettesystem podede ASC-cellesuspensionen i 12 brønde af en enkelt 12-brøndplade på 15 minutter. Ved hjælp af den 81 mikromolded ikke-klæbende hydrogel producerede 972 sfæroider i denne undersøgelse. Mens den 256 mikromolded ikke-klæbende hydrogel producerede 3072 sfæroider.ASC-sfæroider blev analyseret for homogeniteten af deres størrelse og form. ASC steroider fra mikroforme med 81 recessioner viste homogen diameter i kulturperioden. I modsætning til ASC steroider fra mikroforme med 256 recessioner, den mindste og største diameter ratio var tæt på en i ASC sfæroider fra mikroforme med 81 og 256 recessioner.Levedygtigheds-, morfologi- og kraftanalyserne gav bevis for den vellykkede, store produktion af ASC-sfæroider. Det mest tilfælde af er at sikre, at problemet blev løst brat uden fejl.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Næringsstof forordning ved Kontinuerlig Fodring for Storstilet Udvidelse af pattedyrsceller in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storstilet produktion af høj kapacitet adenovirusvektorer Baseret på menneskelige adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og Samling af 3D mikrokar

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Automatiseret Robotic Udlevering Teknik for Surface Udviklings- og Bioprinting Celler

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Oprettelse af hjertevæv, der udviser mekanisk integration af sfæroider ved hjælp af 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting af brusk og huden væv analoger udnytter en roman passiv blanding enhed teknik for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Direkte bioprinting af 3D-multicellulære brystspærrider på endotelnetværk

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Forberedelse og karakterisering af grafenbaseret 3D biohybrid hydrogel bioink til perifer neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Formulering og karakterisering af et eksosombaseret dopaminbærersystem

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...