Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Wij danken het Nationaal Instituut voor Metrologie, Kwaliteit en Technologie (INMETRO, RJ, Brazilië) voor het gebruik van hun faciliteiten. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (Faperj) (finance Code: E26/202.682/2018 en E-26/010.001771/2019), de National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (finance code: 307460/2019-3) en het Office of Naval Research (ONR) (finance code: N62909-21-1-2091). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

De ASC's die in deze studie werden gebruikt, werden eerder geïsoleerd van gezonde menselijke donoren en gecryopreserveerd zoals beschreven14 volgens de Research Ethics Committee van Clementino Fraga Filho University Hospital, Federal University of Rio de Janeiro, Brazilië (25818719.4.0000.5257). Zie materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen en apparatuur die in dit onderzoek worden gebruikt.
1. Trypsinisatie van ASC monolaag bij p...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

Dit artikel presenteert de grootschalige generatie ASC-sferoïden met behulp van een geautomatiseerd pipetsysteem. De kritieke stap van het protocol is om de software nauwkeurig in te stellen om het juiste volume van celsuspensie, snelheid en afstand voor pipetteren te garanderen. De parameters beschreven in het protocol werden bepaald na een aantal proeven om de afgifte van de ASC-celsuspensie in de putten van 12-well platen met de micromolded, niet-adherente hydrogels te optimaliseren. De optimalisatie werd geëvalueer...

Sferoïden worden beschouwd als een steigervrije benadering in tissue engineering. ASC's zijn in staat om sferoïden te vormen door het zelfassemblageproces. De 3D-microarchitectuur van de sferoïde verhoogt het regeneratieve potentieel van ASC's, inclusief de differentiatiecapaciteit in meerdere afstammingslijnen 1,2,3. Deze onderzoeksgroep heeft gewerkt met ASC-sferoïden voor kraakbeen- en botweefseltechnologie 4,5,6. Wat nog belangrijker is, sferoïden worden beschouwd als bouwstenen in de biofabricage van weefsels en organen, voornamelijk vanwege hun fusiecapaciteit.
Het gebruik van sferoïden voor weefselvorming hangt af van drie hoofdpunten: (1) de ontwikkeling van gestandaardiseerde en schaalbare robotmethoden voor hun biofabricage7, (2) de systematische fenotypering van weefselsferoïden8, (3) de ontwikkeling van methoden voor de assemblage van 3D-weefsels9. Deze sferoïden kunnen worden gevormd met verschillende celtypen en worden verkregen via verschillende methoden, waaronder hanging drop, reaggregatie, microfluïdica en micromol 8,9,10. Elk van deze methoden heeft voor- en nadelen met betrekking tot de homogeniteit van grootte en vorm van de sferoïden, het herstel van de sferoïden na formatie, het aantal geproduceerde sferoïden, procesautomatisering, arbeidsintensiteit en kosten11.
Bij de micromoldmethode worden de cellen vanwege de zwaartekracht op de bodem van de micromol gedoseerd en afgezet. De niet-klevende hydrogel laat de cellen zich niet aan de bodem hechten en cel-tot-cel interacties leiden tot de vorming van een enkele sferoïde per recessie 8,12. Deze biofabricagemethode genereert sferoïden van homogene en gecontroleerde grootte, kan worden gerobotiseerd voor grootschalige productie op een tijdsefficiënte manier met minimale inspanning en heeft goede kosteneffectiviteitskritische factoren bij het ontwerp van een biofabricage van weefselsferoïde 7,8. Deze methode kan worden toegepast om sferoïden van elke cellijn te vormen om een nieuw weefseltype voor te bereiden met voorspelbare, optimale en controleerbare kenmerken8.
Biofabricage wordt gedefinieerd als "de geautomatiseerde generatie van biologisch functionele producten met structurele organisatie ..."13. Daarom wordt de geautomatiseerde productie van sferoïden beschouwd als de eerste verplichte stap voor het ontwikkelen van een biofabricagelijn, die doorgaat in het 3D-bioprintproces en eindigt in de volledige rijping van het biogeprinte weefsel door sferoïde fusie. In deze studie, om de schaalbaarheid van ASC sferoïde biofabricage te verbeteren, gebruiken we een geautomatiseerd pipetteersysteem om de celsuspensie te zaaien, waardoor de homogeniteit van de grootte en vorm van de sferoïde wordt gewaarborgd. Dit artikel toont aan dat het mogelijk was om een groot aantal (duizenden) sferoïden te produceren die nodig zijn voor 3D-bioprintingbenaderingen om complexere weefselmodellen te biofabriceren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

Vet-afgeleide stromale / stamcellen (ASC's) zijn een subpopulatie van cellen gevonden in de stromale vasculaire fractie van menselijk subcutaan vetweefsel erkend als een klassieke bron van mesenchymale stromale / stamcellen. Er zijn veel studies gepubliceerd met ASC's voor op steigers gebaseerde tissue engineering-benaderingen, die voornamelijk het gedrag van deze cellen onderzochten na hun zaaien op bioactieve steigers. Er zijn echter steigervrije benaderingen in opkomst om weefsels in vitro en in vivo te engineeren, voornamelijk door sferoïden te gebruiken, om de beperkingen van op steigers gebaseerde benaderingen te overwinnen.
Sferoïden zijn 3D-microtissues gevormd door het zelfassemblageproces. Ze kunnen de architectuur en micro-omgeving van inheemse weefsels beter nabootsen, voornamelijk door de vergroting van cel-tot-cel en cel-tot-extracellulaire matrixinteracties. Onlangs worden sferoïden voornamelijk onderzocht als ziektemodellen, medicijnscreeningstudies en bouwstenen voor 3D-bioprinting. Voor 3D-bioprintbenaderingen zijn echter talrijke sferoïden, homogeen in grootte en vorm, nodig om complexe weefsel- en orgaanmodellen te biofabriceren. Bovendien, wanneer sferoïden automatisch worden geproduceerd, is er weinig kans op microbiologische besmetting, waardoor de reproduceerbaarheid van de methode toeneemt.
De grootschalige productie van sferoïden wordt beschouwd als de eerste verplichte stap voor het ontwikkelen van een biofabricagelijn, die doorgaat in het 3D-bioprintproces en eindigt in de volledige rijping van het weefselconstruct in bioreactoren. Het aantal studies dat de grootschalige ASC-sferoïdenproductie onderzocht, is echter nog steeds schaars, samen met het aantal studies dat ASC-sferoïden gebruikte als bouwstenen voor 3D-bioprinting. Daarom is dit artikel bedoeld om de grootschalige productie van ASC-sferoïden te laten zien met behulp van een niet-klevende micromolded hydrogel-techniek die ASC-sferoïden verspreidt als bouwstenen voor 3D-bioprintbenaderingen.

Het automatische pipetsysteem kan de ASC-celsuspensie in 15 minuten in 12 putten van één 12-wellplaat zaaien. Het gebruik van de 81 micromol niet-adherente hydrogel zal 972 sferoïden produceren aan het einde van het protocol. Het gebruik van de 256 micromol niet-adherente hydrogel zal 3.072 sferoïden produceren aan het einde van het protocol. ASC-sferoïden werden geanalyseerd op de homogeniteit van hun grootte en vorm. ASC-sferoïden uit micromolden met 81 recessies vertoonden een homogene diameter tijdens de kweekp...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Hier beschrijven we de grootschalige productie van van vetweefsel afgeleide stromale / stamcel (ASC) sferoïden met behulp van een geautomatiseerd pipetteersysteem om de celsuspensie te zaaien, waardoor homogeniteit van sferoïde grootte en vorm wordt gegarandeerd. Deze ASC-sferoïden kunnen worden gebruikt als bouwstenen voor 3D-bioprintingbenaderingen.

Grootschalige, geautomatiseerde productie van van vetweefsel afgeleide stamcelsferoïden voor 3D-bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

De betekenis van het protocol is het verminderen van menselijke fouten en microbiologische besmetting. Daarnaast verantwoordelijk voor het produceren van duizenden sferoïden voor 3D-bioprinting. Het belangrijkste voordeel van deze kwestie is echter dat het de arbeidsuren heeft geoptimaliseerd.De softwareparameters zijn cruciaal omdat ze de uiteindelijke kwaliteit van de sferoïden kunnen beïnvloeden. En het beste advies zou zijn om alleen tests uit te voeren met celkweekmedia. De visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat het een oude traditionele 3D-celkweekmethode is op basis van Begin door de stamcelsuspensie te oogsten met een serologische pipet van 10 milliliter en deze over te brengen naar een centrifugebuis van 50 milliliter.Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 400 RCF om de ASC-pellet te verkrijgen. Resuspendeer de celpellet met DMEM-Low met 10% FBS. Na het uitvoeren van het aantal cellen, neem ASC's in afzonderlijke centrifugebuizen van 15 milliliter om de 81 en 256 recessies te zaaien die zijn gemicromold met niet-adherente hydrogel.Raadpleeg het tekstmanuscript voor meer informatie over het aantal gebruikte cellen. Voeg 500 microliter steriele 2% ultrazuivere agarose-oplossing toe in het midden van een siliconenmal met 81 of 256 cirkelvormige uitsparingen. Maak na 40 minuten de ultrazuivere agaroos uit de siliconenvorm los en plaats deze in een putje van een 12-wells plastic plaat.Voeg twee milliliter DMEM-Low toe in de put met de micromolded agarose en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% atmosferische kooldioxidetoevoer gedurende ten minste 12 uur voordat de ASC's worden ingezaaid. Zorg ervoor dat de laminaire stroom is ingeschakeld en dat de luchtstroom van de kast goed werkt. Controleer of de apparatuur op de juiste spanning is aangesloten en of de tablet op de apparatuur is aangesloten.Controleer of de hoogte van het kastbeschermingsglas op hetzelfde niveau ligt als de sensormarkering van de apparatuur. Druk op de aan- of uitknop aan de linkerkant van de apparatuur. Wacht vervolgens tot de tablet en de apparatuur starten.Plaats de tipboxen, het rek voor centrifugebuizen en de plaat met de micromolded agarose hydrogel in de werkruimte van de apparatuur. Klik in de software die op de tablet is geopend op LabWare Editor. Zet een virtuele werktafel op en kies de posities van de pipetten, tipboxen, het rek voor de plastic buizen en de platen.Klik op de knop overschakelen naar procedure om alle parameters en opdrachten op te nemen die door de apparatuur tijdens het experiment zijn uitgevoerd. Wacht tot een werkbalk en een procedurelijst in de software worden geopend. Om de opdrachten aan te geven, neemt u in eerste instantie het aantal monsters op dat moet worden gepipetteerd en sleept u dit naar de procedurelijst.Klik vervolgens op de opdrachtknop reagensoverdracht op de software om de ASC-suspensie over te brengen naar de putten van de 12-wellsplaat met de micromalen en sleep deze naar de procedurelijst. Klik op eigenschappen"om de begin- en eindposities in te stellen voor de apparatuur om het monster over te brengen. Wacht tot de software terugkeert naar de pagina Werktabel.Stel de parameters in voor het automatisch zaaien van de ASC's zoals beschreven in het tekstmanuscript. Selecteer water als het standaard vloeistoftype. Klik op de knop opties om de parameters in te stellen om een homogene suspensie van de ASC's te creëren zoals beschreven in het tekstmanuscript.Klik op de knop met een vinkje op de bovenste balk van de software om er zeker van te zijn dat er geen programmeerfout is. Klik op de play"-knop op de bovenste balk van de software om het programma te starten. Laat de apparatuur starten zoals geprogrammeerd.En wacht tot het geluid maakt dat aangeeft dat het klaar is. Verzamel de 12-well plaat en incubeer deze vervolgens bij 37 graden Celsius met een 5% atmosferische kooldioxidetoevoer gedurende ten minste 18 uur, om volledige en compacte sferoïdenvorming mogelijk te maken. Oogst de sferoïden handmatig na één, drie en zeven dagen cultuur voor analyse.Spoel het medium met een micropipet om de sferoïden vrij te maken uit de niet-hechtende agarose hydrogel. Verzamel de sferoïden handmatig met behulp van een micropipet en breng ze over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Een totaal van 85 en 160 sferoïden werden gemeten uit micromolded niet-klevende hydrogels met respectievelijk 81 en 256 circulaire recessies.Het automatische pipetsysteem zaaide de ASC-celsuspensie in 15 minuten in 12 putten van een enkele 12-wellsplaat. Met behulp van de 81 micromolded niet-adherente hydrogel, produceerde 972 sferoïden in deze studie. Terwijl de 256 micromol niet-adherente hydrogel, produceerde 3072 sferoïden.ASC-sferoïden werden geanalyseerd op de homogeniteit van hun grootte en vorm. ASC-steroïden uit micromalen met 81 recessies vertoonden een homogene diameter tijdens de kweekperiode. In tegenstelling tot ASC-steroïden uit micromalen met 256 recessies, was de kleinste en grootste diameterverhouding dicht bij één in ASC-sferoïden uit micromalen met 81 en 256 recessies.De levensvatbaarheid, morfologie en krachtanalyses leverden bewijs voor de succesvolle, grootschalige productie van ASC-sferoïden. Het meest voorkomende is om ervoor te zorgen dat het probleem abrupt en zonder fouten werd opgelost.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Nutrient verordening door continue toevoer voor grootschalige uitbreiding van zoogdiercellen in sferoïden

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning en montage van 3D microvaten

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Het creëren van cardiale weefsels die mechanische integratie van sferoïden tonen met behulp van 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting van kraakbeen en huid weefsel analogen met behulp van een roman passief mengen eenheid techniek voor Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Directe bioprinting van 3D-meercellige borstsferoïden op endotheelnetwerken

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Voorbereiding en karakterisering van op grafeen gebaseerde 3D biohybride hydrogel bioink voor perifere neuro-engineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Formuleren en karakteriseren van een op exosomen gebaseerd dopamine-dragersysteem

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...