Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

אנו מודים למכון הלאומי למטרולוגיה, איכות וטכנולוגיה (INMETRO, RJ, ברזיל) על השימוש במתקנים שלהם. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי קרן קרלוס צ'אגאס פילו לתמיכה מחקרית במדינת ריו דה ז'ניירו (Faperj) (קוד מימון: E26/202.682/2018 ו- E-26/010.001771/2019, המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq) (קוד מימון: 307460/2019-3), והמשרד למחקר ימי (ONR) (קוד מימון: N62909-21-1-2091). עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי המרכז הלאומי למדע וטכנולוגיה בנושא רפואה רגנרטיבית-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

ה- ASCs ששימשו במחקר זה בודדו בעבר מתורמים אנושיים בריאים ושימשו בהקפאה כמתואר14 על פי ועדת האתיקה המחקרית של בית החולים האוניברסיטאי קלמנטינו פראגה פילו, האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו, ברזיל (25818719.4.0000.5257). ראה טבלת חומרים לפרטים לגבי כל החומרים והציוד המשמשים במ...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

מאמר זה מציג את הדור בקנה מידה גדול של כדורי ASC באמצעות מערכת פיפטה אוטומטית. השלב הקריטי של הפרוטוקול הוא להגדיר במדויק את התוכנה כדי להבטיח את הנפח הנכון של מתלה התא, המהירות והמרחק לצינורות. הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול נקבעו לאחר מספר ניסויים כדי לייעל את חלוקת ההשעיה של תאי ASC לבארות של...

ספרואידים נחשבים לגישה נטולת פיגומים בהנדסת רקמות. ASCs מסוגלים ליצור ספרואידים על ידי תהליך ההרכבה העצמית. המיקרו-ארכיטקטורה התלת-ממדית של הספרואיד מגדילה את פוטנציאל ההתחדשות של ASCs, כולל יכולת ההתמיינות לשושלות מרובות 1,2,3. קבוצת מחקר זו עובדת עם כדוריות ASC להנדסת סחוס ורקמות עצם 4,5,6. חשוב מכך, ספרואידים נחשבים לאבני בניין בביו-פבריקציה של רקמות ואיברים, בעיקר בשל יכולת ההיתוך שלהם.
השימוש בספרואידים להיווצרות רקמות תלוי בשלוש נקודות עיקריות: (1) פיתוח שיטות רובוטיות סטנדרטיות ומדרגיות לביו-פבריקציה שלהם7, (2) פנוטיפ שיטתי של כדוריותרקמה 8, (3) פיתוח שיטות להרכבה של רקמות תלת-ממדיות9. ניתן ליצור ספרואידים אלה עם סוגי תאים שונים ולהתקבל בשיטות שונות, כולל טיפה תלויה, צבירה מחדש, מיקרופלואידיקה ומיקרומולדס 8,9,10. לכל אחת מהשיטות הללו יש יתרונות וחסרונות הקשורים להומוגניות של גודל וצורת הספרואידים, התאוששות הספרואידים לאחר היווצרותם, מספר הספרואידים המיוצרים, אוטומציה של תהליכים, עוצמת עבודה ועלויות11.
בשיטת המיקרומולד, התאים מחולקים ומופקדים בתחתית המיקרומולד בגלל כוח הכבידה. ההידרוג'ל שאינו דבק אינו מאפשר לתאים להיצמד לתחתית, ואינטראקציות בין תאים לתא מובילות להיווצרות של ספרואיד יחיד לכל מיתון 8,12. שיטת ביו-פבריקציה זו מייצרת ספרואידים בגודל הומוגני ומבוקר, ניתנת לרובוטיזציה לייצור בקנה מידה גדול בצורה חסכונית בזמן עם מאמץ מינימלי, ויש לה גורמים טובים של עלות-תועלת קריטית בתכנון של ביו-פבריקציה של ספרואידרקמה 7,8. ניתן ליישם שיטה זו כדי ליצור ספרואידים של כל שושלת תאים כדי להכין סוג רקמה חדש עם מאפיינים צפויים, אופטימליים וניתנים לשליטה8.
Biofabrication מוגדר כ"ייצור אוטומטי של מוצרים פונקציונליים ביולוגית עם ארגון מבני ..."13. לכן, הייצור האוטומטי של ספרואידים נחשב לצעד החובה הראשון לפיתוח קו ביו-פבריקציה, הממשיך בתהליך ההדפסה הביולוגית התלת-ממדית ומסתיים בהבשלה מלאה של הרקמה המודפסת ביולוגית על ידי היתוך ספרואידים. במחקר זה, כדי לשפר את יכולת ההרחבה של ביו-פבריקציה של ASC spheroid, אנו משתמשים במערכת צינורות אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח את ההומוגניות של גודל וצורת הספרואידים. מאמר זה מראה כי ניתן היה לייצר מספר רב (אלפי) של ספרואידים הדרושים לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית כדי ליצור ביו-פבריקט של מודלים מורכבים יותר של רקמות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

תאי גזע סטרומליים/גזעיים שמקורם בשומן (ASCs) הם תת-אוכלוסייה של תאים המצויים בחלק הווסקולרי הסטרומלי של רקמת השומן התת-עורית האנושית המוכרת כמקור קלאסי לתאי סטרומל/גזע מזנכימליים. מחקרים רבים פורסמו עם ASCs עבור גישות מבוססות הנדסת רקמות מבוססות פיגומים, אשר חקרו בעיקר את התנהגותם של תאים אלה לאחר זריעתם על פיגומים ביו-אקטיביים. עם זאת, גישות נטולות פיגומים מתפתחות כדי להנדס רקמות במבחנה וב-in vivo, בעיקר על ידי שימוש בספרואידים, כדי להתגבר על המגבלות של גישות מבוססות פיגומים.
ספרואידים הם מיקרוטיסואים תלת-ממדיים הנוצרים על ידי תהליך ההרכבה העצמית. הם יכולים לחקות טוב יותר את הארכיטקטורה והמיקרו-סביבה של רקמות מקומיות, בעיקר הודות להגדלה של אינטראקציות בין תא לתא ומטריצה מחוץ לתא. לאחרונה, ספרואידים נחקרים בעיקר כמודלים למחלות, מחקרי סינון תרופות ואבני בניין להדפסה ביולוגית תלת-ממדית. עם זאת, עבור גישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, כדוריואידים רבים, הומוגניים בגודלם ובצורתם, נחוצים לביו-פבריקציה של מודלים מורכבים של רקמות ואיברים. בנוסף, כאשר spheroids מיוצרים באופן אוטומטי, יש סיכוי קטן לזיהום מיקרוביולוגי, הגדלת השכפול של השיטה.
הייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים נחשב לצעד החובה הראשון לפיתוח קו ביו-פבריקציה, הממשיך בתהליך ההדפסה הביולוגית התלת-ממדית ומסתיים בהבשלה מלאה של מבנה הרקמה בביוריאקטורים. עם זאת, מספר המחקרים שבחנו את ייצור כדוריות ה-ASC בקנה מידה גדול עדיין נדיר, יחד עם מספר המחקרים שהשתמשו בספרואידים ASC כאבני בניין להדפסה ביולוגית תלת-ממדית. לכן, מאמר זה נועד להראות את הייצור בקנה מידה גדול של כדורי ASC באמצעות טכניקת הידרוג'ל מיקרומולד שאינה דביקה המפזרת כדורי ASC כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

מערכת הפיפטה האוטומטית יכולה לזרוע את מתלי תאי ה-ASC ל-12 בארות של צלחת אחת בת 12 בארות ב-15 דקות. שימוש בהידרוג'ל 81 מיקרומולד שאינו דבק יפיק 972 ספרואידים בסוף הפרוטוקול. שימוש בהידרוג'ל 256 מיקרומולד שאינו דבק יפיק 3,072 ספרואידים בסוף הפרוטוקול. כדורי ASC נותחו על ההומוגניות של גודלם וצורתם. כדורי ASC ...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

כאן, אנו מתארים את הייצור בקנה מידה גדול של כדוריות סטרומליות/תאי גזע שמקורן בשומן (ASC) באמצעות מערכת פיפטינג אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח הומוגניות של גודל וצורת ספרואידים. כדורי ASC אלה יכולים לשמש כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

ייצור אוטומטי בקנה מידה גדול של כדורי תאי גזע שמקורם בשומן להדפסה ביולוגית תלת-ממדית

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

משמעות הפרוטוקול מסתמכת על צמצום טעויות אנוש וזיהום מיקרוביולוגי. בנוסף, אחראי לייצר אלפי ספרואידים לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית. היתרון העיקרי של העניין הזה, עם זאת, הוא שהוא מייעל את שעות העבודה.הפרמטרים של התוכנה הם קריטיים מכיוון שהם יכולים להשפיע על האיכות הסופית של הספרואידים. והעצה הטובה ביותר תהיה לבצע בדיקות רק עם מדיה תרבית תאים. ההדגמה החזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שמדובר בשיטת תרבית תאים תלת-ממדית מסורתית ישנה המבוססת על בגין על ידי קצירת תרחיף תאי הגזע עם פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר והעברתה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.לאחר מכן, צנטריפוגה ב 400 RCF במשך 5 דקות כדי לקבל את גלולת ASC. בצעו שימוש חוזר בכדור התא באמצעות DMEM-Low המכיל 10%FBS. לאחר ביצוע ספירת תאים, קח ASCs בצינורות צנטריפוגה נפרדים של 15 מיליליטר כדי לזרוע את 81 ו-256 המיתונים במיקרומולד עם הידרוג'ל שאינו דבק.עיין בכתב היד של הטקסט לקבלת פרטים על מספר התאים שבהם נעשה שימוש. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת אגרוז סטרילית 2% טהורה במיוחד במרכז תבנית סיליקון המכילה 81 או 256 שקעים עגולים. לאחר 40 דקות, שחררו את האגרוז הטהור במיוחד מתבנית הסיליקון והניחו אותו בבאר של צלחת פלסטיק בת 12 בארות.הוסיפו שני מיליליטרים של DMEM-Low בבאר עם האגרוז המיקרו-דחוס ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אספקת פחמן דו-חמצני אטמוספרית של 5% למשך 12 שעות לפחות לפני זריעת ה-ASCs. ודאו שהזרימה הלמינרית מופעלת וזרימת האוויר של הארון פועלת כראוי. ודא שהציוד מחובר למתח הנכון והטאבלט מחובר לציוד.בדוק אם גובה זכוכית ההגנה על הארון הוא באותה רמה כמו סימון החיישן של הציוד. לחץ על לחצן ההפעלה או כיבוי בצד שמאל של הציוד. לאחר מכן, המתן עד שהטאבלט והציוד יתחילו.מקם את תיבות הקצוות, את המדף לצינורות צנטריפוגה ואת הצלחת המכילה את הידרוג'ל האגרוז המיקרו-מסולסל בסביבת העבודה של הציוד. בתוכנה שנפתחה בטאבלט, לחץ על עורך LabWare. ערכו שולחן עבודה וירטואלי ובחרו את מיקומי הפיפטות, קופסאות הטיפים, המדף לצינורות הפלסטיק והצלחות.לחץ על כפתור המעבר לפרוצדורה כדי לכלול את כל הפרמטרים והפקודות שבוצעו על ידי הציוד לאורך הניסוי. המתן עד לפתיחת סרגל כלים ורשימת פרוצדורות בתוכנה. בתחילה, כדי לציין את הפקודות, שלבו את מספר הדגימות שיש לצנרת וגררו אותו לרשימת הפרוצדורות.לאחר מכן, לחץ על כפתור הפקודה של העברת המגיבים בתוכנה כדי להעביר את מתלי ה- ASC לבארות של לוחית 12 הקידוחים המכילה את תבניות המיקרו ולגרור אותה לרשימת הפרוצדורות. לחץ על מאפיינים "כדי להגדיר את מיקומי ההתחלה והסיום עבור הציוד להעברת הדגימה. המתן עד שהתוכנה תחזור לדף טבלת עבודה.הגדר את הפרמטרים לזריעה אוטומטית של ה- ASCs כמתואר בכתב היד של הטקסט. בחר מים כסוג הנוזל הסטנדרטי. לחץ על כפתור האפשרויות כדי להגדיר את הפרמטרים כדי ליצור השעיה הומוגנית של ה- ASCs כמתואר בכתב היד של הטקסט.לחץ על הכפתור עם סימן סימון בסרגל העליון של התוכנה כדי לוודא שאין שגיאת תכנות. לחץ על כפתור ההפעלה בסרגל העליון של התוכנה כדי להפעיל את התוכנית. תן לציוד להתחיל כפי שתוכנת.וחכו שהוא ישמיע צליל שיעיד על כך שהוא סיים. אספו את הצלחת בת 12 הבארות ואז דגרו אותה ב-37 מעלות צלזיוס עם אספקת פחמן דו-חמצני אטמוספרית של 5% למשך 18 שעות לפחות, כדי לאפשר היווצרות של כדוריות שלמות וקומפקטיות. לקטוף ידנית את הספרואידים לאחר יום, שלושה ושבעה ימים של תרבית לצורך ניתוח.שטפו את המדיום במיקרו פיפטה כדי לשחרר את הספרואידים מההידרוג'ל האגרוז שאינו דבק במיקרומולד. אסוף את הספרואידים באופן ידני באמצעות מיקרו פיפטה והעביר אותם לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. בסך הכל נמדדו 85 ו-160 ספרואידים מהידרוג'לים שאינם דבקים במיקרומולד עם 81 ו-256 מיתונים מעגליים, בהתאמה.מערכת הפיפטה האוטומטית זרעה את מתלי תאי ה-ASC ל-12 בארות של לוחית אחת בת 12 בארות תוך 15 דקות. באמצעות הידרוג'ל 81 מיקרומולד שאינו דבק, הפיק 972 ספרואידים במחקר זה. בעוד 256 מיקרומולד הידרוג'ל שאינו דבק, ייצר 3072 כדוריות.כדורי ASC נותחו על ההומוגניות של גודלם וצורתם. סטרואידים ASC ממיקרו תבניות עם 81 מיתונים הראו קוטר הומוגני במהלך תקופת התרבית. בניגוד לסטרואידים ASC ממיקרו תבניות עם 256 מיתונים, יחס הקטרים הקטן והגדול ביותר היה קרוב לאחד בספרואידים ASC ממיקרו עובשים עם 81 ו-256 מיתונים.הכדאיות, המורפולוגיה וניתוחי הכוח סיפקו ראיות לייצור מוצלח בקנה מידה גדול של כדורי ASC. המקרה הגדול ביותר של הוא להבטיח כי הבעיה נפתרה בפתאומיות ללא שגיאות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

הכנה ואפיון של ביו-דיו הידרוג'ל ביו-היברידי תלת-ממדי מבוסס גרפן לנוירו-הנדסה היקפית

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

גיבוש ואפיון מערכת נשאי דופמין מבוססת אקסוזום

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...