Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

हम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ मेट्रोलॉजी, क्वालिटी एंड टेक्नोलॉजी (इनमेट्रो, आरजे, ब्राजील) को उनकी सुविधाओं के उपयोग के लिए धन्यवाद देते हैं। यह अध्ययन आंशिक रूप से रियो डी जनेरियो राज्य (फेपरज) के अनुसंधान समर्थन के लिए कार्लोस चगास फिल्हो फाउंडेशन द्वारा समर्थित था (वित्त संहिता: ई 26 / 202.682/2018 और ई -26 / 010.001771/2019, वैज्ञानिक और तकनीकी विकास के लिए राष्ट्रीय परिषद (सीएनपीक्यू) (वित्त कोड: 307460/2019-3), और नौसेना अनुसंधान कार्यालय यह काम आंशिक रूप से पुनर्योजी चिकित्सा-आईएनसीटी रेजेनेरा (http://www.inctregenera.org.br/) पर विज्ञान और प्रौद्योगिकी के राष्ट्रीय केंद्र द्वारा समर्थित था।

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एएससी को पहले स्वस्थ मानव दाताओं से अलग किया गया था और क्लेमेंटिनो फ्रागा फिल्हो विश्वविद्यालय अस्पताल, रियो डी जनेरियो, ब्राजील के संघीय विश्वविद्यालय (25818719.4.0000.5257) की अ?...

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	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

यह पेपर एक स्वचालित पिपेट सिस्टम का उपयोग करके एएससी स्फेरॉइड की बड़े पैमाने पर पीढ़ी प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम पाइपिंग के लिए सेल निलंबन, गति और दूरी की सही मात्रा सुनिश्चित करने ...

स्फेरॉइड को ऊतक इंजीनियरिंग में एक मचान मुक्त दृष्टिकोण माना जाता है। एएससी स्व-असेंबली प्रक्रिया द्वारा स्फेरॉइड बनाने में सक्षम हैं। स्फेरॉइड का 3 डी माइक्रोआर्किटेक्चर एएससी की पुनर्योजी क्षमता को बढ़ाता है, जिसमें कई वंशों 1,2,3 में भेदभाव क्षमता शामिल है। यह शोध समूह उपास्थि और हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग 4,5,6 के लिए एएससी स्फेरॉइड के साथ काम कर रहा है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि स्फेरॉइड को ऊतकों और अंगों के बायोफैब्रिकेशन में बिल्डिंग-ब्लॉक माना जाता है, मुख्य रूप से उनकी संलयन क्षमता के कारण।
ऊतक गठन के लिए स्फेरॉइड का उपयोग तीन मुख्य बिंदुओं पर निर्भर करता है: (1) उनके बायोफैब्रिकेशन के लिए मानकीकृत और स्केलेबल रोबोट विधियों का विकास7, (2) ऊतक स्फेरॉइड के व्यवस्थित फेनोटाइपिंग8, (3) 3 डी ऊतकों की विधानसभा के तरीकों का विकास9. इन स्फेरॉइड्स को विभिन्न सेल प्रकारों के साथ बनाया जा सकता है और विभिन्न तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें हैंगिंग ड्रॉप, रीएग्रीगेशन, माइक्रोफ्लुइडिक्स और माइक्रोमोल्ड्स 8,9,10 शामिल हैं। इन विधियों में से प्रत्येक में स्फेरॉइड के आकार और आकार की एकरूपता, गठन के बाद स्फेरॉइड की वसूली, उत्पादित स्फेरॉइड की संख्या, प्रक्रिया स्वचालन, श्रम तीव्रता और लागत11 से संबंधित फायदे और नुकसान हैं।
माइक्रोमोल्ड विधि में, कोशिकाओं को गुरुत्वाकर्षण के कारण माइक्रोमोल्ड के तल पर वितरित और जमा किया जाता है। गैर-चिपकने वाला हाइड्रोगेल कोशिकाओं को नीचे का पालन करने की अनुमति नहीं देता है, और सेल-टू-सेल इंटरैक्शन प्रति मंदी 8,12 में एक एकल गोलाकार के गठन की ओर जाता है। यह बायोफैब्रिकेशन विधि सजातीय और नियंत्रित आकार के स्फेरॉइड उत्पन्न करती है, न्यूनतम प्रयास के साथ समय-कुशल तरीके से बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए रोबोट किया जा सकता है, और ऊतक स्फेरॉइड 7,8 के बायोफैब्रिकेशन के डिजाइन में अच्छी लागत-प्रभावशीलता-महत्वपूर्ण कारक हैं। इस विधि को अनुमानित, इष्टतम और नियंत्रणीय विशेषताओं के साथ एक नया ऊतक प्रकार तैयार करने के लिए किसी भी सेल वंश के स्फेरॉइड बनाने के लिए लागू किया जा सकता है8.
बायोफैब्रिकेशन को "संरचनात्मक संगठन के साथ जैविक रूप से कार्यात्मक उत्पादों की स्वचालित पीढ़ी के रूप में परिभाषित किया गया है ..." 13. इसलिए, स्फेरॉइड के स्वचालित उत्पादन को बायोफैब्रिकेशन लाइन विकसित करने के लिए पहला अनिवार्य कदम माना जाता है, जो 3 डी बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया में जारी रहता है और स्फेरॉइड संलयन द्वारा बायोप्रिंटेड ऊतक की पूर्ण परिपक्वता में समाप्त होता है। इस अध्ययन में, एएससी गोलाकार बायोफैब्रिकेशन की मापनीयता में सुधार करने के लिए, हम सेल निलंबन को बीज करने के लिए एक स्वचालित पाइपिंग प्रणाली का उपयोग करते हैं, इस प्रकार गोलाकार आकार और आकार की एकरूपता सुनिश्चित करते हैं। इस पेपर से पता चलता है कि बायोफैब्रिकेट अधिक जटिल ऊतक मॉडल के लिए 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए आवश्यक बड़ी संख्या (हजारों) स्फेरॉइड का उत्पादन करना संभव था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

स्टेम कोशिकाएं (एएससी) मानव चमड़े के नीचे के वसा ऊतक के स्ट्रोमल संवहनी अंश में पाई जाने वाली कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या है जिसे मेसेनकाइमल स्ट्रोमल / स्टेम कोशिकाओं के शास्त्रीय स्रोत के रूप में मान्यता प्राप्त है। पाड़-आधारित ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोणों के लिए एएससी के साथ कई अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं, जिन्होंने मुख्य रूप से बायोएक्टिव मचानों पर उनके बोने के बाद इन कोशिकाओं के व्यवहार का पता लगाया। हालांकि, मचान-मुक्त दृष्टिकोण इन विट्रो और विवो में ऊतकों को इंजीनियर करने के लिए उभर रहे हैं, मुख्य रूप से स्फेरॉइड का उपयोग करके, मचान-आधारित दृष्टिकोणों की सीमाओं को दूर करने के लिए।
स्फेरॉइड स्व-असेंबली प्रक्रिया द्वारा गठित 3 डी माइक्रोटिस्यू हैं। वे देशी ऊतकों की वास्तुकला और सूक्ष्म वातावरण की बेहतर नकल कर सकते हैं, मुख्य रूप से सेल-टू-सेल और सेल-टू-एक्सट्रासेल्युलर मैट्रिक्स इंटरैक्शन के आवर्धन के कारण। हाल ही में, स्फेरॉइड को मुख्य रूप से रोग मॉडल, ड्रग स्क्रीनिंग अध्ययन और 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए बिल्डिंग ब्लॉक्स के रूप में खोजा जा रहा है। हालांकि, 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए, कई स्फेरॉइड, आकार और आकार में सजातीय, जटिल ऊतक और अंग मॉडल को बायोफैब्रिकेट करने के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, जब स्फेरॉइड स्वचालित रूप से उत्पादित होते हैं, तो सूक्ष्मजीवविज्ञानी संदूषण के लिए बहुत कम मौका होता है, जिससे विधि की प्रजनन क्षमता बढ़ जाती है।
स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन को बायोफैब्रिकेशन लाइन विकसित करने के लिए पहला अनिवार्य कदम माना जाता है, जो 3 डी बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया में जारी रहता है और बायोरिएक्टरों में ऊतक निर्माण की पूर्ण परिपक्वता में समाप्त होता है। हालांकि, बड़े पैमाने पर एएससी गोलाकार उत्पादन का पता लगाने वाले अध्ययनों की संख्या अभी भी दुर्लभ है, साथ ही उन अध्ययनों की संख्या के साथ जो 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए बिल्डिंग ब्लॉक्स के रूप में एएससी स्फेरॉइड का उपयोग करते थे। इसलिए, इस लेख का उद्देश्य 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में एएससी स्फेरॉइड फैलाने वाली गैर-चिपकने वाली माइक्रोमोल्ड हाइड्रोगेल तकनीक का उपयोग करके एएससी स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन को दिखाना है।

स्वचालित पिपेट प्रणाली 15 मिनट में एक 12 अच्छी तरह से प्लेट के 12 कुओं में एएससी सेल निलंबन बीज कर सकते हैं। 81 माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल का उपयोग प्रोटोकॉल के अंत में 972 स्फेरॉइड का उत्पादन करेगा।...

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Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

स्टेम सेल (एएससी) स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन का वर्णन करते हैं, जो सेल निलंबन को बीज करने के लिए एक स्वचालित पाइपिंग सिस्टम का उपयोग करते हैं, इस प्रकार गोलाकार आकार और आकार की एकरूपता सुनिश्चित करते हैं। इन एएससी स्फेरॉइड का उपयोग 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में किया जा सकता है।

3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल स्फेरॉइड का बड़े पैमाने पर, स्वचालित उत्पादन

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

प्रोटोकॉल का महत्व मानव त्रुटियों और सूक्ष्म जीव विज्ञान संदूषण को कम करने पर निर्भर करता है। इसके अलावा, 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए हजारों स्फेरॉइड का उत्पादन करने के लिए जिम्मेदार है। हालांकि, इस मामले का मुख्य लाभ यह है कि यह श्रम घंटों को अनुकूलित करता है।सॉफ्टवेयर पैरामीटर महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे स्फेरॉइड की अंतिम गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। और सबसे अच्छी सलाह केवल सेल संस्कृति मीडिया के साथ परीक्षण करना होगा। इस पद्धति का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि यह 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ स्टेम सेल निलंबन की कटाई करके और इसे 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करके शुरू होने पर आधारित एक पुरानी पारंपरिक 3 डी सेल संस्कृति विधि है।फिर, एएससी गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 400 आरसीएफ पर अपकेंद्रित्र। 10% एफबीएस युक्त डीएमईएम-लो का उपयोग करके सेल गोली को फिर से निलंबित करें। सेल गिनती करने के बाद, गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल के साथ 81 और 256 मंदी को बीज करने के लिए अलग-अलग 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में एएससी लें।उपयोग की गई कोशिकाओं की संख्या के विवरण के लिए पाठ पांडुलिपि देखें। 81 या 256 परिपत्र अवकाश वाले सिलिकॉन मोल्ड के केंद्र में बाँझ 2% अल्ट्रा शुद्ध एगरोज समाधान के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। 40 मिनट के बाद, सिलिकॉन मोल्ड से अल्ट्रा शुद्ध एग्रोज़ को अनमोल्ड करें और इसे 12-अच्छी तरह से प्लास्टिक प्लेट के कुएं में रखें।माइक्रोमोल्ड एगरोज के साथ कुएं में डीएमईएम-लो के दो मिलीलीटर जोड़ें और एएससी बोने से पहले कम से कम 12 घंटे के लिए 5% वायुमंडलीय कार्बन डाइऑक्साइड की आपूर्ति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। सुनिश्चित करें कि लामिना का प्रवाह चालू है और कैबिनेट का एयरफ्लो ठीक से काम कर रहा है। पुष्टि करें कि उपकरण सही वोल्टेज से जुड़ा हुआ है और टैबलेट उपकरण से जुड़ा हुआ है।जांचें कि कैबिनेट प्रोटेक्शन ग्लास की ऊंचाई उपकरण के सेंसर अंकन के समान स्तर पर है या नहीं। उपकरण के बाईं ओर चालू या बंद बटन दबाएं। फिर, टैबलेट और उपकरण शुरू होने की प्रतीक्षा करें।टिप बक्से, अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए रैक, और उपकरण के कार्यक्षेत्र में माइक्रोमोल्ड एगरोज हाइड्रोगेल युक्त प्लेट की स्थिति। टैबलेट में खोले गए सॉफ़्टवेयर में, लैबवेयर संपादक क्लिक करें. एक आभासी कार्य तालिका स्थापित करें और पिपेट, टिप बॉक्स, प्लास्टिक ट्यूबों के लिए रैक और प्लेटों की स्थिति चुनें।प्रयोग के दौरान उपकरणों द्वारा किए गए सभी मापदंडों और आदेशों को शामिल करने के लिए प्रक्रिया "बटन पर स्विच करें" पर क्लिक करें। सॉफ़्टवेयर में किसी उपकरण पट्टी और प्रक्रिया सूची के खुलने की प्रतीक्षा करें. प्रारंभ में, कमांड को इंगित करने के लिए, पाइप किए जाने वाले नमूनों की संख्या को शामिल करें और इसे प्रक्रिया सूची में खींचें।फिर, माइक्रो मोल्ड्स युक्त 12-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में एएससी निलंबन को स्थानांतरित करने के लिए सॉफ़्टवेयर पर अभिकर्मक स्थानांतरण कमांड बटन पर क्लिक करें और इसे प्रक्रिया सूची में खींचें। गुणों पर क्लिक करें "नमूना स्थानांतरित करने के लिए उपकरण के लिए प्रारंभ" और अंत "पदों को स्थापित करने के लिए। सॉफ़्टवेयर के कार्य तालिका पृष्ठ पर लौटने की प्रतीक्षा करें.पाठ पांडुलिपि में वर्णित एएससी के स्वचालित बीजारोपण के लिए पैरामीटर सेट करें। मानक तरल प्रकार के रूप में पानी का चयन करें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित एएससी का एक सजातीय निलंबन बनाने के लिए मापदंडों को स्थापित करने के लिए विकल्प "बटन पर क्लिक करें।यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई प्रोग्रामिंग त्रुटि नहीं है, सॉफ़्टवेयर के शीर्ष बार पर चेक"प्रतीक के साथ बटन पर क्लिक करें। प्रोग्राम शुरू करने के लिए सॉफ़्टवेयर के शीर्ष बार पर प्ले "बटन पर क्लिक करें। उपकरण प्रोग्राम के रूप में शुरू करते हैं।और यह एक ध्वनि बनाने के लिए प्रतीक्षा करें कि यह समाप्त हो गया है। 12-अच्छी तरह से प्लेट लीजिए, फिर इसे कम से कम 18 घंटों के लिए 5% वायुमंडलीय कार्बन डाइऑक्साइड की आपूर्ति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, ताकि पूर्ण और कॉम्पैक्ट स्फेरॉइड गठन की अनुमति मिल सके। विश्लेषण के लिए संस्कृति के एक, तीन और सात दिनों के बाद मैन्युअल रूप से स्फेरॉइड की कटाई करें।माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी एगरोज़ हाइड्रोगेल से स्फेरॉइड जारी करने के लिए एक माइक्रो पिपेट के साथ माध्यम फ्लश करें। एक माइक्रो पिपेट का उपयोग करके मैन्युअल रूप से स्फेरॉइड ले लीजिए और उन्हें 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। क्रमशः 81 और 256 परिपत्र मंदी के साथ माइक्रोमोल्ड गैर-चिपकने वाले हाइड्रोगेल से कुल 85 और 160 स्फेरॉइड को मापा गया था।स्वचालित पिपेट प्रणाली ने एएससी सेल निलंबन को 15 मिनट में एक एकल 12-अच्छी तरह से प्लेट के 12 कुओं में वरीयता दी। 81 माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल का उपयोग करके, इस अध्ययन में 972 स्फेरॉइड का उत्पादन किया। जबकि 256 माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल ने 3072 स्फेरॉइड का उत्पादन किया।एएससी स्फेरॉइड का विश्लेषण उनके आकार और आकार की एकरूपता के लिए किया गया था। 81 मंदी के साथ सूक्ष्म सांचों से एएससी स्टेरॉयड संस्कृति अवधि के दौरान सजातीय व्यास दिखाया। 256 मंदी के साथ सूक्ष्म सांचों से एएससी स्टेरॉयड के विपरीत, सबसे छोटा और सबसे बड़ा व्यास अनुपात 81 और 256 मंदी के साथ सूक्ष्म सांचों से एएससी स्फेरॉइड में एक के करीब था।व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान और बल विश्लेषण ने एएससी स्फेरॉइड के सफल, बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए सबूत प्रदान किए। सबसे अधिक मामला यह सुनिश्चित करना है कि समस्या त्रुटियों के बिना अचानक हल हो गई थी।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

3D spheroids की पीढ़ी के लिए एक सरल हैंगिंग ड्रॉप सेल संस्कृति प्रोटोकॉल

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Spheroids में स्तनधारी कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर विस्तार के लिए सतत खिलाने से पोषक तत्व विनियमन

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मानव Adenovirus प्रकार 5 पर आधारित उच्च क्षमता adenoviral वैक्टर की क्लोनिंग और बड़े पैमाने पर उत्पादन

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

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Micropatterning और 3 डी microvessels के विधानसभा

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

भूतल गाइडेंस और प्रकोष्ठों के Bioprinting के लिए स्वचालित रोबोट वितरण तकनीक

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3 डी बायोप्रिंटिंग का उपयोग करने वाले स्पैरोइड्स के मेडीकल इंटीग्रेशन का कार्डिएक टिश्यू का निर्माण

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

उपास्थि और त्वचा ऊतक Bioink Precellularization के लिए एक उपंयास निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक के उपयोग के अनुरूप का मुद्रण

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

एंडोथेलियल नेटवर्क पर 3 डी मल्टीसेलुलर ब्रेस्ट स्फेरॉइड की डायरेक्ट बायोप्रिंटिंग

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

परिधीय न्यूरोइंजीनियरिंग के लिए ग्राफीन-आधारित 3 डी बायोहाइब्रिड हाइड्रोगेल बायोइंक की तैयारी और लक्षण वर्णन

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

एक्सोसोम-आधारित डोपामाइन वाहक प्रणाली तैयार करना और चिह्नित करना

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