Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
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Ringraziamo l'Istituto Nazionale di Metrologia, Qualità e Tecnologia (INMETRO, RJ, Brasile) per l'utilizzo delle loro strutture. Questo studio è stato parzialmente sostenuto dalla Fondazione Carlos Chagas Filho per il sostegno alla ricerca dello Stato di Rio de Janeiro (Faperj) (Codice finanziario: E26/202.682/2018 e E-26/010.001771/2019), dal Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico (CNPq) (codice finanziario: 307460/2019-3) e dall'Ufficio di ricerca navale (ONR) (codice finanziario: N62909-21-1-2091). Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

Gli ASC utilizzati in questo studio erano precedentemente isolati da donatori umani sani e crioconservati come descritto14 secondo il Comitato etico di ricerca dell'Ospedale Universitario Clementino Fraga Filho, Università Federale di Rio de Janeiro, Brasile (25818719.4.0000.5257). Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo studio.
1. Tripsinizzazione del monostrato ASC al pa...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

Questo documento presenta la generazione su larga scala di sferoidi ASC utilizzando un sistema di pipette automatizzato. Il passaggio critico del protocollo è quello di impostare con precisione il software per garantire il corretto volume di sospensione della cella, la velocità e la distanza per il pipettaggio. I parametri descritti nel protocollo sono stati determinati dopo una serie di prove per ottimizzare l'erogazione della sospensione cellulare ASC nei pozzetti di piastre a 12 pozzetti contenenti gli idrogel micro...

Gli sferoidi sono considerati un approccio privo di impalcature nell'ingegneria tissutale. Gli ASC sono in grado di formare sferoidi dal processo di auto-assemblaggio. La microarchitettura 3D dello sferoide aumenta il potenziale rigenerativo delle ASC, compresa la capacità di differenziazione in più lignaggi 1,2,3. Questo gruppo di ricerca ha lavorato con sferoidi ASC per l'ingegneria della cartilagine e del tessuto osseo 4,5,6. Ancora più importante, gli sferoidi sono considerati elementi costitutivi nella biofabbricazione di tessuti e organi, principalmente a causa della loro capacità di fusione.
L'uso di sferoidi per la formazione dei tessuti dipende da tre punti principali: (1) lo sviluppo di metodi robotici standardizzati e scalabili per la loro biofabbricazione7, (2) la fenotipizzazione sistematica degli sferoidi tissutali8, (3) lo sviluppo di metodi per l'assemblaggio di tessuti 3D9. Questi sferoidi possono essere formati con diversi tipi di cellule e ottenuti attraverso vari metodi, tra cui hanging drop, reaggregazione, microfluidica e micromole 8,9,10. Ognuno di questi metodi presenta vantaggi e svantaggi legati all'omogeneità delle dimensioni e della forma degli sferoidi, al recupero degli sferoidi dopo la formazione, al numero di sferoidi prodotti, all'automazione del processo, all'intensità del lavoro e ai costi11.
Nel metodo micromold, le cellule vengono erogate e depositate sul fondo del micromold a causa della gravità. L'idrogel non adesivo non consente alle cellule di aderire al fondo e le interazioni cellula-cellula portano alla formazione di un singolo sferoide per recessione 8,12. Questo metodo di biofabbricazione genera sferoidi di dimensioni omogenee e controllate, può essere robotizzato per la produzione su larga scala in modo efficiente in termini di tempo con il minimo sforzo e ha buoni fattori critici in termini di economicità nella progettazione di una biofabbricazione di tessuto sferoide 7,8. Questo metodo può essere applicato per formare sferoidi di qualsiasi lignaggio cellulare per preparare un nuovo tipo di tessuto con caratteristiche prevedibili, ottimali e controllabili8.
La biofabbricazione è definita come "la generazione automatizzata di prodotti biologicamente funzionali con organizzazione strutturale ..."13. Pertanto, la produzione automatizzata di sferoidi è considerata il primo passo obbligatorio per lo sviluppo di una linea di biofabbricazione, che continua nel processo di bioprinting 3D e termina nella piena maturazione del tessuto biostampato mediante fusione sferoide. In questo studio, per migliorare la scalabilità della biofabbricazione sferoide ASC, utilizziamo un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l'omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questo documento mostra che è stato possibile produrre un gran numero (migliaia) di sferoidi necessari per gli approcci di bioprinting 3D per biofabbricare modelli di tessuto più complessi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

Le cellule stromali/staminali di derivazione adiposa (ASC) sono una sottopopolazione di cellule presenti nella frazione vascolare stromale del tessuto adiposo sottocutaneo umano riconosciuta come fonte classica di cellule stromali/staminali mesenchimali. Molti studi sono stati pubblicati con ASC per approcci di ingegneria tissutale basati su scaffold, che hanno esplorato principalmente il comportamento di queste cellule dopo la loro semina su scaffold bioattivi. Tuttavia, stanno emergendo approcci senza impalcature per ingegnerizzare i tessuti in vitro e in vivo, principalmente utilizzando sferoidi, per superare i limiti degli approcci basati su scaffold.
Gli sferoidi sono microtessuti 3D formati dal processo di auto-assemblaggio. Possono imitare meglio l'architettura e il microambiente dei tessuti nativi, principalmente a causa dell'ingrandimento delle interazioni cellula-cellula e cellula-cellula-matrice extracellulare. Recentemente, gli sferoidi vengono esplorati principalmente come modelli di malattia, studi di screening farmacologico e elementi costitutivi per la bioprinting 3D. Tuttavia, per gli approcci di bioprinting 3D, sono necessari numerosi sferoidi, omogenei per dimensioni e forma, per biofabbricare modelli complessi di tessuti e organi. Inoltre, quando gli sferoidi vengono prodotti automaticamente, ci sono poche possibilità di contaminazione microbiologica, aumentando la riproducibilità del metodo.
La produzione su larga scala di sferoidi è considerata il primo passo obbligatorio per lo sviluppo di una linea di biofabbricazione, che continua nel processo di bioprinting 3D e termina nella piena maturazione del costrutto tissutale nei bioreattori. Tuttavia, il numero di studi che hanno esplorato la produzione di sferoidi ASC su larga scala sono ancora scarsi, insieme al numero di studi che hanno utilizzato gli sferoidi ASC come elementi costitutivi per la bioprinting 3D. Pertanto, questo articolo mira a mostrare la produzione su larga scala di sferoidi ASC utilizzando una tecnica di idrogel microstampato non adesiva che diffonde sferoidi ASC come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.

Il sistema di pipette automatiche può seminare la sospensione della cella ASC in 12 pozzetti di una piastra a 12 pozzetti in 15 minuti. L'utilizzo dell'idrogel non aderente 81 microstampato produrrà 972 sferoidi alla fine del protocollo. L'utilizzo di 256 idrogel non aderenti microstampato produrrà 3.072 sferoidi alla fine del protocollo. Gli sferoidi ASC sono stati analizzati per l'omogeneità delle loro dimensioni e forma. Gli sferoidi ASC dei microstidi con 81 recessioni hanno mostrato un diametro omogeneo durante ...

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Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Qui, descriviamo la produzione su larga scala di sferoidi stromali / cellule staminali (ASC) di derivazione adiposa utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l'omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questi sferoidi ASC possono essere utilizzati come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.

Produzione automatizzata su larga scala di sferoidi a cellule staminali di derivazione adiposa per la bioprinting 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Il significato del protocollo si basa sulla riduzione degli errori umani e della contaminazione microbiologica. Inoltre, responsabile della produzione di migliaia di sferoidi per approcci di bioprinting 3D. Il vantaggio principale di questa questione, tuttavia, è che ha ottimizzato le ore di lavoro.I parametri del software sono cruciali perché possono influenzare la qualità finale degli sferoidi. E il miglior consiglio sarebbe quello di eseguire test solo con terreni di coltura cellulare. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché si tratta di un vecchio metodo tradizionale di coltura cellulare 3D basato su Begin raccogliendo la sospensione di cellule staminali con una pipetta sierologica da 10 millilitri e trasferendola in un tubo centrifugo da 50 millilitri.Quindi, centrifugare a 400 RCF per 5 minuti per ottenere il pellet ASC. Risospesciare il pellet cellulare utilizzando DMEM-Low contenente il 10% di FBS. Dopo aver eseguito il conteggio cellulare, prendere ASC in tubi centrifughi separati da 15 millilitri per seminare le recessioni 81 e 256 microstampate con idrogel non aderente.Fare riferimento al manoscritto di testo per i dettagli del numero di celle utilizzate. Aggiungere 500 microlitri di soluzione sterile di agarosio ultra puro al 2% al centro di uno stampo in silicone contenente 81 o 256 recessi circolari. Dopo 40 minuti, sformare l'agarosio ultra puro dallo stampo in silicone e metterlo in un pozzetto di una piastra di plastica a 12 pozzetti.Aggiungere due millilitri di DMEM-Low nel pozzo con l'agarosio microstampato e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica atmosferica per almeno 12 ore prima di seminare gli ASC. Assicurarsi che il flusso laminare sia acceso e che il flusso d'aria dell'armadio funzioni correttamente. Verificare che l'apparecchiatura sia collegata alla tensione corretta e che il tablet sia collegato all'apparecchiatura.Verificare se l'altezza del vetro di protezione dell'armadio è allo stesso livello della marcatura del sensore dell'apparecchiatura. Premere il pulsante di accensione o spegnimento sul lato sinistro dell'apparecchiatura. Quindi, attendere l'avvio del tablet e dell'apparecchiatura.Posizionare le scatole di punta, il rack per i tubi della centrifuga e la piastra contenente l'idrogel di agarosio microstampato nello spazio di lavoro dell'apparecchiatura. Nel software aperto nel tablet, fare clic su LabWare Editor. Imposta un tavolo di lavoro virtuale e scegli le posizioni delle pipette, delle scatole di punta, del rack per i tubi di plastica e delle piastre.Fare clic sul pulsante Passa alla procedura"per includere tutti i parametri e i comandi eseguiti dall'apparecchiatura durante l'esperimento. Attendere l'apertura di una barra degli strumenti e di un elenco di procedure nel software. Inizialmente, per indicare i comandi, incorporare il numero di campioni da pipettare e trascinarlo nell'elenco delle procedure.Quindi, fare clic sul pulsante di comando "trasferimento reagente" sul software per trasferire la sospensione ASC ai pozzetti della piastra a 12 pozzetti contenente i micro stampi e trascinarla nell'elenco delle procedure. Fare clic su "proprietà" per impostare le posizioni di inizio e fine "per l'apparecchiatura per trasferire il campione. Attendere che il software torni alla pagina Tabella di lavoro.Impostare i parametri per la semina automatica degli ASC come descritto nel manoscritto di testo. Selezionare l'acqua come tipo di liquido standard. Fare clic sul pulsante "opzioni" per impostare i parametri per creare una sospensione omogenea degli ASC come descritto nel manoscritto di testo.Fare clic sul pulsante con un simbolo di controllo sulla barra superiore del software per assicurarsi che non vi siano errori di programmazione. Fare clic sul pulsante play"nella barra superiore del software per avviare il programma. Lasciare che l'apparecchiatura inizi come programmato.E aspetta che emetta un suono che indichi che è finito. Raccogliere la piastra a 12 pozzetti quindi incubarla a 37 gradi Celsius con un apporto di anidride carbonica atmosferica del 5% per almeno 18 ore, per consentire la formazione completa e compatta di sferoidi. Raccogliere manualmente gli sferoidi dopo uno, tre e sette giorni di coltura per l'analisi.Lavare il mezzo con una micro pipetta per rilasciare gli sferoidi dall'idrogel di agarosio non aderente microstampato. Raccogliere gli sferoidi manualmente utilizzando una micro pipetta e trasferirli in un tubo centrifugo da 15 millilitri. Un totale di 85 e 160 sferoidi sono stati misurati da idrogel non adesivi microstampati con 81 e 256 recessioni circolari, rispettivamente.Il sistema di pipette automatiche ha seminato la sospensione della cella ASC in 12 pozzetti di una singola piastra a 12 pozzetti in 15 minuti. Utilizzando l'idrogel non aderente 81 microstampato, ha prodotto 972 sferoidi in questo studio. Mentre i 256 microstampati idrogel non aderenti, hanno prodotto 3072 sferoidi.Gli sferoidi ASC sono stati analizzati per l'omogeneità delle loro dimensioni e forma. Gli steroidi ASC da micro muffe con 81 recessioni hanno mostrato un diametro omogeneo durante il periodo di coltura. In contrasto con gli steroidi ASC da micro stampi con 256 recessioni, il rapporto di diametri più piccoli e più grandi era vicino a uno negli sferoidi ASC da micro muffe con 81 e 256 recessioni.La vitalità, la morfologia e le analisi di forza hanno fornito prove per il successo della produzione su larga scala di sferoidi ASC. Il più caso è quello di garantire che il problema sia stato risolto bruscamente senza errori.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l&#39;espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo Adenovirus umano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Tecnica Automated robotica erogazione di orientamento della superficie e Bioprinting di celle

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Creazione di tessuto cardiaco che mostra l&#39;integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Multimateriali di cartilagine e pelle tessuto analoghi utilizzando un romanzo passivo unità tecnica di miscelazione per Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Biostampa diretta di Sferoidi mammari multicellulari 3D su reti endoteliali

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Preparazione e caratterizzazione di bioink idrogel bioibrido 3D a base di grafene per la neuroingegneria periferica

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Formulazione e caratterizzazione di un sistema di trasporto della dopamina basato sugli esosomi

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...