Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

我々は、国立計量・品質・技術研究所(INMETRO、RJ、ブラジル)の施設の使用に感謝する。この研究は、リオデジャネイロ州研究支援のためのカルロス・シャガス・フィーリョ財団(Faperj)(財務コード:E26/202.682/2018およびE-26/010.001771/2019)、国立科学技術開発評議会(CNPq)(財務コード:307460/2019-3)、および海軍研究局(ONR)(財務コード:N62909-21-1-2091)によって部分的に支援されました。この研究は、国立再生医療科学技術センター-INCTリジェネラ(http://www.inctregenera.org.br/)の支援を受けた。

この研究で使用されたASCは、ブラジルのリオデジャネイロ連邦大学クレメンティーノ・フラガ・フィーリョ大学病院の研究倫理委員会(25818719.4.0000.5257)によると、健康なヒトドナーから以前に単離され、凍結保存されていた14。この研究で使用されたすべての材料と機器の詳細については、材料の表を参照してください。
1. 通路3におけ?...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. 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この論文では、自動ピペットシステムを使用したASCスフェロイドの大規模生成について説明します。このプロトコルの重要なステップは、ピペッティングのための細胞懸濁液の正しい量、速度、および距離を保証するためにソフトウェアを正確にセットアップすることです。プロトコールに記載されたパラメータは、マイクロモールドされた非付着性ヒドロゲルを含む12ウェルプレートのウ?...

回転楕円体は、組織工学における足場のないアプローチと考えられている。ASCは、自己組織化プロセスによって回転楕円体を形成することができる。回転楕円体の3Dマイクロアーキテクチャは、複数の系統への分化能力を含むASCの再生可能性を高めます1,2,3。この研究グループは、軟骨および骨組織工学のためのASCスフェロイド4,5,6に取り組んできました。さらに重要なことに、スフェロイドは、主にその融合能力のために、組織および器官のバイオファブリケーションにおけるビルディングブロックと考えられている。
組織形成のためのスフェロイドの使用は、(1)それらのバイオファブリケーションのための標準化されたスケーラブルなロボット法の開発7、(2)組織スフェロイド8の系統的表現型決定、(3)3D組織の組み立てのための方法の開発9の3つの主要なポイントに依存する。これらのスフェロイドは、異なる細胞型で形成することができ、吊り下げドロップ、再凝集、マイクロ流体、およびマイクロモールド8、9、10を含む様々な方法を介して得ることができる。これらの方法の各々は、スフェロイドのサイズおよび形状の均質性、形成後のスフェロイドの回収、生成されるスフェロイドの数、プロセスの自動化、労働強度、およびコスト11に関連する長所および短所を有する。
マイクロモールド法では、細胞は重力のためにマイクロモールドの底部に分配され、堆積される。非接着性ヒドロゲルは、細胞が底部に接着することを許さず、細胞間相互作用は、後退8,12当たりの単一のスフェロイドの形成をもたらす。このバイオファブリケーション方法は、均質で制御されたサイズのスフェロイドを生成し、最小限の労力で時間効率の高い方法で大規模生産のためにロボット化することができ、組織スフェロイドのバイオファブリケーションの設計において優れた費用対効果 - 重要な要素を有する7,8。この方法は、任意の細胞系譜のスフェロイドの形成に適用して、予測可能、最適、および制御可能な特性を有する新しい組織型を調製することができる8。
バイオファブリケーションは、「構造組織を有する生物学的に機能的な製品の自動生成...」13と定義されています。したがって、スフェロイドの自動生産は、3Dバイオプリンティングプロセスを継続し、スフェロイド融合によるバイオプリント組織の完全な成熟で終了するバイオファブリケーションラインを開発するための最初の必須ステップと考えられています。この研究では、ASCスフェロイドバイオファブリケーションのスケーラビリティを向上させるために、自動ピペッティングシステムを使用して細胞懸濁液を播種し、スフェロイドのサイズと形状の均質性を確保します。この論文は、より複雑な組織モデルをバイオファブリケーションするための3Dバイオプリンティングアプローチに必要な多数の(数千)スフェロイドを生成することが可能であったことを示している。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

脂肪由来間質/幹細胞(ASC)は、間葉系間質/幹細胞の古典的な供給源として認識されているヒト皮下脂肪組織の間質血管画分に見られる細胞の亜集団である。足場ベースの組織工学的アプローチのためのASCを用いた多くの研究が発表されており、主に生理活性足場に播種した後のこれらの細胞の挙動を調査した。しかし、足場ベースのアプローチの限界を克服するために、主にスフェロイドを使用して、イン ビトロ および インビボで組織を設計するための足場フリーアプローチが出現しています。
回転楕円体は、自己組織化プロセスによって形成される3Dマイクロ組織である。それらは、主に細胞間および細胞対細胞間マトリックス相互作用の倍率のために、天然組織のアーキテクチャおよび微小環境をよりよく模倣することができる。最近、スフェロイドは主に疾患モデル、薬物スクリーニング研究、および3Dバイオプリンティングのビルディングブロックとして探求されています。しかし、3Dバイオプリンティングアプローチでは、複雑な組織および臓器モデルをバイオファブリケーションするために、サイズと形状が均質な多数の回転楕円体が必要です。さらに、スフェロイドが自動的に生成される場合、微生物学的汚染の可能性はほとんどなく、方法の再現性が向上します。
スフェロイドの大規模生産は、3Dバイオプリンティングプロセスで継続し、バイオリアクター内の組織構築物の完全な成熟で完了するバイオファブリケーションラインを開発するための最初の必須ステップと考えられています。しかし、ASCスフェロイドの大規模な生産を調査した研究の数は、ASCスフェロイドを3Dバイオプリンティングのビルディングブロックとして使用した研究の数とともに、まだ少ないです。したがって、本稿は、ASCスフェロイドを3Dバイオプリンティングアプローチのビルディングブロックとして広げる非接着マイクロモールドヒドロゲル技術を用いたASCスフェロイドの大規模生産を示すことを目的とする。

自動ピペットシステムは、ASC細胞懸濁液を1つの12ウェルプレートの12ウェルに15分で播種することができる。81マイクロモールド非接着ヒドロゲルを使用すると、プロトコルの最後に972個のスフェロイドが生成されます。256マイクロモールド非接着ヒドロゲルを使用すると、プロトコルの最後に3,072個のスフェロイドが生成されます。ASCスフェロイドを、そのサイズおよび形状の均質性につい?...

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Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

ここでは、自動ピペッティングシステムを使用して細胞懸濁液を播種し、スフェロイドのサイズと形状の均質性を確保する脂肪由来間質/幹細胞(ASC)スフェロイドの大規模生産について説明します。これらのASCスフェロイドは、3Dバイオプリンティングアプローチのビルディングブロックとして使用できます。

3Dバイオプリンティングのための脂肪由来幹細胞スフェロイドの大規模自動生産

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

このプロトコルの重要性は、ヒューマンエラーと微生物学の汚染を減らすことに依存しています。さらに、3Dバイオプリンティングアプローチのための何千ものスフェロイドを製造する責任があります。しかし、この問題の主な利点は、労働時間が最適化されていることです。ソフトウェアパラメータは、回転楕円体の最終的な品質に影響を与える可能性があるため、非常に重要です。そして、最善のアドバイスは、細胞培養培地でのみ試験を行うことです。この方法の視覚的実証は、10ミリリットルの血清学的ピペットで幹細胞懸濁液を採取し、それを50ミリリットルの遠心チューブに移すことから始めることに基づく古い伝統的な3D細胞培養方法であるため、非常に重要です。その後、400RCFで5分間遠心分離し、ASCペレットを得た。10%FBSを含むDMEM-Lowを用いて細胞ペレットを再懸濁する。細胞カウントを行った後、ASCsを別々の15ミリリットル遠沈管に取り、非付着性ヒドロゲルでマイクロ成形された81および256後退を播種する。使用されるセルの数の詳細については、テキスト原稿を参照してください。81または256個の円形凹部を含むシリコーンモールドの中央に500マイクロリットルの滅菌2%超高純度アガロース溶液を加える。40分後、シリコーン型から超高純度アガロースを型外し、12ウェルプラスチックプレートのウェルに入れます。マイクロモールドアガロースとともにウェルに2ミリリットルのDMEM-Lowを加え、ASCを播種する前に少なくとも12時間、5%の大気中二酸化炭素供給で摂氏37度でインキュベートします。層流がオンになっていて、キャビネットのエアフローが正しく機能していることを確認します。機器が正しい電圧に接続され、タブレットが機器に接続されていることを確認します。キャビネット保護ガラスの高さが、機器のセンサーマーキングと同じレベルにあるかどうかを確認します。機器の左側にあるオン/オフボタンを押します。次に、タブレットと機器が起動するのを待ちます。チップボックス、遠沈管用ラック、およびマイクロモールドアガロースヒドロゲルを含むプレートを装置のワークスペースに配置します。タブレットで開いたソフトウェアで、[LabWare エディタ]をクリックします。仮想ワークテーブルをセットアップし、ピペット、チップボックス、プラスチックチューブ用のラック、プレートの位置を選択します。手順に切り替える"ボタンをクリックして、実験中に装置によって実行されるすべてのパラメータとコマンドを含めます。ツールバーとプロシージャリストがソフトウェアで開くのを待ちます。最初に、コマンドを示すために、ピペット化するサンプルの数を組み込み、それをプロシージャー・リストにドラッグします。次に、ソフトウェアの試薬移送コマンドボタンをクリックして、ASC懸濁液をマイクロモールドを含む12ウェルプレートのウェルに移し、手順リストにドラッグします。プロパティをクリックして、サンプルを転送する機器の開始位置と終了位置を設定します。ソフトウェアが[作業テーブル]ページに戻るのを待ちます。テキスト原稿の説明に従って、ASC の自動シード用のパラメータを設定します。標準液体タイプとして水を選択します。オプション"ボタンをクリックしてパラメータを設定し、テキスト原稿に記載されているようにASCの均質なサスペンションを作成します。ソフトウェアのトップバーにあるチェック記号の付いたボタンをクリックして、プログラミングエラーがないことを確認します。ソフトウェアのトップバーにある再生ボタンをクリックしてプログラムを起動します。プログラムどおりに機器を起動します。そして、それが終わったことを示す音を出すのを待ちます。12ウェルプレートを収集し、5%の大気中の二酸化炭素供給で摂氏37度で少なくとも18時間インキュベートし、完全でコンパクトなスフェロイド形成を可能にします。分析のために、1 日、3 日、および 7 日間の培養後にスフェロイドを手動で収穫します。マイクロピペットで培地を洗い流し、マイクロモールド非付着性アガロースヒドロゲルからスフェロイドを放出する。マイクロピペットを使用して手動でスフェロイドを収集し、15ミリリットルの遠心管に移します。合計85および160個のスフェロイドを、それぞれ81個および256個の円形後退を有するマイクロ成形非接着ヒドロゲルから測定した。自動ピペットシステムは、ASC細胞懸濁液を15分で単一の12ウェルプレートの12ウェルに播種した。81マイクロモールド非接着ヒドロゲルを用いて、本研究において972個のスフェロイドを作製した。256マイクロモールド非付着性ヒドロゲルを作製しながら、3072スフェロイドを製造した。ASCスフェロイドを、そのサイズおよび形状の均質性について分析した。81回の後退を伴うマイクロカビからのASCステロイドは、培養期間中に均質な直径を示した。256の不況を有するマイクロ型からのASCステロイドとは対照的に、最小および最大の直径比は、81および256後退を有するマイクロ型からのASCスフェロイドの1に近かった。生存率、形態および力の分析は、ASC回転楕円体の成功した大規模生産の証拠を提供しました。ほとんどの場合、問題がエラーなしで突然解決されたことを確認することです。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

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末梢神経工学のためのグラフェンベースの3Dバイオハイブリッドヒドロゲルバイオインクの調製と特性評価

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Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

エクソソームベースのドーパミンキャリアシステムの定式化と特性評価

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...