Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

우리는 그들의 시설의 사용에 대한 계측, 품질 및 기술의 국립 연구소 (INMETRO, RJ, 브라질)에 감사드립니다. 이 연구는 Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of Rio de Janeiro (Faperj) (금융 코드 : E26 / 202.682 / 2018 및 E-26 / 010.001771 / 2019), National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (재무 코드 : 307460 / 2019-3) 및 해군 연구 사무소 (ONR) (재무 코드 : N62909-21-1-2091)가 부분적으로 지원했습니다. 이 연구는 재생 의학-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/)에 관한 국립 과학 기술 센터 (National Center of Science and Technology)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

이 연구에 사용 된 ASC는 이전에 건강한 인간 기증자로부터 분리되었으며 브라질 리우데자네이루 연방 대학 클레멘티노 프라가 필로 대학 병원 (25818719.4.0000.5257)의 연구 윤리위원회에 따라 14에 설명 된 바와 같이 냉동 보존되었습니다. 이 연구에 사용 된 모든 재료 및 장비에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오.
1. 세 번째 통로에서 ...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

이 백서에서는 자동화된 피펫 시스템을 사용하여 대규모 ASC 구상체 생성을 제시합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 피펫팅을위한 셀 서스펜션, 속도 및 거리의 올바른 볼륨을 보장하기 위해 소프트웨어를 정확하게 설정하는 것입니다. 프로토콜에 기재된 파라미터는 마이크로몰딩된, 비부착성 하이드로겔을 함유하는 12-웰 플레이트의 웰 내로 ASC 세포 현탁액의 분배를 최적화하기 위한 다수의 시?...

구상체는 조직 공학에서 스캐폴드가없는 접근법으로 간주됩니다. ASC는 자체 조립 공정에 의해 구상체를 형성 할 수 있습니다. 스페로이드의 3D 마이크로 아키텍처는 ASC의 재생 잠재력을 증가시키며, 여기에는 여러 계보 1,2,3으로의 분화 능력이 포함됩니다. 이 연구 그룹은 연골 및 뼈 조직 공학 4,5,6을 위해 ASC 구상체와 협력하고 있습니다. 더 중요한 것은, 구상체는 주로 융합 능력으로 인해 조직과 기관의 생물 조작에서 빌딩 블록으로 간주됩니다.
조직 형성을위한 구상체의 사용은 세 가지 주요 포인트에 달려 있습니다 : (1) 생물 제조를위한 표준화되고 확장 가능한 로봇 방법의 개발7, (2) 조직 구상체의 체계적인 표현형8, (3) 3D 조직의 조립을위한 방법의 개발9. 이들 구상체는 상이한 세포 유형으로 형성될 수 있고, 교수형 드롭, 재응집, 미세유체학, 및 마이크로몰드 8,9,10을 포함하는 다양한 방법을 통해 수득될 수 있다. 이들 방법들 각각은 구상체의 크기 및 형상의 균질성, 형성 후 구상체의 회수, 생산된 구상체의 수, 공정 자동화, 노동 강도 및 비용(11)과 관련된 장단점을 갖는다.
마이크로몰드 방법에서, 세포는 중력 때문에 마이크로몰드의 바닥에 분배되고 증착된다. 비접착성 하이드로겔은 세포가 바닥에 부착하는 것을 허용하지 않으며, 세포-대-세포 상호작용은 후퇴 당 단일 스페로이드의 형성을 유도한다 8,12. 이 생물 제조 방법은 균일하고 통제 된 크기의 구상체를 생성하고, 최소한의 노력으로 시간 효율적인 방식으로 대규모 생산을 위해 로봇화 될 수 있으며, 조직 스페로이드 7,8의 생물 제조 설계에 비용 효율성이 중요한 요소를 가지고 있습니다. 이 방법은 예측 가능하고 최적이며 조절 가능한 특성을 갖는 새로운 조직 유형을 제조하기 위해 임의의 세포 계보의 구상체를 형성하는데 적용될 수 있다8.
생물 제조는 "구조적 조직을 가진 생물학적 기능성 제품의 자동화 된 생성"으로 정의됩니다 ..."13. 따라서 구상체의 자동 생산은 3D 바이오 프린팅 공정에서 계속되고 스페로이드 융합에 의한 생체 인쇄 조직의 완전한 성숙으로 마무리되는 생물 제조 라인을 개발하기위한 첫 번째 필수 단계로 간주됩니다. 이 연구에서는 ASC 스페로이드 생물 제조의 확장 성을 향상시키기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 세포 현탁액을 시드하여 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 논문은 더 복잡한 조직 모델을 생물 제조하기위한 3D 바이오 프린팅 접근법에 필요한 많은 수의 (수천)의 구상체를 생산할 수 있음을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASCs)는 중간엽 기질 / 줄기 세포의 고전적인 원천으로 인정되는 인간 피하 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 발견되는 세포의 하위 집단입니다. 스캐폴드 기반 조직 공학 접근법에 대한 ASC와 함께 많은 연구가 발표되었으며, 주로 생리 활성 스캐폴드에 시딩 한 후 이러한 세포의 행동을 탐구했습니다. 그러나, 스캐폴드-프리 접근법은 스캐폴드-기반 접근법의 한계를 극복하기 위해 주로 스페로이드를 사용하여 시험관내 및 생체내에서 조직을 설계하기 위해 등장하고 있다.
구상체는 자기 조립 공정에 의해 형성된 3D 미세조직이다. 그들은 주로 세포 대 세포 및 세포 대 세포 매트릭스 상호 작용의 확대로 인해 네이티브 조직의 구조와 미세 환경을 더 잘 모방 할 수 있습니다. 최근에는 구상체가 주로 질병 모델, 약물 스크리닝 연구 및 3D 바이오 프린팅을위한 빌딩 블록으로 탐구되고 있습니다. 그러나 3D 바이오 프린팅 접근법의 경우 크기와 모양이 균질 한 수많은 구상체가 복잡한 조직 및 장기 모델을 생물로 제작하는 데 필요합니다. 또한, 구상체가 자동으로 생성되면 미생물 오염의 가능성이 거의 없으므로 방법의 재현성이 높아집니다.
구상체의 대규모 생산은 3D 바이오 프린팅 공정에서 계속되고 생물 반응기에서 조직 구성물의 완전한 성숙으로 끝나는 생물 제조 라인을 개발하기위한 첫 번째 필수 단계로 간주됩니다. 그러나 대규모 ASC 스페로이드 생산을 탐구 한 연구의 수는 ASC 구상체를 3D 바이오 프린팅의 빌딩 블록으로 사용한 연구의 수와 함께 여전히 부족합니다. 따라서, 본 글은 3D 바이오프린팅 접근법의 빌딩 블록으로서 ASC 구상체를 확산시키는 비접착성 마이크로몰딩 하이드로겔 기술을 이용한 ASC 구상체의 대규모 생산을 보여주는 것을 목표로 한다.

자동 피펫 시스템은 ASC 세포 현탁액을 15분 안에 하나의 12웰 플레이트의 12웰에 시드할 수 있다. 81개의 마이크로몰딩된 비부착성 하이드로젤을 사용하면 프로토콜의 끝에서 972개의 구상체가 생성될 것이다. 256개의 마이크로몰딩된 비부착성 하이드로젤을 사용하면 프로토콜의 끝에서 3,072개의 구상체가 생성될 것이다. ASC 구상체는 그들의 크기 및 형상의 균질성에 대해 분석되었다. 81번의 후퇴를 ...

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Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

여기에서는 세포 현탁액을 시드하기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASC) 구상체의 대규모 생산을 설명하므로 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 ASC 구상체는 3D 바이오 프린팅 접근법의 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다.

3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

프로토콜의 중요성은 인간의 실수와 미생물학 오염을 줄이는 데 달려 있습니다. 또한 3D 바이오 프린팅 접근법을위한 수천 개의 구상체를 생산할 책임이 있습니다. 그러나이 문제의 가장 큰 장점은 노동 시간을 최적화한다는 것입니다.소프트웨어 매개 변수는 구상체의 최종 품질에 영향을 줄 수 있기 때문에 중요합니다. 그리고 가장 좋은 조언은 세포 배양 배지로만 테스트를 수행하는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 10 밀리리터 혈청 학적 피펫으로 줄기 세포 현탁액을 수확하고 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기는 Start를 기반으로하는 오래된 전통적인 3D 세포 배양 방법이기 때문에 중요합니다.그 후, 400 RCF에서 5분 동안 원심분리하여 ASC 펠렛을 얻었다. 10%FBS를 함유하는 DMEM-Low를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 세포 계수를 수행한 후, ASC를 별도의 15밀리리터 원심분리 튜브에 취하여 비부착성 하이드로젤로 마이크로몰딩된 81 및 256 후퇴를 시드한다.사용 된 셀 수에 대한 자세한 내용은 텍스트 원고를 참조하십시오. 500 마이크로 리터의 멸균 2 % 초순수 아가로스 용액을 81 또는 256 개의 원형 움푹 들어간 곳을 포함하는 실리콘 몰드의 중앙에 넣으십시오. 40분 후, 실리콘 몰드로부터 초순수 아가로스를 성형을 풀고 12웰 플라스틱 플레이트의 웰에 놓는다.마이크로 몰딩된 아가로오스와 함께 웰에 DMEM-Low 2밀리리터를 첨가하고, ASC를 시딩하기 전에 적어도 12시간 동안 5% 대기 이산화탄소 공급으로 섭씨 37도에서 인큐베이션한다. 층류가 켜져 있고 캐비닛의 공기 흐름이 제대로 작동하는지 확인하십시오. 장비가 올바른 전압에 연결되어 있고 태블릿이 장비에 연결되어 있는지 확인합니다.캐비닛 보호 유리의 높이가 장비의 센서 표시와 동일한 수준인지 확인하십시오. 장비 왼쪽에 있는 켜기 또는 끄기 단추를 누릅니다. 그런 다음 태블릿과 장비가 시작될 때까지 기다리십시오.팁 박스, 원심분리 튜브용 랙 및 마이크로몰딩된 아가로스 하이드로겔이 포함된 플레이트를 장비의 작업 공간에 배치합니다. 태블릿에서 열린 소프트웨어에서 LabWare 편집기를 클릭합니다. 가상 작업 테이블을 설정하고 피펫, 팁 박스, 플라스틱 튜브용 랙 및 플레이트의 위치를 선택합니다.절차로 전환"버튼을 클릭하여 실험 전반에 걸쳐 장비가 수행 한 모든 매개 변수와 명령을 포함하십시오. 도구 모음과 프로시저 목록이 소프트웨어에서 열릴 때까지 기다립니다. 처음에는 명령을 나타내려면 피펫팅할 샘플 수를 통합하고 프로시저 목록으로 드래그합니다.그런 다음 소프트웨어의 시약 전송"명령 버튼을 클릭하여 ASC 서스펜션을 마이크로 몰드가 포함 된 12 웰 플레이트의 웰로 전송하고 절차 목록으로 드래그하십시오. "속성을 클릭하여 샘플을 전송할 장비의 시작"및 끝"위치를 설정하십시오. 소프트웨어가 작업 테이블 페이지로 돌아갈 때까지 기다립니다.텍스트 원고에 설명된 대로 ASC의 자동 시드를 위한 매개변수를 설정합니다. 표준 액체 유형으로 물을 선택하십시오. 옵션"버튼을 클릭하여 텍스트 원고에 설명 된대로 ASC의 균일 한 서스펜션을 만들기 위해 매개 변수를 설정하십시오.소프트웨어의 상단 막대에있는 check"기호가있는 버튼을 클릭하여 프로그래밍 오류가 없는지 확인하십시오. 프로그램의 상단 막대에있는 재생"버튼을 클릭하여 프로그램을 시작하십시오. 장비가 프로그램된대로 시작되도록하십시오.그리고 그것이 끝났음을 나타내는 소리가 날 때까지 기다리십시오. 12-웰 플레이트를 수집한 다음, 섭씨 37도에서 5% 대기의 이산화탄소 공급으로 최소 18시간 동안 인큐베이션하여 완전하고 컴팩트한 구상체 형성을 가능하게 한다. 분석을 위해 배양한 후, 삼일, 칠일 후에 구상체를 수동으로 수확한다.배지를 마이크로피펫으로 플러시하여 마이크로몰딩된 비부착성 아가로스 하이드로젤로부터 구상체를 방출한다. 마이크로 피펫을 사용하여 구상체를 수동으로 수집하고 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 총 85 및 160개의 구상체가 각각 81 및 256개의 원형 후퇴를 갖는 마이크로몰딩된 비접착성 하이드로젤로부터 측정되었다.자동 피펫 시스템은 ASC 세포 현탁액을 15분 내에 단일 12-웰 플레이트의 12개 웰에 시딩하였다. 81개의 마이크로몰딩된 비부착성 하이드로젤을 사용하여, 본 연구에서 972개의 구상체를 생성하였다. 256개의 마이크로몰딩된 비부착성 하이드로젤이 있는 동안, 3072개의 구상체를 생성하였다.ASC 구상체는 그들의 크기 및 형상의 균질성에 대해 분석되었다. 81 경기 침체를 가진 마이크로 주형으로부터의 ASC 스테로이드는 배양 기간 동안 균질한 직경을 보였다. 256 경기 침체가있는 마이크로 몰드의 ASC 스테로이드와는 달리, 가장 작고 가장 큰 직경 비율은 81 및 256 경기 침체가있는 마이크로 몰드의 ASC 구상체 중 하나에 가깝습니다.생존력, 형태학 및 힘 분석은 ASC 구상체의 성공적이고 대규모 생산에 대한 증거를 제공했습니다. 대부분의 경우는 문제가 오류없이 갑자기 해결되었는지 확인하는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

연구

생체공학

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3D Bioprinting을 이용한 Spheroids의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

내피 네트워크에 3D 다세포 유방 스페로이드의 직접 생체 인쇄

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

말초 신경 공학을 위한 그래핀 기반 3D 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 준비 및 특성화

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

엑소좀 기반 도파민 운반체 시스템의 공식화 및 특성화

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...