Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Vi takker National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO, RJ, Brasil) for bruken av deres fasiliteter. Denne studien ble delvis støttet av Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (Faperj) (finanskode: E26/202.682/2018 og E-26/010.001771/2019, Nasjonalt råd for vitenskapelig og teknologisk utvikling (CNPq) (finanskode: 307460/2019-3), og Office of Naval Research (ONR) (finanskode: N62909-21-1-2091). Dette arbeidet ble delvis støttet av National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

ASCene som ble brukt i denne studien var tidligere isolert fra friske humane donorer og kryopreservert som beskrevet14 i henhold til forskningsetisk komité ved Clementino Fraga Filho Universitetssykehus, Federal University of Rio de Janeiro, Brasil (25818719.4.0000.5257). Se Materialtabell for detaljer om alle materialer og utstyr som er brukt i denne studien.
1. Trypsinisering av ASC monolag ved passering tre
<ol><li>Åpne vevskultu...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

Denne artikkelen presenterer storskala generering av ASC-sfæroider ved hjelp av et automatisert pipettesystem. Det kritiske trinnet i protokollen er å nøyaktig sette opp programvaren for å sikre riktig volum cellesuspensjon, hastighet og avstand for pipettering. Parametrene beskrevet i protokollen ble bestemt etter en rekke forsøk for å optimalisere dispenseringen av ASC-cellesuspensjonen i brønnene på 12-brønnsplater som inneholder mikromolderte, ikke-klebende hydrogeler. Optimaliseringen ble evaluert ved å m?...

Sfæroider betraktes som en stillasfri tilnærming i vevsteknikk. ASC-er er i stand til å danne sfæroider ved selvmonteringsprosessen. Sfæroidens 3D-mikroarkitektur øker det regenerative potensialet til ASC-er, inkludert differensieringskapasiteten i flere linjer 1,2,3. Denne forskningsgruppen har jobbet med ASC-sfæroider for brusk og beinvevsteknikk 4,5,6. Enda viktigere, sfæroider betraktes som byggesteiner i biofabrikasjon av vev og organer, hovedsakelig på grunn av deres fusjonskapasitet.
Bruken av sfæroider for vevsdannelse avhenger av tre hovedpunkter: (1) utvikling av standardiserte og skalerbare robotmetoder for deres biofabrikasjon7, (2) systematisk fenotyping av vevssfæroider8, (3) utvikling av metoder for montering av 3D-vev9. Disse sfæroider kan dannes med forskjellige celletyper og oppnås gjennom ulike metoder, inkludert hengende dråpe, reaggregering, mikrofluidikk og mikromolder 8,9,10. Hver av disse metodene har fordeler og ulemper knyttet til homogeniteten av størrelse og form av sfæroider, gjenoppretting av sfæroider etter dannelse, antall produserte sfæroider, prosessautomatisering, arbeidsintensitet og kostnader11.
I mikromoldmetoden blir cellene dispensert og avsatt på bunnen av mikromolden på grunn av tyngdekraften. Den ikke-klebende hydrogelen tillater ikke at cellene fester seg til bunnen, og celle-til-celle-interaksjoner fører til dannelsen av en enkelt sfæroid per lavkonjunktur 8,12. Denne biofabrikasjonsmetoden genererer sfæroider av homogen og kontrollert størrelse, kan robotiseres for storskala produksjon på en tidseffektiv måte med minimal innsats, og har gode kostnadseffektivitetskritiske faktorer i utformingen av en biofabrikasjon av vevssfæroid 7,8. Denne metoden kan brukes til å danne sfæroider av hvilken som helst cellelinje for å forberede en ny vevstype med forutsigbare, optimale og kontrollerbare egenskaper8.
Biofabrikasjon er definert som "automatisert generering av biologisk funksjonelle produkter med strukturell organisering ..."13. Derfor anses den automatiserte produksjonen av sfæroider som det første obligatoriske trinnet for å utvikle en biofabrikasjonslinje, som fortsetter i 3D-bioprintingsprosessen og avsluttes i full modning av det bioprintede vevet ved sfæroidfusjon. I denne studien, for å forbedre skalerbarheten til ASC-sfæroid biofabrikasjon, bruker vi et automatisert pipetteringssystem for å frø cellesuspensjonen, og sikrer dermed homogeniteten av sfæroid størrelse og form. Dette papiret viser at det var mulig å produsere et stort antall (tusenvis) sfæroider som trengs for 3D bioprinting tilnærminger til biofabricate mer komplekse vevsmodeller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

Fettavledede stromale / stamceller (ASC) er en underpopulasjon av celler som finnes i den stromale vaskulære fraksjonen av humant subkutant fettvev anerkjent som en klassisk kilde til mesenkymale stromale / stamceller. Mange studier har blitt publisert med ASC for stillasbaserte vevstekniske tilnærminger, som hovedsakelig utforsket oppførselen til disse cellene etter såing på bioaktive stillaser. Stillasfrie tilnærminger dukker imidlertid opp for å konstruere vev in vitro og in vivo, hovedsakelig ved å bruke sfæroider, for å overvinne begrensningene i stillasbaserte tilnærminger.
Sfæroider er 3D-mikrotissuer dannet av selvmonteringsprosessen. De kan bedre etterligne arkitekturen og mikromiljøet til innfødte vev, hovedsakelig på grunn av forstørrelsen av celle-til-celle og celle-til-ekstracellulære matriseinteraksjoner. Nylig blir sfæroider hovedsakelig utforsket som sykdomsmodeller, narkotikascreeningstudier og byggesteiner for 3D-bioprinting. For 3D-bioprintingsmetoder er det imidlertid nødvendig med mange sfæroider, homogene i størrelse og form, for å biofabrikere komplekse vevs- og organmodeller. I tillegg, når sfæroider produseres automatisk, er det liten sjanse for mikrobiologisk forurensning, noe som øker reproduserbarheten av metoden.
Storskala produksjon av sfæroider regnes som det første obligatoriske trinnet for å utvikle en biofabrikasjonslinje, som fortsetter i 3D-bioprintingsprosessen og avsluttes i full modning av vevskonstruksjonen i bioreaktorer. Imidlertid er antall studier som utforsket den store ASC-sfæroidproduksjonen fortsatt knappe, sammen med antall studier som brukte ASC-sfæroider som byggesteiner for 3D-bioprinting. Derfor tar denne artikkelen sikte på å vise storskala produksjon av ASC-sfæroider ved hjelp av en ikke-klebende mikromoldert hydrogelteknikk som sprer ASC-sfæroider som byggesteiner for 3D-bioprintingsmetoder.

Det automatiske pipettesystemet kan så ASC-cellesuspensjonen i 12 brønner av en 12-brønns plate på 15 minutter. Ved hjelp av 81 mikromolded ikke-adherent hydrogel vil produsere 972 sfæroider på slutten av protokollen. Ved hjelp av 256 mikromolded ikke-adherent hydrogel vil produsere 3,072 sfæroider på slutten av protokollen. ASC-sfæroider ble analysert for homogeniteten av deres størrelse og form. ASC-sfæroider fra mikromolder med 81 resesjoner viste homogen diameter i kulturperioden i motsetning til ASC-sfær...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Her beskriver vi storskala produksjon av fettavledet stromal/ stamcelle (ASC) sfæroider ved hjelp av et automatisert pipetteringssystem for å frø cellesuspensjonen, og dermed sikre homogenitet av sfæroid størrelse og form. Disse ASC-sfæroidene kan brukes som byggesteiner for 3D-bioprintingsmetoder.

Storskala, automatisert produksjon av fettavledede stamcellesfæroider for 3D-bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Betydningen av protokollen er avhengig av å redusere menneskelige feil og mikrobiologisk forurensning. I tillegg ansvarlig for å produsere tusenvis av sfæroider for 3D bioprinting tilnærminger. Den største fordelen med denne saken er imidlertid at den er optimalisert arbeidstiden.Programvareparametrene er avgjørende fordi de kan påvirke den endelige kvaliteten på sfæroidene. Og det beste rådet ville være å utføre tester bare med cellekulturmedier. Den visuelle demonstrasjonen av denne metoden er kritisk fordi det er en gammel tradisjonell 3D-cellekulturmetode basert på Begynn med å høste stamcellesuspensjonen med en 10 milliliter serologisk pipette og overføre den til et 50 milliliter sentrifugerør.Sentrifuger deretter ved 400 RCF i 5 minutter for å oppnå ASC-pelleten. Resuspender cellepelleten ved hjelp av DMEM-Low som inneholder 10%FBS. Etter å ha utført celletall, ta ASC i separate 15 milliliter sentrifugerør for å frø 81 og 256 lavkonjunkturer mikromolded med ikke-adherent hydrogel.Se tekstmanuskriptet for detaljer om antall celler som brukes. Tilsett 500 mikroliter steril 2% ultra ren agaroseløsning i midten av en silikonform som inneholder 81 eller 256 sirkulære fordypninger. Etter 40 minutter, unmold den ultra rene agarose fra silikonformen og legg den i en brønn av en 12-brønns plastplate.Legg til to milliliter DMEM-Low i brønnen med mikromolded agarose og inkubere ved 37 grader Celsius med 5% atmosfærisk karbondioksidforsyning i minst 12 timer før såing av ASCene. Forsikre deg om at den laminære strømmen er på og at skapets luftstrøm fungerer som den skal. Kontroller at utstyret er koblet til riktig spenning og at nettbrettet er koblet til utstyret.Kontroller om høyden på kabinettbeskyttelsesglasset er på samme nivå som sensormerkingen av utstyret. Trykk på av- eller på-knappen på venstre side av utstyret. Vent deretter til nettbrettet og utstyret starter.Plasser spissboksene, stativet for sentrifugerør og platen som inneholder mikromolded agarosehydrogel i arbeidsområdet til utstyret. I programvaren som åpnes i nettbrettet, klikker du LabWare Editor. Sett opp et virtuelt arbeidsbord og velg posisjonene til pipettene, spissboksene, stativet for plastrørene og platene.Klikk på bryteren til prosedyre"-knappen for å inkludere alle parametrene og kommandoene utført av utstyret gjennom hele eksperimentet. Vent til en verktøylinje og en prosedyreliste åpnes i programvaren. Til å begynne med, for å indikere kommandoene, innlemme antall prøver som skal pipetteres og dra det til prosedyrelisten.Klikk deretter på reagensoverføring"kommandoknappen på programvaren for å overføre ASC-fjæringen til brønnene på 12-brønnsplaten som inneholder mikroformene og dra den til prosedyrelisten. Klikk på egenskaper "for å sette opp start" og slutt "posisjoner for utstyret for å overføre prøven. Vent til programvaren går tilbake til Arbeidstabell-siden.Definer parameterne for automatisert såing av ASC-ene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Velg vann som standard væsketype. Klikk på alternativene"-knappen for å sette opp parametrene for å skape en homogen suspensjon av ASC-ene som beskrevet i tekstmanuskriptet.Klikk på knappen med en sjekk"symbol på den øverste linjen i programvaren for å sikre at det ikke er noen programmeringsfeil. Klikk på play"-knappen på den øverste linjen i programvaren for å starte programmet. La utstyret starte som programmert.Og vent til den lager en lyd som indikerer at den er ferdig. Samle 12-brønnsplaten og inkuber den deretter ved 37 grader Celsius med en 5% atmosfærisk karbondioksidforsyning i minst 18 timer, for å tillate fullstendig og kompakt sfæroiddannelse. Høst sfæroidene manuelt etter en, tre og syv dager med kultur for analyse.Skyll mediet med en mikropipette for å frigjøre sfæroidene fra den mikromolderte ikke-klebende agarosehydrogelen. Samle sfæroider manuelt ved hjelp av en mikropipette og overfør dem til et 15 milliliter sentrifugerør. Totalt 85 og 160 sfæroider ble målt fra mikromolderte ikke-klebende hydrogeler med henholdsvis 81 og 256 sirkulære nedgangstider.Det automatiske pipettesystemet sådde ASC-cellesuspensjonen i 12 brønner av en enkelt 12-brønnsplate på 15 minutter. Ved hjelp av 81 mikromolded ikke-adherent hydrogel, produsert 972 sfæroider i denne studien. Mens 256 mikromolded ikke-adherent hydrogel, produsert 3072 sfæroider.ASC-sfæroider ble analysert for homogeniteten av deres størrelse og form. ASC-steroider fra mikroformer med 81 resesjoner viste homogen diameter i kulturperioden. I motsetning til ASC-steroider fra mikroformer med 256 resesjoner, var det minste og største diametrforholdet nær en i ASC-sfæroider fra mikroformer med 81 og 256 resesjoner.Levedyktighets-, morfologi- og kraftanalysene ga bevis for vellykket, storskala produksjon av ASC-sfæroider. Det mest tilfellet av er å sikre at problemet ble løst brått uten feil.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Nutrient Regulering av Kontinuerlig Fôring for storstilt utvidelse av pattedyrceller i Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storskala produksjon av høykapasitets adenovirusvektorer Basert på Human adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og montering av 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Automatisert Robotic Leveringen Teknikk for Surface Veiledning og Bioprinting Celler

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Opprettelse av hjertevæv som viser mekanisk integrasjon av sfæroider ved hjelp av 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting brusk og huden vev Analogs utnytte en roman passiv miksing enhet teknikk for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Direkte bioprinting av 3D flercellede bryst spheroider på endotelnettverk

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Fremstilling og karakterisering av grafenbasert 3D biohybrid hydrogelbioblekk for perifer nevroteknologi

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

formulere og karakterisere et eksosombasert dopaminbærersystem

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...