Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Agradecemos ao Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO, RJ) pelo uso de suas instalações. Este estudo foi parcialmente apoiado pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (Faperj) (Código financeiro: E26/202.682/2018 e E-26/010.001771/2019, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (código financeiro: 307460/2019-3) e o Escritório de Pesquisa Naval (ONR) (código financeiro: N62909-21-1-2091). Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Centro Nacional de Ciência e Tecnologia em Medicina Regenerativa-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

Os ASCs utilizados neste estudo foram previamente isolados de doadores humanos saudáveis e criopreservados conforme descrito14 segundo o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro( 25818719.4.0000.5257). Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste estudo.
1. Trypsinização da monocamada ASC na passagem três<...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

Este artigo apresenta a geração em larga escala de esferoides ASC usando um sistema automatizado de pipetas. O passo crítico do protocolo é configurar precisamente o software para garantir o volume correto de suspensão, velocidade e distância da célula para a tubulação. Os parâmetros descritos no protocolo foram determinados após uma série de ensaios para otimizar a dispensa da suspensão da célula ASC nos poços de placas de 12 poços contendo os hidrogéis micromoedos e não aderentes. A otimização foi a...

Os spheróides são considerados uma abordagem livre de andaimes na engenharia de tecidos. AsCs são capazes de formar esferoides pelo processo de auto-montagem. A microarquitetura 3D do spheroid aumenta o potencial regenerativo das ASCs, incluindo a capacidade de diferenciação em várias linhagens 1,2,3. Este grupo de pesquisa tem trabalhado com esferoides ASC para engenharia de cartilagem e tecido ósseo 4,5,6. Mais importante, os esferoides são considerados blocos de construção na biofabricação de tecidos e órgãos, principalmente devido à sua capacidade de fusão.
O uso de esferoides para formação de tecidos depende de três pontos principais: (1) o desenvolvimento de métodos robóticos padronizados e escaláveis para sua biofabricação7, (2) o fenotipagem sistemática dos esferoides teciduais8, (3) o desenvolvimento de métodos para a montagem de tecidos 3D9. Esses esferoides podem ser formados com diferentes tipos de células e obtidos através de vários métodos, incluindo queda de suspensão, reagregação, microfluidos e micromedes 8,9,10. Cada um desses métodos possui vantagens e desvantagens relacionadas à homogeneidade de tamanho e forma dos esferoides, recuperação dos esferoides após a formação, número de esferoides produzidos, automação de processos, intensidade de mão-de-obra e custos11.
No método micromold, as células são dispensadas e depositadas na parte inferior do micromold por causa da gravidade. O hidrogel não adesivo não permite que as células aderam ao fundo, e interações célula-célula levam à formação de uma única recessão por perifóide 8,12. Este método de biofabricação gera esferoides de tamanho homogêneo e controlado, pode ser robotizado para produção em larga escala de forma eficiente com esforço mínimo, e tem bons fatores críticos de custo-efetividade no projeto de uma biofabricação de tecido spheroid 7,8. Este método pode ser aplicado para formar esferoides de qualquer linhagem celular para preparar um novo tipo de tecido com características previsíveis, ótimas e controláveis8.
A biofabização é definida como "a geração automatizada de produtos biologicamente funcionais com organização estrutural..."13. Portanto, a produção automatizada de esferoides é considerada o primeiro passo obrigatório para o desenvolvimento de uma linha de biofabricação, que continua no processo de bioimpressão 3D e termina na maturação total do tecido bioimpresso pela fusão esferoide. Neste estudo, para melhorar a escalabilidade da biofabricação esferoide ASC, utilizamos um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Este artigo mostra que foi possível produzir um grande número (milhares) de esferoides necessários para abordagens de bioimpressão 3D para biofabricar modelos de tecidos mais complexos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

Células-tronco/estromenas derivadas de adiposos (ASCs) são uma subpopulação de células encontradas na fração vascular estromada do tecido adiposo subcutâneo humano reconhecido como uma fonte clássica de células mesenquimais estromicas/tronco. Muitos estudos foram publicados com ASCs para abordagens de engenharia de tecidos baseadas em andaimes, que exploraram principalmente o comportamento dessas células após sua semeadura em andaimes bioativos. No entanto, abordagens livres de andaimes estão surgindo para projetar tecidos in vitro e in vivo, principalmente usando esferoides, para superar as limitações das abordagens baseadas em andaimes.
Os spheróides são microtissues 3D formados pelo processo de auto-montagem. Eles podem imitar melhor a arquitetura e o microambiente dos tecidos nativos, principalmente devido à ampliação das interações de matriz celular-célula e célula-extracelular. Recentemente, os esferoides estão sendo explorados principalmente como modelos de doenças, estudos de rastreamento de medicamentos e blocos de construção para bioimpressão 3D. No entanto, para abordagens de bioimpressão 3D, numerosos esferoides, homogêneos em tamanho e forma, são necessários para biofabricar tecidos complexos e modelos de órgãos. Além disso, quando os esferoides são produzidos automaticamente, há pouca chance de contaminação microbiológica, aumentando a reprodutibilidade do método.
A produção em larga escala de esferoides é considerada o primeiro passo obrigatório para o desenvolvimento de uma linha de biofabricação, que continua no processo de bioimpressão 3D e termina na maturação total do tecido construído em bioreatores. No entanto, o número de estudos que exploraram a produção de spheroid ASC em larga escala ainda são escassos, juntamente com o número de estudos que usaram esferoides ASC como blocos de construção para bioimpressão 3D. Portanto, este artigo tem como objetivo mostrar a produção em larga escala de esferoides ASC usando uma técnica de hidrogel micromoldado não adesivo que espalha os esferoides ASC como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.

O sistema de pipeta automática pode semear a suspensão da célula ASC em 12 poços de uma placa de 12 poços em 15 minutos. Usando o hidrogel não aderente de 81 micromoldados produzirá 972 esferoides no final do protocolo. O uso do hidrogel não aderente de 256 micromoldados produzirá 3.072 esferoides no final do protocolo. Os spheróides ASC foram analisados para a homogeneidade de seu tamanho e forma. Os esferoides ASC de micromedes com 81 recessões apresentaram diâmetro homogêneo durante o período de cultura ...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Aqui, descrevemos a produção em larga escala de esferoides esferoides de células-tronco derivados de adiposos (ASC) usando um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Estes esferoides ASC podem ser usados como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.

Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

A importância do protocolo depende da redução de erros humanos e contaminação por microbiologia. Além disso, responsável por produzir milhares de esferoides para abordagens de bioimpressão 3D. A principal vantagem deste assunto, porém, é que ele otimize o horário de trabalho.Os parâmetros de software são cruciais porque podem influenciar a qualidade final dos esferoides. E o melhor conselho seria realizar testes apenas com mídia de cultura celular. A demonstração visual deste método é crítica porque é um antigo método tradicional de cultura celular 3D baseado no Begin, colhendo a suspensão das células-tronco com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e transferindo-a para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.Em seguida, centrífuga a 400 RCF por 5 minutos para obter a pelota ASC. Resuspende a pelota de célula usando DMEM-Low contendo 10% de FBS. Após a realização da contagem de células, tome ASCs em tubos de centrífugas separados de 15 mililitros para semear as 81 e 256 recessões micromoedas com hidrogel não aderente.Consulte o manuscrito do texto para obter detalhes do número de células utilizadas. Adicione 500 microliters de solução de agarose 2% ultra pura estéril no centro de um molde de silicone contendo 81 ou 256 recessos circulares. Após 40 minutos, desenforme a agarose ultra pura do molde de silicone e coloque-a em um poço de uma placa de plástico de 12 poços.Adicione dois mililitros de DMEM-Low no poço com a ágarose micromoldada e incubar a 37 graus Celsius com 5% de suprimento de dióxido de carbono atmosférico por pelo menos 12 horas antes de semear os ASCs. Certifique-se de que o fluxo laminar está ligado e que o fluxo de ar do gabinete esteja funcionando corretamente. Confirme se o equipamento está conectado à tensão correta e o tablet está conectado ao equipamento.Verifique se a altura do vidro de proteção do armário está no mesmo nível da marcação do sensor do equipamento. Pressione o botão liga ou desarme no lado esquerdo do equipamento. Então, espere o tablet e o equipamento começarem.Posicione as caixas de ponta, o rack para tubos de centrífugas e a placa contendo o hidrogel de agarose micromoldado no espaço de trabalho do equipamento. No software aberto no tablet, clique em LabWare Editor. Configure uma mesa de trabalho virtual e escolha as posições das pipetas, caixas de ponta, o rack para os tubos de plástico e as placas.Clique no botão mudar para procedimento"botão para incluir todos os parâmetros e comandos realizados pelo equipamento durante todo o experimento. Aguarde uma barra de ferramentas e uma lista de procedimentos para abrir no software. Inicialmente, para indicar os comandos, incorpore o número de amostras a serem pipetadas e arraste-as para a lista de procedimentos.Em seguida, clique no botão de comando de transferência de reagente no software para transferir a suspensão ASC para os poços da placa de 12 poços contendo os micro moldes e arraste-o para a lista de procedimentos. Clique em propriedades "para configurar as posições de inicial e final para o equipamento transferir a amostra. Aguarde que o software retorne à página Tabela de Trabalho.Configure os parâmetros para semeadura automatizada das ASCs conforme descrito no manuscrito do texto. Selecione a água como o tipo líquido padrão. Clique no botão opções"para configurar os parâmetros para criar uma suspensão homogênea dos ASCs conforme descrito no manuscrito do texto.Clique no botão com um símbolo de verificação na barra superior do software para garantir que não haja erro de programação. Clique no botão play"na barra superior do software para iniciar o programa. Que o equipamento comece como programado.E espere que ele faça um som indicando que terminou. Colete a placa de 12 poços e incuba-a a 37 graus Celsius com um suprimento de dióxido de carbono 5% atmosférico por pelo menos 18 horas, para permitir a formação de esferoides completos e compactos. Colher manualmente os esferoides após um, três e sete dias de cultura para análise.Lave o meio com uma micro pipeta para liberar os esferoides do hidrogel agarose micromolded não aderente. Colete os esferoides manualmente usando uma micro pipeta e transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Um total de 85 e 160 esferoides foram medidos a partir de hidrogéis micromoedos não adesivos com 81 e 256 recessões circulares, respectivamente.O sistema de pipeta automática semeou a suspensão da célula ASC em 12 poços de uma única placa de 12 poços em 15 minutos. Utilizando o hidrogel não aderente de 81 micromoldados, produziu 972 esferoides neste estudo. Enquanto o hidrogel não aderente de 256 micromoldados, produziu 3072 esferoides.Os spheróides ASC foram analisados para a homogeneidade de seu tamanho e forma. Os esteroides ASC de micro moldes com 81 recessões apresentaram diâmetro homogêneo durante o período de cultura. Em contraste com os esteroides ASC de micro moldes com 256 recessões, a menor e maior proporção de diâmetros foi próxima de uma em esferoides ASC de micro moldes com 81 e 256 recessões.A viabilidade, a morfologia e as análises de força forneceram evidências para a produção bem sucedida e em larga escala de esferoides ASC. O maior caso é garantir que o problema foi resolvido abruptamente sem erros.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Bioengenharia

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioimpressão direta de esferoides de mama multicelular 3D em redes endoteliais

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Preparação e caracterização de biotinta de hidrogel biohíbrido 3D à base de grafeno para neuroengenharia periférica

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Formulando e caracterizando um sistema portador de dopamina baseado em exossomo

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...