Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Мы благодарим Национальный институт метрологии, качества и технологии (INMETRO, RJ, Бразилия) за использование их объектов. Это исследование было частично поддержано Фондом Карлоса Шагаса Филью по поддержке исследований штата Рио-де-Жанейро (Faperj) (финансовый кодекс: E26/202.682/2018 и E-26/010.001771/2019), Национальным советом по научно-техническому развитию (CNPq) (финансовый код: 307460/2019-3) и Управлением военно-морских исследований (ONR) (финансовый код: N62909-21-1-2091). Эта работа была частично поддержана Национальным центром науки и технологий по регенеративной медицине INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

ИСС, используемые в этом исследовании, были ранее выделены от здоровых человеческих доноров и криоконсервированы, как описано14 в соответствии с Комитетом по этике исследований Университетской больницы Клементино Фрага Филью, Федеральный университет Рио-де-Жанейро, Брази...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

В данной работе представлена крупномасштабная генерация сфероидов ASC с использованием автоматизированной системы пипеток. Критическим этапом протокола является точная настройка программного обеспечения для обеспечения правильного объема суспензии ячейки, скорости и расстояния дл?...

Сфероиды считаются бесконтактным подходом в тканевой инженерии. ИСС способны образовывать сфероиды в процессе самосборки. 3D-микроархитектура сфероида увеличивает регенеративный потенциал ИСС, включая дифференциацию в несколько линий 1,2,3. Эта исследовательская группа работает со сфероидами ASC для инженерии хряща и костной ткани 4,5,6. Что еще более важно, сфероиды считаются строительными блоками в биофабрикации тканей и органов, в основном из-за их способности к слиянию.
Использование сфероидов для формирования тканей зависит от трех основных моментов: (1) разработка стандартизированных и масштабируемых роботизированных методов их биофабрикации7, (2) систематическое фенотипирование тканевых сфероидов8, (3) разработка методов сборки 3D-тканей9. Эти сфероиды могут быть сформированы с различными типами клеток и получены с помощью различных методов, включая висячую каплю, реагрегацию, микрофлюидику и микромолоды 8,9,10. Каждый из этих методов имеет преимущества и недостатки, связанные с однородностью размеров и формы сфероидов, восстановлением сфероидов после образования, количеством производимых сфероидов, автоматизацией процессов, трудоемкостью и затратами11.
В методе микроформования клетки дозируются и осаждаются в нижней части микромоли из-за силы тяжести. Неадгезивный гидрогель не позволяет клеткам прилипать к дну, а межклеточные взаимодействия приводят к образованию одного сфероида за спад 8,12. Этот метод биофабрикации генерирует сфероиды однородного и контролируемого размера, может быть роботизирован для крупномасштабного производства эффективным по времени способом с минимальными усилиями и имеет хорошие затратоэффективно-критические факторы при проектировании биофабрикации тканевого сфероида 7,8. Этот метод может быть применен для формирования сфероидов любой клеточной линии для получения нового типа ткани с предсказуемыми, оптимальными и контролируемыми характеристиками8.
Биофабрикация определяется как «автоматизированная генерация биологически функциональных продуктов со структурной организацией...»13. Поэтому автоматизированное производство сфероидов считается первым обязательным этапом разработки линии биофабрикации, которая продолжается в процессе 3D-биопечати и заканчивается полным созреванием биопечатной ткани путем слияния сфероидов. В этом исследовании, чтобы улучшить масштабируемость биофабрикации сфероидов ASC, мы используем автоматизированную систему пипетирования для посева клеточной суспензии, обеспечивая тем самым однородность размера и формы сфероида. В данной работе показано, что удалось получить большое количество (тысячи) сфероидов, необходимых для 3D-биопечати подходов к биофабрикату более сложных тканевых моделей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

Стромальные/стволовые клетки , полученные из жировой ткани (ИСС), представляют собой субпопуляцию клеток, обнаруженных в стромальной сосудистой фракции подкожной жировой клетчатки человека, признанной классическим источником мезенхимальных стромальных / стволовых клеток. Многие исследования были опубликованы с ASC для подходов тканевой инженерии на основе каркасов, которые в основном изучали поведение этих клеток после их посева на биоактивные каркасы. Тем не менее, появляются подходы без каркаса для инженерии тканей in vitro и in vivo, в основном с использованием сфероидов, чтобы преодолеть ограничения подходов на основе каркасов.
Сфероиды представляют собой 3D-микроткани, образованные процессом самосборки. Они могут лучше имитировать архитектуру и микроокружение нативных тканей, в основном из-за увеличения межклеточных и межклеточных матриксных взаимодействий. В последнее время сфероиды в основном исследуются в качестве моделей заболеваний, исследований скрининга лекарств и строительных блоков для 3D-биопечати. Однако для подходов к 3D-биопечати для биофабрикатирования сложных моделей тканей и органов необходимы многочисленные сфероиды, однородные по размеру и форме. Кроме того, когда сфероиды производятся автоматически, существует мало шансов на микробиологическое загрязнение, повышающее воспроизводимость метода.
Крупномасштабное производство сфероидов считается первым обязательным этапом для разработки линии биофабрикации, которая продолжается в процессе 3D-биопечати и заканчивается полным созреванием тканевой конструкции в биореакторах. Тем не менее, количество исследований, в которых изучалось крупномасштабное производство сфероидов ASC, по-прежнему ограничено, вместе с количеством исследований, в которых использовались сфероиды ASC в качестве строительных блоков для 3D-биопечати. Таким образом, эта статья направлена на то, чтобы показать крупномасштабное производство сфероидов ASC с использованием неадгезивного микроформованного гидрогеля, распространяющего СФЕРОИДЫ ASC в качестве строительных блоков для подходов к 3D-биопечати.

Автоматическая система пипеток может засеять суспензию ячейки ASC в 12 лунок одной 12-луночной пластины за 15 минут. Использование 81 микроформованного неадгезивного гидрогеля позволит получить 972 сфероида в конце протокола. Использование 256 микроформованных неадгезивных гидрогелей даст 3...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Здесь мы описываем крупномасштабное производство сфероидов стромальных/стволовых клеток (ASC) жирового происхождения с использованием автоматизированной системы пипетирования для посева клеточной суспензии, обеспечивая тем самым однородность размера и формы сфероида. Эти сфероиды ASC могут быть использованы в качестве строительных блоков для подходов к 3D-биопечати.

Крупномасштабное автоматизированное производство сфероидов стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для 3D-биопечати

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Значение протокола зависит от уменьшения человеческих ошибок и микробиологического загрязнения. Кроме того, отвечает за производство тысяч сфероидов для 3D-биопечати подходов. Основным преимуществом этого вопроса, однако, является то, что он оптимизирует рабочее время.Параметры программного обеспечения имеют решающее значение, поскольку они могут влиять на конечное качество сфероидов. И лучшим советом было бы проводить тесты только с клеточными культуральными средами. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что это старый традиционный метод 3D-культуры клеток, основанный на Бегине путем сбора суспензии стволовых клеток с серологической пипеткой 10 миллилитра и переноса ее в 50-миллилитровую центрифужную трубку.Затем центрифугируют при 400 RCF в течение 5 минут, чтобы получить гранулу ASC. Повторное суспендирование клеточной гранулы с использованием DMEM-Low, содержащей 10% FBS. После подсчета клеток возьмите ИСС в отдельные 15-миллилитровые центрифужные трубки, чтобы засеять 81 и 256 рецессий, микроформованных неадгезивным гидрогелем.Обратитесь к текстовой рукописи для получения подробной информации о количестве используемых ячеек. Добавьте 500 микролитров стерильного 2% ультрачистого раствора агарозы в центр силиконовой формы, содержащей 81 или 256 круглых углублений. Через 40 минут отформуйте ультрачистую агарозу из силиконовой формы и поместите ее в колодец из 12-луночной пластиковой пластины.Добавьте два миллилитра DMEM-Low в скважину с микроформованной агарозой и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с подачей углекислого газа 5% в атмосферу в течение не менее 12 часов перед посевом ИСС. Убедитесь, что ламинарный поток включен, а воздушный поток шкафа работает правильно. Убедитесь, что оборудование подключено к правильному напряжению, а планшет подключен к оборудованию.Проверьте, находится ли высота защитного стекла шкафа на том же уровне, что и маркировка датчика оборудования. Нажмите кнопку включения или выключения на левой стороне оборудования. Затем дождитесь запуска планшета и оборудования.Расположите наконечники коробок, стойку для трубок центрифуги и пластину, содержащую микроформованный гидрогель агарозы, в рабочем пространстве оборудования. В программном обеспечении, открытом на планшете, щелкните Редактор LabWare. Установите виртуальный рабочий стол и выберите положения пипеток, коробок для наконечников, стойки для пластиковых трубок и пластин.Нажмите на кнопку «Переключиться на процедуру», чтобы включить все параметры и команды, выполняемые оборудованием на протяжении всего эксперимента. Дождитесь открытия панели инструментов и списка процедур в программном обеспечении. Первоначально, чтобы указать команды, включите количество образцов для пипетирования и перетащите их в список процедур.Затем нажмите на командную кнопку «Перенос реагента» на программном обеспечении, чтобы перенести суспензию ASC в скважины 12-луночной пластины, содержащей микроформы, и перетащите ее в список процедур. Нажмите на свойства "чтобы настроить начальную" и конечную" позиции для оборудования для передачи образца. Подождите, пока программное обеспечение вернется на страницу Рабочая таблица.Настройте параметры для автоматического заполнения ИСС, как описано в тексте рукописи. Выберите воду в качестве стандартного типа жидкости. Нажмите на кнопку «Параметры», чтобы настроить параметры для создания однородной приостановки ИСС, как описано в текстовой рукописи.Нажмите на кнопку с символом «галочки» на верхней панели программного обеспечения, чтобы убедиться, что нет ошибки программирования. Нажмите кнопку воспроизведения на верхней панели программного обеспечения, чтобы запустить программу. Пусть оборудование запускается так, как запрограммировано.И подождите, пока он издаст звук, указывающий на то, что он закончил. Соберите 12-луночную пластину, а затем инкубируйте ее при 37 градусах Цельсия с 5% атмосферным запасом углекислого газа в течение не менее 18 часов, чтобы обеспечить полное и компактное образование сфероидов. Вручную собирайте сфероиды после одного, трех и семи дней культуры для анализа.Промывайте среду микропипеткой, чтобы освободить сфероиды от микроформованного неадгезивного гидрогеля агарозы. Соберите сфероиды вручную с помощью микропипетки и перенесите их в 15-миллилитровую центрифужную трубку. В общей сложности 85 и 160 сфероидов были измерены из микроформованных неадгезивных гидрогелей с 81 и 256 круговыми рецессиями соответственно.Автоматическая система пипеток за 15 минут засеяла суспензию ячейки ASC в 12 лунок одной пластины из 12 лунок. Используя 81 микроформованный неадгезивный гидрогель, в этом исследовании было получено 972 сфероида. В то время как 256 микроформованных неадгезивных гидрогелей, произвели 3072 сфероида.Сфероиды ASC были проанализированы на однородность их размера и формы. Стероиды ASC из микроформ с 81 рецессией показали однородный диаметр в период культивирования. В отличие от стероидов ASC из микроформ с 256 рецессиями, соотношение наименьших и самых больших диаметров было близко к единице в сфероидах ASC из микроформ с 81 и 256 рецессиями.Анализ жизнеспособности, морфологии и силы свидетельствует об успешном крупномасштабном производстве сфероидов САС. Самый большой случай заключается в том, чтобы проблема была решена резко без ошибок.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Простые висячей капли культуре клеток Протокол Генерация 3D сфероидов

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Питательные Регулирование непрерывной подачи для крупномасштабного Расширение клеток млекопитающих в сфероидов

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Клонирование и крупномасштабное производство высокопроизводительного аденовирусные векторы на основе типа аденовируса человека 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning и сборка 3D микрососудов

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Роботизированная Дозирование Техника для ориентации поверхности и Bioprinting клеток

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Создание сердечной ткани, обеспечивающей механическую интеграцию сфероидов с использованием 3D-биопреобразования

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Подложке хряща и аналогов ткани кожи, используя Роман пассивного смешивания единицы техники для Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Прямая биопечать 3D многоклеточных сфероидов молочной железы на эндотелиальные сети

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Получение и характеристика 3D-биогибридных гидрогелевых биочернил на основе графена для периферической нейроинженерии

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Формулировка и характеристика экзосомно-носительской системы дофамина

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...