Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
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Agradecemos al Instituto Nacional de Metrología, Calidad y Tecnología (INMETRO, RJ, Brasil) por el uso de sus instalaciones. Este estudio fue parcialmente apoyado por la Fundación Carlos Chagas Filho para el Apoyo a la Investigación del Estado de Río de Janeiro (Faperj) (Código financiero: E26/202.682/2018 y E-26/010.001771/2019), el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) (código financiero: 307460/2019-3) y la Oficina de Investigaciones Navales (ONR) (código financiero: N62909-21-1-2091). Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Centro Nacional de Ciencia y Tecnología en Medicina Regenerativa-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

Los ASC utilizados en este estudio fueron previamente aislados de donantes humanos sanos y criopreservados como se describe14 según el Comité de Ética en Investigación del Hospital Universitario Clementino Fraga Filho, Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil (25818719.4.0000.5257). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y equipos utilizados en este estudio.
1. Tripsinización de la monocapa ASC ...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. 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Este artículo presenta la generación a gran escala de esferoides ASC utilizando un sistema automatizado de pipetas. El paso crítico del protocolo es configurar con precisión el software para garantizar el volumen correcto de suspensión de celdas, velocidad y distancia para el pipeteo. Los parámetros descritos en el protocolo se determinaron después de una serie de ensayos para optimizar la dispensación de la suspensión celular ASC en los pocillos de placas de 12 pocillos que contienen los hidrogeles micromoldead...

Los esferoides se consideran un enfoque libre de andamios en la ingeniería de tejidos. Los ASC son capaces de formar esferoides mediante el proceso de autoensamblaje. La microarquitectura 3D del esferoide aumenta el potencial regenerativo de los ASC, incluida la capacidad de diferenciación en múltiples linajes 1,2,3. Este grupo de investigación ha estado trabajando con esferoides ASC para la ingeniería de cartílago y tejido óseo 4,5,6. Más importante aún, los esferoides se consideran bloques de construcción en la biofabricación de tejidos y órganos, principalmente debido a su capacidad de fusión.
El uso de esferoides para la formación de tejidos depende de tres puntos principales: (1) el desarrollo de métodos robóticos estandarizados y escalables para su biofabricación7, (2) el fenotipado sistemático de esferoides tisulares8, (3) el desarrollo de métodos para el ensamblaje de tejidos 3D9. Estos esferoides se pueden formar con diferentes tipos de células y obtenerse a través de diversos métodos, incluyendo gota colgante, reagregación, microfluídica y micromoldes 8,9,10. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas relacionadas con la homogeneidad del tamaño y la forma de los esferoides, la recuperación de los esferoides después de la formación, el número de esferoides producidos, la automatización del proceso, la intensidad de la mano de obra y los costos11.
En el método del micromoldo, las células se dispensan y se depositan en la parte inferior del micromoldo debido a la gravedad. El hidrogel no adhesivo no permite que las células se adhieran al fondo, y las interacciones de célula a célula conducen a la formación de un solo esferoide por recesión 8,12. Este método de biofabricación genera esferoides de tamaño homogéneo y controlado, puede ser robotizado para la producción a gran escala de una manera eficiente en el tiempo con el mínimo esfuerzo, y tiene buenos factores críticos de costo-efectividad en el diseño de una biofabricación de esferoide tisular 7,8. Este método se puede aplicar para formar esferoides de cualquier linaje celular para preparar un nuevo tipo de tejido con características predecibles, óptimas y controlables8.
La biofabricación se define como "la generación automatizada de productos biológicamente funcionales con organización estructural..."13. Por lo tanto, la producción automatizada de esferoides se considera el primer paso obligatorio para desarrollar una línea de biofabricación, que continúa en el proceso de bioimpresión 3D y termina en la maduración completa del tejido bioimpreso por fusión esferoide. En este estudio, para mejorar la escalabilidad de la biofabricación de esferoides ASC, utilizamos un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Este artículo muestra que fue posible producir un gran número (miles) de esferoides necesarios para los enfoques de bioimpresión 3D para biofabricar modelos de tejidos más complejos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

Las células estromales/madre derivadas de tejido adiposo (ASC) son una subpoblación de células que se encuentran en la fracción vascular estromal del tejido adiposo subcutáneo humano reconocido como una fuente clásica de células estromales/madre mesenquimales. Se han publicado muchos estudios con ASC para enfoques de ingeniería de tejidos basados en andamios, que exploraron principalmente el comportamiento de estas células después de su siembra en andamios bioactivos. Sin embargo, están surgiendo enfoques libres de andamios para diseñar tejidos in vitro e in vivo, principalmente mediante el uso de esferoides, para superar las limitaciones de los enfoques basados en andamios.
Los esferoides son microtejidos 3D formados por el proceso de autoensamblaje. Pueden imitar mejor la arquitectura y el microambiente de los tejidos nativos, principalmente debido a la ampliación de las interacciones de célula a célula y de célula a matriz extracelular. Recientemente, los esferoides se están explorando principalmente como modelos de enfermedades, estudios de detección de drogas y bloques de construcción para la bioimpresión 3D. Sin embargo, para los enfoques de bioimpresión 3D, numerosos esferoides, homogéneos en tamaño y forma, son necesarios para biofabricar modelos complejos de tejidos y órganos. Además, cuando los esferoides se producen automáticamente, hay pocas posibilidades de contaminación microbiológica, lo que aumenta la reproducibilidad del método.
La producción a gran escala de esferoides se considera el primer paso obligatorio para desarrollar una línea de biofabricación, que continúa en el proceso de bioimpresión 3D y termina en la maduración completa de la construcción de tejidos en biorreactores. Sin embargo, el número de estudios que exploraron la producción de esferoides ASC a gran escala aún es escaso, junto con el número de estudios que utilizaron esferoides ASC como bloques de construcción para la bioimpresión 3D. Por lo tanto, este artículo tiene como objetivo mostrar la producción a gran escala de esferoides ASC utilizando una técnica de hidrogel micromoldeado no adhesivo que difunde los esferoides ASC como bloques de construcción para los enfoques de bioimpresión 3D.

El sistema automático de pipetas puede sembrar la suspensión de células ASC en 12 pocillos de una placa de 12 pocillos en 15 minutos. El uso del hidrogel no adherente micromoldeado de 81 producirá 972 esferoides al final del protocolo. Utilizando el hidrogel no adherente micromoldeado 256 producirá 3.072 esferoides al final del protocolo. Los esferoides ASC fueron analizados por la homogeneidad de su tamaño y forma. Los esferoides ASC de micromoldes con 81 recesiones mostraron un diámetro homogéneo durante el per...

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Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Aquí, describimos la producción a gran escala de esferoides estromales /células madre (ASC) derivados de tejido adiposo utilizando un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Estos esferoides ASC se pueden utilizar como bloques de construcción para enfoques de bioimpresión 3D.

Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

La importancia del protocolo radica en la reducción de los errores humanos y la contaminación microbiológica. Además, responsable de producir miles de esferoides para enfoques de bioimpresión 3D. La principal ventaja de este asunto, sin embargo, es que ha optimizado las horas de trabajo.Los parámetros del software son cruciales porque pueden influir en la calidad final de los esferoides. Y el mejor consejo sería realizar pruebas solo con medios de cultivo celular. La demostración visual de este método es crítica porque es un antiguo método tradicional de cultivo celular 3D basado en Begin recolectando la suspensión de células madre con una pipeta serológica de 10 mililitros y transfiriéndola a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.Luego, centrífuga a 400 RCF durante 5 minutos para obtener el pellet ASC. Resuspend el pellet celular usando DMEM-Low que contiene 10% FBS. Después de realizar el recuento celular, tome ASC en tubos de centrífuga separados de 15 mililitros para sembrar las recesiones 81 y 256 micromoldeadas con hidrogel no adherente.Consulte el manuscrito de texto para obtener detalles del número de celdas utilizadas. Agregue 500 microlitros de solución estéril de agarosa ultra pura al 2% en el centro de un molde de silicona que contenga 81 o 256 huecos circulares. Después de 40 minutos, desmoldar la agarosa ultra pura del molde de silicona y colocarla en un pozo de una placa de plástico de 12 pocillos.Agregue dos mililitros de DMEM-Low en el pozo con la agarosa micromoldeada e incube a 37 grados Celsius con un suministro de dióxido de carbono atmosférico del 5% durante al menos 12 horas antes de sembrar los ASC. Asegúrese de que el flujo laminar esté encendido y que el flujo de aire del gabinete funcione correctamente. Confirme que el equipo está conectado al voltaje correcto y que la tableta está conectada al equipo.Compruebe si la altura del vidrio de protección del gabinete está al mismo nivel que el marcado del sensor del equipo. Presione el botón de encendido o apagado en el lado izquierdo del equipo. Luego, espere a que comiencen la tableta y el equipo.Coloque las cajas de punta, el bastidor para tubos de centrífuga y la placa que contiene el hidrogel de agarosa micromoldeado en el espacio de trabajo del equipo. En el software abierto en la tableta, haga clic en LabWare Editor. Configure una mesa de trabajo virtual y elija las posiciones de las pipetas, las cajas de punta, el bastidor para los tubos de plástico y las placas.Haga clic en el botón "Cambiar a procedimiento" para incluir todos los parámetros y comandos llevados a cabo por el equipo a lo largo del experimento. Espere a que se abra una barra de herramientas y una lista de procedimientos en el software. Inicialmente, para indicar los comandos, incorpore el número de muestras que se van a pipetear y arrástrelo a la lista de procedimientos.Luego, haga clic en el botón de comando "transferencia de reactivos" en el software para transferir la suspensión ASC a los pocillos de la placa de 12 pocillos que contiene los micro moldes y arrástrela a la lista de procedimientos. Haga clic en propiedades"para configurar las posiciones de inicio y fin para que el equipo transfiera la muestra. Espere a que el software vuelva a la página Tabla de trabajo.Configure los parámetros para la siembra automatizada de los ASC como se describe en el manuscrito de texto. Seleccione el agua como el tipo de líquido estándar. Haga clic en el botón "opciones" para configurar los parámetros para crear una suspensión homogénea de los ASC como se describe en el manuscrito de texto.Haga clic en el botón con un símbolo de verificación en la barra superior del software para asegurarse de que no haya ningún error de programación. Haga clic en el botón reproducir en la barra superior del software para iniciar el programa. Deje que el equipo comience según lo programado.Y espera a que emita un sonido que indique que ha terminado. Recoja la placa de 12 pocillos y luego incube a 37 grados Celsius con un suministro de dióxido de carbono atmosférico del 5% durante al menos 18 horas, para permitir la formación completa y compacta de esferoides. Cosechar manualmente los esferoides después de uno, tres y siete días de cultivo para su análisis.Enjuague el medio con una micro pipeta para liberar los esferoides del hidrogel de agarosa no adherente micromoldeado. Recoge los esferoides manualmente con una micro pipeta y transfiérelos a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Se midieron un total de 85 y 160 esferoides a partir de hidrogeles no adhesivos micromoldeados con 81 y 256 recesiones circulares, respectivamente.El sistema automático de pipetas sembró la suspensión de celdas ASC en 12 pocillos de una sola placa de 12 pocillos en 15 minutos. Utilizando el hidrogel no adherente micromoldeado 81, se produjeron 972 esferoides en este estudio. Mientras que el hidrogel no adherente micromoldeado 256 produjo 3072 esferoides.Los esferoides ASC fueron analizados por la homogeneidad de su tamaño y forma. Los esteroides ASC de micromoles con 81 recesiones mostraron un diámetro homogéneo durante el período de cultivo. En contraste con los esteroides ASC de micro moldes con 256 recesiones, la relación de diámetros más pequeño y más grande fue cercana a uno en los esferoides ASC de micro moldes con 81 y 256 recesiones.Los análisis de viabilidad, morfología y fuerza proporcionaron evidencia para la producción exitosa y a gran escala de esferoides ASC. El mayor caso es asegurarse de que el problema se resolvió abruptamente sin errores.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Investigación

Bioingeniería

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Nutriente Reglamento mediante la alimentación continua de expansión a gran escala de células de mamífero en esferoides

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Técnica robótica automatizada de dispensación de Orientación de la superficie de las células y Bioprinting

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Creación de tejido cardiaco que exhibe la integración mecánica de esferoides usando bioprinting 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting de cartílago y piel análogos de tejido utilizando un pasivo novela mezcla de unidad técnica de Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioimpresión directa de esferoides multicelulares de mama 3D en redes endoteliales

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Preparación y caracterización de biotinta de hidrogel biohíbrida 3D basada en grafeno para neuroingeniería periférica

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Formulación y caracterización de un sistema portador de dopamina basado en exosomas

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...