Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Vi tackar National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO, RJ, Brasilien) för användningen av deras anläggningar. Denna studie stöddes delvis av Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support i delstaten Rio de Janeiro (Faperj) (finanskod: E26/202.682/2018 och E-26/010.001771/2019, National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (finanskod: 307460/2019-3) och Office of Naval Research (ONR) (finanskod: N62909-21-1-2091). Detta arbete stöddes delvis av National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

ASC: erna som användes i denna studie isolerades tidigare från friska mänskliga givare och kryokonserverades enligt beskrivningen14 enligt forskningsetiska kommittén vid Clementino Fraga Filho University Hospital, Federal University of Rio de Janeiro, Brasilien (25818719.4.0000.5257). Se materialtabell för detaljer om allt material och utrustning som används i denna studie.
1. Trypsinisering av ASC-monolager vid passage tre
<ol>...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

Detta dokument presenterar den storskaliga genereringen av ASC-sfäroider med hjälp av ett automatiserat pipettsystem. Det kritiska steget i protokollet är att exakt ställa in programvaran för att säkerställa rätt volym cellupphängning, hastighet och avstånd för pipettering. Parametrarna som beskrivs i protokollet bestämdes efter ett antal försök för att optimera doseringen av ASC-cellsuspensionen i brunnarna på 12-brunnsplattor innehållande de mikroformade, icke-vidhäftande hydrogelerna. Optimeringen ut...

Sfäroider anses vara ett ställningsfritt tillvägagångssätt inom vävnadsteknik. ASC kan bilda sfäroider genom självmonteringsprocessen. Sfäroidens 3D-mikroarkitektur ökar den regenerativa potentialen hos ASC, inklusive differentieringskapaciteten i flera linjer 1,2,3. Denna forskargrupp har arbetat med ASC-sfäroider för brosk- och benvävnadsteknik 4,5,6. Ännu viktigare är att sfäroider betraktas som byggstenar i biofabrikationen av vävnader och organ, främst på grund av deras fusionskapacitet.
Användningen av sfäroider för vävnadsbildning beror på tre huvudpunkter: (1) utvecklingen av standardiserade och skalbara robotmetoder för deras biofabricering7, (2) systematisk fenotypning av vävnadssfäroider8, (3) utveckling av metoder för montering av 3D-vävnader9. Dessa sfäroider kan bildas med olika celltyper och erhållas genom olika metoder, inklusive hängande droppe, reaggregering, mikrofluidik och mikromold 8,9,10. Var och en av dessa metoder har fördelar och nackdelar relaterade till sfäroidernas homogenitet och form, återvinning av sfäroiderna efter bildning, antalet producerade sfäroider, processautomatisering, arbetsintensitet och kostnader11.
I mikromoldmetoden dispenseras cellerna och deponeras i botten av mikromolden på grund av tyngdkraften. Den icke-adhesiva hydrogelen tillåter inte cellerna att fästa vid botten, och cell-till-cell-interaktioner leder till bildandet av en enda sfäroid per recession 8,12. Denna biofabriceringsmetod genererar sfäroider av homogen och kontrollerad storlek, kan robotiseras för storskalig produktion på ett tidseffektivt sätt med minimal ansträngning och har goda kostnadseffektivitetskritiska faktorer vid utformningen av en biofabricering av vävnadssfäroid 7,8. Denna metod kan tillämpas för att bilda sfäroider av vilken cellinje som helst för att förbereda en ny vävnadstyp med förutsägbara, optimala och kontrollerbara egenskaper8.
Biofabricering definieras som "automatiserad generering av biologiskt funktionella produkter med strukturell organisation ..."13. Därför anses den automatiserade produktionen av sfäroider vara det första obligatoriska steget för att utveckla en biofabriceringslinje, som fortsätter i 3D-bioprintningsprocessen och avslutas i full mognad av den bioprintade vävnaden genom sfäroidfusion. I denna studie, för att förbättra skalbarheten för ASC-sfäroidbiofabricering, använder vi ett automatiserat pipetteringssystem för att så cellsuspensionen, vilket säkerställer homogeniteten av sfäroidstorlek och form. Detta dokument visar att det var möjligt att producera ett stort antal (tusentals) sfäroider som behövs för 3D-bioprintningsmetoder för att biofabricera mer komplexa vävnadsmodeller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

Fett-härledda stroma/ stamceller (ASC) är en subpopulation av celler som finns i den stromala vaskulära fraktionen av human subkutan fettvävnad som erkänns som en klassisk källa till mesenkymal stromal / stamceller. Många studier har publicerats med ASC för ställningsbaserade vävnadstekniska metoder, som främst utforskade beteendet hos dessa celler efter deras sådd på bioaktiva byggnadsställningar. Ställningsfria metoder växer dock fram för att konstruera vävnader in vitro och in vivo, främst genom att använda sfäroider, för att övervinna begränsningarna i ställningsbaserade tillvägagångssätt.
Sfäroider är 3D-mikrotissuer som bildas av självmonteringsprocessen. De kan bättre efterlikna arkitekturen och mikromiljön hos inhemska vävnader, främst på grund av förstoring av cell-till-cell och cell-till-extracellulära matrisinteraktioner. Nyligen utforskas sfäroider främst som sjukdomsmodeller, läkemedelsscreeningsstudier och byggstenar för 3D-bioprintning. För 3D-bioprintningsmetoder är emellertid många sfäroider, homogena i storlek och form, nödvändiga för att biofabricera komplexa vävnads- och organmodeller. Dessutom, när sfäroider produceras automatiskt, finns det liten chans för mikrobiologisk förorening, vilket ökar metodens reproducerbarhet.
Den storskaliga produktionen av sfäroider anses vara det första obligatoriska steget för att utveckla en biofabriceringslinje, som fortsätter i 3D-bioprintningsprocessen och avslutas i full mognad av vävnadskonstruktionen i bioreaktorer. Antalet studier som undersökte den storskaliga ASC-sfäroidproduktionen är dock fortfarande knapphändigt, tillsammans med antalet studier som använde ASC-sfäroider som byggstenar för 3D-bioprintning. Därför syftar denna artikel till att visa storskalig produktion av ASC-sfäroider med hjälp av en icke-adhesiv mikroformad hydrogelteknik som sprider ASC-sfäroider som byggstenar för 3D-bioprintningsmetoder.

Det automatiska pipettsystemet kan så ASC-cellsuspensionen i 12 brunnar på en 12-brunnsplatta på 15 minuter. Att använda den 81 mikroformade icke-vidhäftande hydrogelen kommer att producera 972 sfäroider i slutet av protokollet. Att använda den 256 mikroformade icke-vidhäftande hydrogelen kommer att producera 3 072 sfäroider i slutet av protokollet. ASC-sfäroider analyserades för homogeniteten av deras storlek och form. ASC-sfäroider från mikromold med 81 recessioner visade homogen diameter under odlingsperi...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Här beskriver vi storskalig produktion av fett-härledda stroma / stamcell (ASC) sfäroider med hjälp av ett automatiserat pipetteringssystem för att så cellsuspensionen, vilket säkerställer homogenitet av sfäroid storlek och form. Dessa ASC-sfäroider kan användas som byggstenar för 3D-bioprintningsmetoder.

Storskalig, automatiserad produktion av fett-härledda stamcellsfäroider för 3D-bioprintning

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Protokollets betydelse är beroende av att minska mänskliga fel och mikrobiologisk kontaminering. Dessutom ansvarig för att producera tusentals sfäroider för 3D-bioprintningsmetoder. Den största fördelen med denna fråga är dock att den har optimerat arbetstiden.Programvaruparametrarna är avgörande eftersom de kan påverka sfäroidernas slutliga kvalitet. Och det bästa rådet skulle vara att utföra tester endast med cellodlingsmedier. Den visuella demonstrationen av denna metod är kritisk eftersom det är en gammal traditionell 3D-cellodlingsmetod baserad på Börja med att skörda stamcellssuspensionen med en 10 ml serologisk pipett och överföra den till ett 50 ml centrifugrör.Centrifugera sedan vid 400 RCF i 5 minuter för att erhålla ASC-pelleten. Resuspend cellpelleten med DMEM-Low innehållande 10% FBS. Efter att ha utfört cellantal, ta ASC i separata 15 ml centrifugrör för att så 81 och 256 recessioner mikroformade med icke-vidhäftande hydrogel.Se textmanuskriptet för detaljer om antalet celler som används. Tillsätt 500 mikroliter steril 2% ultraren agaroslösning i mitten av en silikonform som innehåller 81 eller 256 cirkulära urtag. Efter 40 minuter, avforma den ultrarena agarosen från silikonformen och placera den i en brunn på en 12-brunns plastplatta.Tillsätt två milliliter DMEM-Low i brunnen med den mikroformade agarosen och inkubera vid 37 grader Celsius med 5% atmosfärisk koldioxidtillförsel i minst 12 timmar innan du såddar ASC: erna. Se till att det laminära flödet är på och att skåpets luftflöde fungerar korrekt. Kontrollera att utrustningen är ansluten till rätt spänning och att surfplattan är ansluten till utrustningen.Kontrollera om höjden på skåpskyddsglaset är på samma nivå som sensormärkningen på utrustningen. Tryck på på- eller av-knappen på vänster sida av utrustningen. Vänta sedan tills surfplattan och utrustningen startar.Placera spetslådorna, racket för centrifugrör och plattan som innehåller den mikroformade agaroshydrogelen i utrustningens arbetsyta. I programvaran som öppnas i surfplattan klickar du på LabWare Editor. Ställ in ett virtuellt arbetsbord och välj positionerna för pipetter, spetslådor, stället för plaströren och plattorna.Klicka på knappen växla till procedur"för att inkludera alla parametrar och kommandon som utförs av utrustningen under hela experimentet. Vänta tills ett verktygsfält och en procedurlista öppnas i programvaran. Inledningsvis, för att ange kommandona, införliva antalet prover som ska pipetteras och dra det till procedurlistan.Klicka sedan på kommandoknappen för reagensöverföring på programvaran för att överföra ASC-suspensionen till brunnarna på 12-brunnsplattan som innehåller mikroformarna och dra den till procedurlistan. Klicka på egenskaper"för att ställa in start" och slut"positioner för utrustningen för att överföra provet. Vänta tills programvaran återgår till arbetstabellsidan.Ställ in parametrarna för automatisk sådd av ASC: erna enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Välj vatten som standardvätsketyp. Klicka på alternativknappen för att ställa in parametrarna för att skapa en homogen suspension av ASC: erna som beskrivs i textmanuskriptet.Klicka på knappen med en check"-symbol i programvarans övre fält för att säkerställa att det inte finns något programmeringsfel. Klicka på play"-knappen i det övre fältet i programvaran för att starta programmet. Låt utrustningen börja som programmerad.Och vänta tills det gör ett ljud som indikerar att det är klart. Samla upp 12-brunnsplattan och inkubera den sedan vid 37 grader Celsius med en 5% atmosfärisk koldioxidtillförsel i minst 18 timmar för att möjliggöra fullständig och kompakt sfäroidbildning. Skörda sfäroiderna manuellt efter en, tre och sju dagars kultur för analys.Spola mediet med en mikropipett för att frigöra sfäroiderna från den mikroformade icke-vidhäftande agaroshydrogelen. Samla sfäroiderna manuellt med en mikropipett och överför dem till ett 15 ml centrifugrör. Totalt 85 och 160 sfäroider mättes från mikroformade icke-adhesiva hydrogeler med 81 respektive 256 cirkulära recessioner.Det automatiska pipettsystemet sådde ASC-cellsuspensionen i 12 brunnar av en enda 12-brunnsplatta på 15 minuter. Med hjälp av den 81 mikroformade icke-vidhäftande hydrogelen producerades 972 sfäroider i denna studie. Medan den 256 mikroformade icke-vidhäftande hydrogelen producerade 3072 sfäroider.ASC-sfäroider analyserades för homogeniteten av deras storlek och form. ASC steroider från mikroformar med 81 recessioner visade homogen diameter under odlingsperioden. I motsats till ASC steroider från mikroformar med 256 recessioner, den minsta och största diametrar förhållandet var nära en i ASC sfäroider från mikroformar med 81 och 256 recessioner.Viabiliteten, morfologin och kraftanalyserna gav bevis för framgångsrik, storskalig produktion av ASC-sfäroider. Det mesta fallet är att se till att problemet löstes plötsligt utan fel.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

En enkel droppe cellodling protokoll för generering av 3D spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Närings förordning genom kontinuerlig matning för storskalig utbyggnad av däggdjursceller i sfäroider

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning och storskalig produktion av hög kapacitet Adenovirusvektorer Baserat på den mänskliga adenovirus typ 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning och montering av 3D mikrokärl

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Automatiserad Robotic Doserings Teknik för Surface utvecklings- och Bioprinting av celler

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Skapande av hjärtvävnad som visar mekanisk integration av sfäroider med 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting av brosk och hud vävnad analoger utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik för Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Direkt bioprintning av 3D multicellulära bröstsfäroider till endotelnätverk

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Beredning och karakterisering av grafenbaserat 3D-biohybridhydrogelbiobläck för perifer neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Formulering och karakterisering av ett exosombaserat dopaminbärarsystem

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...