Name: large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Ulusal Metroloji, Kalite ve Teknoloji Enstitüsü'ne (INMETRO, RJ, Brezilya) tesislerinin kullanımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Carlos Chagas Filho Rio de Janeiro Eyaleti Araştırma Destek Vakfı (Faperj) (finans Kodu: E26/202.682/2018 ve E-26/010.001771/2019), Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq) (finans kodu: 307460/2019-3) ve Deniz Araştırmaları Ofisi (ONR) (finans kodu: N62909-21-1-2091) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Rejeneratif Tıp Ulusal Bilim ve Teknoloji Merkezi-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada kullanılan ASC'ler daha önce sağlıklı insan donörlerinden izole edilmiş ve Brezilya Rio de Janeiro Federal Üniversitesi, Clementino Fraga Filho Üniversitesi Hastanesi Araştırma Etik Komitesi'ne göre14'te açıklandığı gibi kriyokorunmuştur (25818719.4.0000.5257). Bu çalışmada kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakınız.
1. Üçüncü pasajda ASC tek katmanının...

<ol>
	<li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment:+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology.">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li><li>Cort&#234;s, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome.">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair.">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li><li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem/stromal+cell+spheroids+for+biofabrication.">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology.">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li><li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly.">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications.">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).</li><li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks.">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication:+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field.">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).</li><li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples.">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing:+from+past+to+future.">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li><li>Doulgkeroglou, M. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation,+monitoring,+and+standardization+of+cell+product+manufacturing.">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids.">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).</li><li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers.">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li><li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters.">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres.">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).</li><li>Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries.">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).</li><li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells.">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li><li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting.">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).</li></ol>

Bu yazıda, otomatik pipet sistemi kullanılarak ASC sferoidlerinin büyük ölçekli üretimi sunulmaktadır. Protokolün kritik adımı, pipetleme için doğru hücre süspansiyonu, hızı ve mesafe hacmini sağlamak için yazılımı hassas bir şekilde ayarlamaktır. Protokolde açıklanan parametreler, ASC hücre süspansiyonunun mikrokalıplanmış, yapışkan olmayan hidrojelleri içeren 12 kuyucuklu plakaların kuyucuklarına dağıtılmasını optimize etmek için bir dizi denemeden sonra belirlenmiştir. Optimi...

Sferoidler, doku mühendisliğinde iskelesiz bir yaklaşım olarak kabul edilir. ASC'ler, kendi kendine montaj işlemi ile sferoidler oluşturabilir. Küreselin 3D mikromimarisi, çoklu soylarafarklılaşma kapasitesi de dahil olmak üzere ASC'lerin rejeneratif potansiyelini arttırır 1,2,3. Bu araştırma grubu, kıkırdak ve kemik dokusu mühendisliği 4,5,6 için ASC sferoidleri ile çalışmaktadır. Daha da önemlisi, sferoidler, esas olarak füzyon kapasiteleri nedeniyle, doku ve organların biyofabrikasyonunda yapı taşları olarak kabul edilir.
Doku oluşumu için sferoidlerin kullanımı üç ana noktaya bağlıdır: (1) biyofabrikasyonları için standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir robotik yöntemlerin geliştirilmesi7, (2) doku sferoidlerinin sistematik fenotiplenmesi8, (3) 3D dokuların montajı için yöntemlerin geliştirilmesi9. Bu sferoidler farklı hücre tipleri ile oluşturulabilir ve asılı damla, yeniden agregasyon, mikroakışkanlar ve mikrokalıplar 8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilebilir. Bu yöntemlerin her birinin, sferoidlerin boyut ve şeklinin homojenliği, sferoidlerin oluştuktan sonra geri kazanımı, üretilen sferoid sayısı, proses otomasyonu, emek yoğunluğu ve maliyetleri ile ilgili avantaj ve dezavantajları vardır11.
Mikrokalıp yönteminde, hücreler yerçekimi nedeniyle mikro kalıbın dibinde dağıtılır ve biriktirilir. Yapışkan olmayan hidrojel, hücrelerin tabana yapışmasına izin vermez ve hücreden hücreye etkileşimler, durgunluk başına tek bir sferoid oluşumuna yol açar 8,12. Bu biyofabrikasyon yöntemi, homojen ve kontrollü boyutta sferoidler üretir, büyük ölçekli üretim için minimum çabayla zaman verimli bir şekilde robotlaştırılabilir ve doku sferoidinin biyofabrikasyonunun tasarımında iyi maliyet etkinliği-kritik faktörlere sahiptir 7,8. Bu yöntem, öngörülebilir, optimal ve kontrol edilebilir özelliklere sahip yeni bir doku tipi hazırlamak için herhangi bir hücre soyunun sferoidlerini oluşturmak için uygulanabilir8.
Biyofabrikasyon, "biyolojik olarak işlevsel ürünlerin yapısal organizasyonla otomatik olarak üretilmesi" olarak tanımlanmaktadır."13. Bu nedenle, sferoidlerin otomatik üretimi, 3D biyobaskı sürecinde devam eden ve sferoid füzyon ile biyobaskılı dokunun tam olgunlaşmasında biten bir biyofabrikasyon hattı geliştirmek için ilk zorunlu adım olarak kabul edilir. Bu çalışmada, ASC sferoid biyofabrikasyonunun ölçeklenebilirliğini artırmak için, hücre süspansiyonunu tohumlamak için otomatik bir pipetleme sistemi kullanıyoruz, böylece küresel boyut ve şeklin homojenliğini sağlıyoruz. Bu makale, daha karmaşık doku modellerini biyofabrikasyona dönüştürmek için 3D biyobaskı yaklaşımları için gerekli olan çok sayıda (binlerce) sferoid üretmenin mümkün olduğunu göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plastic plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpMotion 5070</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5070000282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30015231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z764019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430720U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale, automated production of adipose-derived stem cell spheroids for 3d bioprinting

Adipoz kaynaklı stromal/kök hücreler (ASC'ler), klasik mezenkimal stromal/kök hücre kaynağı olarak kabul edilen insan deri altı yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonunda bulunan hücrelerin bir alt popülasyonudur. İskele tabanlı doku mühendisliği yaklaşımları için ASC'lerle birçok çalışma yayınlanmıştır, bu da esas olarak bu hücrelerin biyoaktif iskelelerde tohumlandıktan sonraki davranışlarını araştırmıştır. Bununla birlikte, iskele tabanlı yaklaşımların sınırlamalarının üstesinden gelmek için in vitro ve in vivo dokuları mühendislik yapmak için, esas olarak sferoidler kullanarak, iskelesiz yaklaşımlar ortaya çıkmaktadır.
Sferoidler, kendi kendine montaj işlemi ile oluşan 3D mikrodokulardır. Doğal dokuların mimarisini ve mikro ortamını, esas olarak hücreden hücreye ve hücreden hücre dışı matris etkileşimlerinin büyütülmesinden dolayı daha iyi taklit edebilirler. Son zamanlarda, sferoidler esas olarak hastalık modelleri, ilaç tarama çalışmaları ve 3D biyobaskı için yapı taşları olarak araştırılmaktadır. Bununla birlikte, 3D biyobaskı yaklaşımları için, karmaşık doku ve organ modellerini biyofabrikasyon yapmak için boyut ve şekil olarak homojen çok sayıda sferoid gereklidir. Ek olarak, sferoidler otomatik olarak üretildiğinde, mikrobiyolojik kontaminasyon için çok az şans vardır ve bu da yöntemin tekrarlanabilirliğini arttırır.
Büyük ölçekli sferoidlerin üretimi, 3D biyobaskı sürecinde devam eden ve biyoreaktörlerdeki doku yapısının tam olgunlaşmasında biten bir biyofabrikasyon hattı geliştirmek için ilk zorunlu adım olarak kabul edilir. Bununla birlikte, büyük ölçekli ASC sferoid üretimini araştıran çalışmaların sayısı, ASC sferoidlerini 3D biyobaskı için yapı taşları olarak kullanan çalışmaların sayısı ile birlikte hala azdır. Bu nedenle, bu makale, ASC sferoidlerini 3D biyobaskı yaklaşımları için yapı taşları olarak yayan yapışkan olmayan mikrokalıplanmış bir hidrojel tekniği kullanılarak ASC sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini göstermeyi amaçlamaktadır.

Otomatik pipet sistemi, ASC hücre süspansiyonunu 15 dakika içinde 12 delikli bir plakanın 12 kuyucuğuna tohumlayabilir. 81 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojelin kullanılması, protokolün sonunda 972 sferoid üretecektir. 256 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojelin kullanılması, protokolün sonunda 3.072 sferoid üretecektir. ASC sferoidleri, boyutlarının ve şekillerinin homojenliği açısından analiz edildi. 81 resesyonlu mikromoldlardan elde edilen ASC sferoidleri, 256 resesyon ile mi...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting at JoVE.com

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Burada, hücre süspansiyonunu tohumlamak için otomatik bir pipetleme sistemi kullanarak adipoz türevli stromal/kök hücre (ASC) sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini açıklıyoruz, böylece küresel boyut ve şeklin homojenliğini sağlıyoruz. Bu ASC sferoidleri, 3D biyobaskı yaklaşımları için yapı taşları olarak kullanılabilir.

3D Biyobaskı için Adipoz Türevi Kök Hücre Sferoidlerinin Büyük Ölçekli, Otomatik Üretimi

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Protokolün önemi, insan hatalarını ve mikrobiyoloji kontaminasyonunu azaltmaya dayanmaktadır. Buna ek olarak, 3D biyobaskı yaklaşımları için binlerce sferoid üretmekten sorumludur. Bununla birlikte, bu konunun en büyük avantajı, çalışma saatlerini optimize etmesidir.Yazılım parametreleri çok önemlidir çünkü sferoidlerin nihai kalitesini etkileyebilirler. Ve en iyi tavsiye, sadece hücre kültürü ortamı ile testler yapmak olacaktır. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü kök hücre süspansiyonunu 10 mililitrelik bir serolojik pipetle hasat ederek ve 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktararak Begin'e dayanan eski bir geleneksel 3D hücre kültürü yöntemidir.Daha sonra, ASC peletini elde etmek için 5 dakika boyunca 400 RCF'de santrifüj yapın. % 10 FBS içeren DMEM-Low kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın. Hücre sayımını gerçekleştirdikten sonra, yapışmaz hidrojel ile mikro kalıplanmış 81 ve 256 durgunluklarını tohumlamak için ASC'leri ayrı 15 mililitrelik santrifüj tüplerine alın.Kullanılan hücre sayısının ayrıntıları için metin el yazmasına bakın. 81 veya 256 dairesel girinti içeren bir silikon kalıbın ortasına 500 mikrolitre steril% 2 ultra saf agaroz çözeltisi ekleyin. 40 dakika sonra, ultra saf agarozu silikon kalıptan çıkarın ve 12 delikli plastik plakanın bir kuyusuna yerleştirin.Mikrokalıplanmış agaroz ile kuyuya iki mililitre DMEM-Low ekleyin ve ASC'leri tohumlamadan önce en az 12 saat boyunca% 5 atmosferik karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Laminer akışın açık olduğundan ve kabinin hava akışının düzgün çalıştığından emin olun. Ekipmanın doğru voltaja bağlı olduğunu ve tabletin ekipmana bağlı olduğunu onaylayın.Kabin koruma camının yüksekliğinin, ekipmanın sensör işaretiyle aynı seviyede olup olmadığını kontrol edin. Ekipmanın sol tarafındaki açma veya kapama düğmesine basın. Ardından, tabletin ve ekipmanın başlamasını bekleyin.Uç kutularını, santrifüj tüpleri için rafı ve mikrokalıplanmış agaroz hidrojelini içeren plakayı ekipmanın çalışma alanına yerleştirin. Tablette açılan yazılımda LabWare Editor'ı (LabWare Düzenleyicisi) tıklatın. Sanal bir çalışma masası kurun ve pipetlerin, uç kutularının, plastik tüplerin rafının ve plakaların konumlarını seçin.Deney boyunca ekipman tarafından gerçekleştirilen tüm parametreleri ve komutları dahil etmek için "prosedüre geç" düğmesine tıklayın. Yazılımda bir araç çubuğunun ve prosedür listesinin açılmasını bekleyin. Başlangıçta, komutları belirtmek için, pipetlenecek örnek sayısını ekleyin ve yordam listesine sürükleyin.Ardından, ASC süspansiyonunu mikro kalıpları içeren 12 delikli plakanın kuyularına aktarmak için yazılımdaki reaktif transferi" komut düğmesine tıklayın ve prosedür listesine sürükleyin. Ekipmanın numuneyi aktarması için "başlangıç" ve bitiş konumlarını ayarlamak üzere özellikler"e tıklayın. Yazılımın Çalışma Masası sayfasına dönmesini bekleyin.ASC'lerin otomatik olarak tohumlanması için parametreleri metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın. Standart sıvı tip olarak suyu seçin. Metin makalesinde açıklandığı gibi ASC'lerin homojen bir süspansiyonunu oluşturmak üzere parametreleri ayarlamak için "seçenekler" düğmesine tıklayın.Programlama hatası olmadığından emin olmak için yazılımın üst çubuğundaki "kontrol" sembolü bulunan düğmeye tıklayın. Programı başlatmak için yazılımın üst çubuğundaki oynat" düğmesine tıklayın. Ekipmanın programlandığı gibi başlamasına izin verin.Ve bittiğini gösteren bir ses çıkarmasını bekleyin. 12 kuyucuklu plakayı toplayın, ardından tam ve kompakt sferoidlerin oluşumuna izin vermek için en az% 5'lik bir atmosferik karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Analiz için bir, üç ve yedi günlük kültürden sonra sferoidleri manuel olarak hasat edin.Sferoidleri mikrokalıplanmış yapışkan olmayan agaroz hidrojelinden serbest bırakmak için ortamı bir mikro pipetle yıkayın. Bir mikro pipet kullanarak sferoidleri manuel olarak toplayın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Sırasıyla 81 ve 256 dairesel durgunluğa sahip mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojellerden toplam 85 ve 160 sferoid ölçülmüştür.Otomatik pipet sistemi, ASC hücre süspansiyonunu 15 dakika içinde tek bir 12 delikli plakanın 12 kuyucuğuna yerleştirdi. 81 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojeli kullanarak, bu çalışmada 972 sferoid üretildi. 256 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojel iken, 3072 sferoid üretti.ASC sferoidleri, boyutlarının ve şekillerinin homojenliği açısından analiz edildi. 81 resesyonlu mikro küflerden ASC steroidleri kültür döneminde homojen çap gösterdi. 256 durgunluğa sahip mikro kalıplardan ASC steroidlerinin aksine, en küçük ve en büyük çap oranı, 81 ve 256 durgunluklu mikro kalıplardan ASC sferoidlerinde bire yakındı.Canlılık, morfoloji ve kuvvet analizleri, ASC sferoidlerinin başarılı, büyük ölçekli üretimi için kanıt sağlamıştır. En çok karşılaşılan durum, sorunun hatasız bir şekilde aniden çözülmesini sağlamaktır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Periferik Nöromühendislik için Grafen Bazlı 3D Biyohibrid Hidrojel Biyomürekkebin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Eksozom Tabanlı Dopamin Taşıyıcı Sistemin Formüle Edilmesi ve Karakterize Edilmesi

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...