Name: development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology
Uploaded: 2022-02-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af bevillinger fra KU Leuven Research Fund og Fund for Scientific Research (FWO) - Flandern. E.L. (11A3320N) og C.N. (1S14218N) støttes af et ph.d.-stipendium fra FWO / FWO-SB.

Dyreforsøg til dette studie blev godkendt af KU Leuven Ethical Committee for Animal Experimentation (P153/2018). Alle mus blev anbragt på universitetets dyreanlæg under standardiserede forhold (konstant temperatur på 23 ± 1,5 ° C, relativ luftfugtighed 40% -60% og en dag / nat cyklus på 12 timer) med adgang til vand og mad ad libitum.
1. Mus
<ol><li>Brug kommercielt tilgængelige musestammer, såsom C57BL/6J-mus, i ung-voksen alder (8-12 uger gamle). Generelt...

<ol>
	<li>Melmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+contains+a+cell+population+displaying+stem/progenitor+cell+and+early-embryonic+characteristics.">The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics.</a> Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+progenitor+cells+tracked+down+by+side+population+dissection.">Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection.</a> Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).</li><li>Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2-expressing+progenitor+cells+generate+all+of+the+major+cell+types+in+the+adult+mouse+pituitary+gland.">SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).</li><li>Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilized+adult+pituitary+stem+cells+contribute+to+endocrine+regeneration+in+response+to+physiological+demand.">Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).</li><li>Andoniadou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem/progenitor+cells+in+the+adult+mouse+pituitary+support+organ+homeostasis+and+have+tumor-inducing+potential.">Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).</li><li>Nys, C., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+disease+and+recovery:+How+are+stem+cells+involved.">Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).</li><li>Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypopituitarism.">Hypopituitarism.</a> Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+shows+stem/progenitor+cell+activation+in+response+to+injury+and+is+capable+of+regeneration.">The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration.</a> Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).</li><li>Willems, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+the+pituitary+after+cell-ablation+injury:+time-related+aspects+and+molecular+analysis.">Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis.</a> Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).</li><li>Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+phenotype+of+the+pituitary+stem/progenitor+cell+compartment+during+the+early-postnatal+maturation+phase+of+the+gland.">Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland.</a> Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).</li><li>Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+pituitary+SOX2++stem+cells+exhibit+a+timed+functional+extinction+in+regulation+of+the+postnatal+gland.">Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).</li><li>Russell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+stem+cells+produce+paracrine+WNT+signals+to+control+the+expansion+of+their+descendant+progenitor+cells.">Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells.</a> eLife. 10 (1), 59142 (2021).</li><li>Vennekens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+is+an+activator+of+pituitary+stem+cells+upon+local+damage,+a+competence+quenched+in+the+aging+gland.">Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).</li><li>Mertens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+tumors+contain+a+side+population+with+tumor+stem+cell-associated+characteristics.">Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics.</a> Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).</li><li>Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+remodeling+throughout+life:+are+resident+stem+cells+involved.">Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved.</a> Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+pituitary+stem/progenitor+cell+clusters+located+in+the+parenchyma+of+the+rat+anterior+lobe.">Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe.</a> Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).</li><li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+pituitary+as+novel+research+model+to+study+pituitary+stem+cell+biology.">Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li><li>Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+basophils+from+immature+male+and+female+rats:+distribution+of+gonadotrophs+and+thyrotrophs+as+studied+by+unit+gravity+sedimentation.">Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation.</a> Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).</li><li>Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+functional+characteristics+of+rat+pituitary+cell+aggregates.">Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates.</a> Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).</li><li>Claes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+monocytes+and+microglia-like+cells+reveal+impaired+amyloid+plaque+clearance+upon+heterozygous+or+homozygous+loss+of+TREM2.">Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2.</a> Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).</li><li>Trompeter, H. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-26a,+miR-26b,+and+miR-29b+accelerate+osteogenic+differentiation+of+unrestricted+somatic+stem+cells+from+human+cord+blood.">MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood.</a> BMC Genomics. 14, 111 (2013).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+functional+adenohypophysis+in+three-dimensional+culture.">Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture.</a> Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).</li><li>Matsumoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+pituitary+hypoplasia+model+demonstrates+hypothalamic+OTX2+regulation+of+pituitary+progenitor+cells.">Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).</li><li>Kanie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+anti-PIT-1+antibody+syndrome:+PIT-1+presentation+by+HLA+class+I+on+anterior+pituitary+cells.">Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells.</a> Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li><li>Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+pituitary+cell+population+control:+basal+cell+turnover+and+the+effects+of+adrenalectomy+and+dexamethasone+treatment.">Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment.</a> Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).</li></ol>

De AL-afledte organoider, som beskrevet her, repræsenterer en stærk forskningsmodel til at studere hypofysestamceller in vitro. På nuværende tidspunkt er denne organoide tilgang det eneste tilgængelige værktøj til pålideligt og robust at dyrke og udvide primære hypofysestamceller. Der er tidligere rapporteret om en hypofyseorganoidmodel afledt af embryonale stamceller (ESC) eller inducerede pluripotente stamceller (iPSC), som nøje rekapitulerer hypofysembryonal organogenese23; ...

Hypofysen er en lille endokrin kirtel placeret i bunden af hjernen, hvor den er forbundet med hypothalamus. Kirtlen integrerer perifere og centrale (hypothalamiske) input for at generere en afstemt og koordineret hormonfrigivelse og derved regulere nedstrøms målendokrine organer (såsom binyrerne og gonuderne) til fremstilling af passende hormoner på det rette tidspunkt. Hypofysen er den vigtigste regulator af det endokrine system og betegnes derfor med rette masterkirtlen1.
Musegravfysen består af tre lapper (figur 1), dvs. den forreste lap (AL), den mellemliggende lap (IL) og den bageste lap (PL). Den vigtigste endokrine AL indeholder fem hormonelle celletyper, herunder somatotroper, der producerer væksthormon (GH); lactotroper, der genererer prolactin (PRL); kortikotroper, der udskiller adrenokortikotropt hormon (ACTH); thyrotroper, der er ansvarlige for skjoldbruskkirtelstimulerende hormon (TSH) produktion; og gonadotroper, der gør luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon (FSH). PL består af aksonale fremskrivninger fra hypothalamus, hvor hormonerne oxytocin og vasopressin (antidiuretisk hormon) opbevares. IL er placeret mellem AL og PL og huser melanotroper, der producerer melanocytstimulerende hormon (MSH). I den menneskelige hypofyse regresserer IL under udvikling, og melanotroper spredes inden for AL1. Ud over de endokrine celler indeholder hypofysen også en pulje af stamceller, der i det væsentlige er præget af transkriptionsfaktoren SOX2 2,3,4,5,6. Disse SOX2+ celler er placeret i marginalzonen (MZ), epitelforingen af kløften (en embryonal rest lumen mellem AL og IL), eller spredes som klynger i hele PARENCHYMA AF AL, hvorved der foreslås to stamcellenicher i kirtlen (figur 1) 2,3,4,5,6.
I betragtning af hypofysens uundværlige karakter er funktionsfejl i kirtlen forbundet med alvorlig sygelighed. Hyperpituitarisme (karakteriseret ved oversekretion af et eller flere hormoner) og hypopituitarisme (defekt eller manglende produktion af et eller flere hormoner) kan være forårsaget af hypofysenuroendokrine tumorer (PitNETs; fx ACTH-producerende tumorer, der fører til Cushings sygdom) eller af genetiske defekter (f.eks. GH-mangel, der resulterer i dværgisme)7. Derudover er hypofysekirurgi (f.eks. for at fjerne tumorer), infektioner (f.eks. hypothalamus-hypofyse tuberkulose eller infektioner efter bakteriel meningitis eller encephalitis), Sheehans syndrom (nekrose på grund af utilstrækkelig blodgennemstrømning på grund af kraftigt blodtab ved fødslen), hypofyseapopleksi og traumatisk hjerneskade andre vigtige årsager til hypofysehypofunktion8 . Det har vist sig, at musegravfysen besidder den regenerative kapacitet og er i stand til at reparere lokal skade indført ved transgen ablation af endokrine celler 9,10. SOX2+ stamcellerne reagerer akut på den påførte skade, der viser en aktiveret fænotype, præget af øget proliferation (hvilket resulterer i stamcelleudvidelse) og øget ekspression af stammerelaterede faktorer og veje (f.eks. WNT / NOTCH). Desuden begynder stamcellerne at udtrykke det ablerede hormon, hvilket til sidst resulterer i en betydelig genopretning af den udtømte cellepopulation i løbet af de følgende (5 til 6) måneder 9,10. Også i kirtlens neonatale modningsfase (de første 3 uger efter fødslen) trives hypofysestamcellerne i aktiveret tilstand 6,11,12,13, mens organismens aldring er forbundet med faldet in situ stamcellefunktionalitet på grund af et stigende inflammatorisk (mikro-) miljø ved aldring (eller 'betænding')10,14 . Derudover er tumorgenese i kirtlen også forbundet med stamcelleaktivering 7,15. Selvom stamcelleaktivering er blevet påvist i flere situationer med hypofyseombygning (gennemgået i 7,16), er de underliggende mekanismer stadig uklare. Da in vivo-tilgange (såsom slægtssporing hos transgene mus) ikke har givet et klart eller omfattende billede af hypofysestamceller, er det afgørende at udvikle pålidelige in vitro-modeller til at udforske stamcellebiologi i normal og syg hypofyse. Standard in vitro-dyrkning af primære hypofysestamceller er fortsat utilstrækkelig på grund af meget begrænset vækstkapacitet og ikke-fysiologiske (2D) tilstande med hurtigt tab af fænotype (for en mere detaljeret oversigt, se16). 3D-kuglekulturer (pituisfærer) er blevet etableret ud fra hypofysestamceller som identificeret ved sidepopulation og SOX2+ fænotype 2,3,4. Pituisfærerne vokser klonalt fra stamcellerne, udtrykker stammemarkører og viser differentieringskapacitet i de endokrine celletyper. De udvides dog ikke væsentligt, mens de kun viser begrænset passagebarhed (2-3 passager)3,4. Kuglelignende strukturer blev også opnået fra ikke-dissocierede hypofysestamcelleklynger, når de dyrkes i 50% fortyndet Matrigel i 1 uge, men udvidelsesmuligheder blev ikke vist17. Pituisfæretilgangen bruges mest som et udlæsningsværktøj til stamcellenumre, men yderligere anvendelser er begrænset af ringere ekspansionskapacitet16.
For at afhjælpe og overvinde disse mangler er der for nylig etableret en ny 3D-model, dvs. organoider, startende fra den store endokrine AL af mus, der indeholder MZ og parenkymale stamceller. Det har vist sig, at organoiderne faktisk stammer fra hypofysens stamceller og trofast rekapitulerer deres fænotype18. Desuden er organoiderne langsigtede udvidelige, samtidig med at de robust opretholder deres stamme natur. Derfor giver de en pålidelig metode til at udvide primære hypofysestamceller til dybtgående udforskning. En sådan udforskning er ikke opnåelig med det begrænsede antal stamceller, der kan isoleres fra en hypofyse, som heller ikke kan udvides under 2D-forhold16. Det har vist sig, at organoiderne er værdifulde og pålidelige værktøjer til at afdække nye hypofysestamcellefunktioner (kan oversættes til in vivo)14,18. Det er vigtigt, at organoidmodellen trofast afspejler hypofysens stamcelleaktiveringsstatus som forekommende under lokal vævsskade og neonatal modning, hvilket viser forbedret dannelseseffektivitet og replikerer opregulerede molekylære veje14,18. Derfor er den hypofyseafledte organoidmodel en innovativ og kraftfuld hypofysestamcellebiologisk forskningsmodel samt et stamcelleaktiveringsudlæsningsværktøj.
Denne protokol beskriver detaljeret etableringen af muse hypofyse-afledte organoider. Til dette formål isoleres AL og dissocieres i enkeltceller, som er indlejret i ekstracellulær matrixefterlignende Matrigel (i det følgende benævnt ECM). Celle-ECM-samlingen dyrkes derefter i et defineret medium, der i det væsentlige indeholder stamcellevækstfaktorer og hypofysembryonale regulatorer (yderligere benævnt »hypofyseorganoidmedium« (PitOM)18; Tabel 1). Når organoiderne er fuldt udviklede (efter 10-14 dage), kan de udvides yderligere gennem sekventiel passaging og udsættes for omfattende nedstrøms udforskning (f.eks. Immunofluorescens, RT-qPCR og bulk- eller enkeltcelletranskriptomik; Figur 1). På længere sigt forventes det, at hypofysestamcelleorganoiderne vil bane vejen for vævsreparationsmetoder og regenerativ medicin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates, TC treated, individually wrapped</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine (cell culture grade)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base moulds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes, Q Path Microtwin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute 99.8+%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10342652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15505739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde for synthesis (PFA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>234-FSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human R-Spondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Murine FGF-8b</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>464-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>102415K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate</td>
			<td>PanReac-AppliChem</td>
			<td>A1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup-GP, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>BDAM303176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12505356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titriplex III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution 2.5 %</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology

Hypofysen er den master endokrine kirtel, der regulerer vigtige fysiologiske processer, herunder kropsvækst, stofskifte, seksuel modning, reproduktion og stressrespons. For mere end et årti siden blev stamceller identificeret i hypofysen. På trods af anvendelsen af transgene in vivo-tilgange forbliver deres fænotype, biologi og rolle imidlertid uklare. For at tackle denne gåde udvikles en ny og innovativ organoid in vitro-model til dybt at optrævle hypofysestamcellebiologi. Organoider repræsenterer 3D-cellestrukturer, der under definerede dyrkningsbetingelser udvikler sig selv fra et vævs (epitel) stamceller og rekapitulerer flere kendetegn for disse stamceller og deres væv. Det er her vist, at muse hypofyse-afledte organoider udvikler sig fra kirtlens stamceller og trofast rekapitulerer deres in vivo fænotypiske og funktionelle egenskaber. De reproducerer blandt andet stamcellernes aktiveringstilstand som in vivo , der forekommer som reaktion på transgent påført lokal skade. Organoiderne kan udvides på lang sigt, samtidig med at de bevarer deres stammefænotype robust. Den nye forskningsmodel er yderst værdifuld til at dechiffrere stamcellernes fænotype og adfærd under nøglebetingelser for hypofyseombygning, lige fra neonatal modning til aldringsrelateret fading og fra sunde til syge kirtler. Her præsenteres en detaljeret protokol for at etablere muse hypofyse-afledte organoider, som giver et kraftfuldt værktøj til at dykke ned i hypofysestamcellernes endnu gådefulde verden.

Efter isolering og dissociation af AL sås de opnåede enkeltceller i ECM og dyrkes i PitOM (figur 1, tabel 1). Figur 3A viser cellekultur og densitet ved såning (dag 0). Nogle små snavs kan være til stede (figur 3A, hvide pilespidser), men vil forsvinde ved passaging. Fjorten dage efter såning er de AL-afledte organoider fuldt udviklede (figur 3A). Organoiderne udviser en cystisk m...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology at JoVE.com

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Hypofysen er den vigtigste regulator af kroppens endokrine system. Denne artikel beskriver udviklingen af organoider fra musegravfysen som en ny 3D in vitro-model til at studere kirtlens stamcellepopulation, hvis biologi og funktion fortsat er dårligt forstået.

Udvikling af organoider fra musegravyse som in vitro-model til at udforske hypofysestamcellebiologi

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

Vores organoidmodel er yderst værdifuld til at udforske hypofysestamcellebiologi i homeostatiske såvel som hypofyseombygningsbetingelser, såsom i neonatal modning af kirtlen, aldringsassocieret funktionel tilbagegang og tumorvækst i kirtlen. Til dato er vores hypofyseorganoidteknik det eneste tilgængelige værktøj til pålideligt og robust at dyrke og udvide primære musepifysestamceller. Forevisning af proceduren vil være Emma Laporte og Charlotte Nys, ph.d.-studerende i min forskningsgruppe.Til at begynde med skal du vaske musehovedet med deioniseret vand for at fjerne blodet. Sprøjt 70% ethanol på hovedet for at generere et sterilt miljø. Fjern derefter huden mellem ørerne ved hjælp af sterile kirurgiske værktøjer.For at åbne kraniet skal du bryde næsebroen med steril saks. Yderligere åbne kraniet startende fra næsebroen mod ørerne på begge sider. Fjern kraniet og hjernen med steril pincet uden at røre hypofysen.Fjern membranen sellae med stump pincet. Derefter adskilles den forreste lap under et stereomikroskop fra de bageste og mellemliggende lobes. Isoler forsigtigt den forreste lap med stump pincet og opsaml den i en 10 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende tre ml medium A.Tilsæt to ml forvarmet 2,5% trypsinopløsning.Inkuber ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Tilsæt to milliliter forvarmet DNAse-opløsning, og hvirvl Erlenmeyer-kolben 10 gange. Lad hypofysen synke til bunden og fjern supernatanten.Tilsæt to milliliter forvarmet trypsinhæmmeropløsning og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Fjern supernatanten, når hypofysen synker til bunden. Tilsæt to milliliter forvarmet medium B og inkuber i fem minutter.Tilsæt to milliliter forvarmet medium C til dette og inkuber i 15 minutter. Lad hypofysen synke til bunden og fjern supernatanten. Skyl det derefter tre gange med forvarmet medium C.Tilsæt to milliliter forvarmet medium C.Aspirate og udvis hypofysen med en steril, flammepoleret Pasteur-pipette flere gange, indtil fragmenter ikke længere er synlige.Overfør suspensionen til et 15 ml rør indeholdende 4,5 ml forvarmet DNAse-opløsning. Kolben skylles tre gange med to ml forvarmet medium C, og suspensionen overføres til røret. Bland den opsamlede cellesuspension og filtrer den gennem en 40 mikron cellesil i et 30 ml rør.Skyl røret og cellesilen tre gange med to milliliter medium C, og overfør suspensionen til røret. Fyld en pasteur pipette af glas med to milliliter BSA. Placer spidsen af pipetten i bunden af røret, og pipetter forsigtigt ud for at danne et synligt densitetslag.Centrifuge ved 190 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten, og genophænd cellepillen i en milliliter iskold avanceret DMEM / F-12. Kvantificer derefter cellerne med en celletæller.Centrifugering af cellesuspensionen ved 190 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. Resuspend cellepillen i avanceret DMEM / F-12 for at nå en celletæthed på 1,1 gange 10 til de 6. celler pr. Milliliter. Tilsæt ECM til det ønskede volumen cellesuspension i et forhold på 30:70 og bland godt.Deponer en 30-mikroliter dråbe af denne blanding i hver brønd af en forvarmet 48-brønds plade. Vend pladen på hovedet, og lad ECM størkne ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Efter inkubationen tilsættes forsigtigt 250 mikroliter forvarmet hypofyseorganoidmedium suppleret med 10-mikromolær ROCK-hæmmer.Hver anden til tre dage skal du ændre mediet uden ROCK-hæmmer i 10 til 14 dage, indtil organoiderne er fuldt udvoksede. For at passere organoiderne skal du først aspirere mediet forsigtigt og tilsætte 400 mikroliter iskold avanceret DMEM / F-12 for at opløse ECM. Saml derefter organoiderne i et mikrocentrifugerør.Vask brønden med 400 mikroliter iskold avanceret DMEM/F-12. Centrifugering af røret ved 200 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten, og tilsæt 400 mikroliter forvarmet TrypLE Express-enzym.Bland ved at vende røret flere gange og inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter. Tilsæt 400 mikroliter iskold avanceret DMEM/F-12. Centrifugering ved 200 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten.Genophæng pillen med 100 mikroliter iskold avanceret DMEM/F-12. Smal en P-200-spids og brug spidsen til at adskille organoiderne ved kraftigt pipettering, indtil der opnås organoidfragmenter. Tilføj 800 mikroliter avanceret DMEM/F-12.Centrifugering ved 190 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. For at passere organoiderne skal pelleten suspenderes igen i et passende volumen avanceret DMEM / F-12 og tilsætte ECM i et forhold på 30:70. Bland godt.Fortsæt med at frø og dyrke organoiderne som beskrevet i tekstmanuskriptet. Dissocierede enkeltceller fra den forreste lap blev podet i ECM og dyrket i hypofyseorganoidmedium. 14 dage efter såning var organoiderne fuldt udviklede og nåede en diameter på op til 500 mikrometer.På dette stadium udviste organoiderne cystisk morfologi med et epitellag, der omslutter et lumen. Det anbefales ikke at bruge de brønde, hvor tætte strukturer vises efter vækst. Til passaging blev organoidfragmenter brugt til såning.Syv dage efter passaging blev gunstig organoid genvækst observeret med cystiske strukturer. Tætte organoider bør kasseres, da de ugunstige organoider kan overtage kulturen. Immunofluorescensfarvningsanalyse for epitelmarkørerne E-cadherin og cytokeratiner 8 og 18 bekræftede organoidernes epitelkarakter.Ekspression af hypofysestamcellemarkører Sox2 og Trop2 demonstrerede stammen, og hypofysespecifik markør LHX3 viste hypofysefænotype af organoiderne. Ekspression af markøren Ki67 viste, at de organoid-konstituerende celler er i en proliferativ tilstand. RTQ PCR-analyse viste højere ekspression af stammemarkører i organoiderne end i den forreste lap, selv efter flere passager, hvilket validerede berigelsen af stamceller.Det er vigtigt at plade det passende antal enkeltceller i ECM-kuplen ved den indledende såning, og når man passerer organoiderne, skal man huske at genfrø fragmenter og ikke enkeltceller.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetisk Konvertering som en sikker og enkel metode til at opnå insulinproducerende celler fra voksne hud fibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektiv Isolering af Functional Islets fra Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Afledning af stamcellelinjer fra mus præimplantations embryoner

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissektion og koronale skive forberedelse for at udvikle mus hypofysen

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation af stillads-fri, tre-dimensionelle Insulin udtrykker Pancreatoids fra mus i bugspytkirtlen stamfaderen In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse af hjerte kammer udvikling under musen embryogenese bruger hele bjerget epifluorescensmikroskop

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering af oxidative skader i den primære mus okulære overfladeceller / stamceller som reaktion på Ultraviolet-C (UV-C) Skader

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

En statisk selvstyret metode til generering af hjerneorganoider fra menneskelige embryonale stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Forberedelse af små RNA-biblioteker til sekventering fra tidlige museembryoner

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...